Спосіб виготовлення туберкуліну

Спосіб виготовлення туберкуліну, що включає культивування збудника туберкульозу М. bovis на 3 30988 на установці УПВ-6 [Тимонин А.С. Основы конструирования и расчета Химикотехнологического и природоохранного оборудования: Справочник / Московский государственный университет инженерной экологии. – Калуга: изд-во Н.Бочкаревой, 2002. – т.2. – 1028с.] з використанням порожнистих волокон 15кДа, осадження протеїну діалізом та стерилізацією готового продукту на установці Sartorius [Биотехнология: Учебник / И.В. Ти хонов, Е.А. Рубан, Т.Н. Грязиева и др., под ред. Акад. РАС ХН Е.С.Воронина. – СПб.: ГИОРД, 2005. – 792с.], що дозволяє отримати біологічно активний, не реактогенний туберкулін, який не володіє сенсибілізуючими властивостями, що відповідає критерію «Новизна». Спосіб виконується таким чином: Збудник туберкульозу М.bovis штам ІЕКВМ-1, М.bo vis штам №4, М.bovis штам Vallee культивують на синтетичному живильному середовищі протягом 56-60 діб при температурі 37,5-38°С. Після цього культуру автоклавують при температурі 120°С протягом 1 години. Бактеріальну масу відокремлюють від культурального фільтрату через фільтр-полотно. Одержаний таким чином культуральний фільтрат центрифугують, а потім отриманий центрифугат концентрують до 1:10 попереднього об'єму на установці УПВ-6 з порожнистими волокнами 15кДа та доводять рН до 4,5-4,7. В концентрат додають 50% розчин трихлороцтової кислоти до кінцевої концентрації в культуральному фільтраті 6% і витримують при +4°С протягом 12 годин. Після цього надосадову рідину зливають, а осад розчиняють стерильною дистильованою водою 1:10 при рН розчину білка 7,0-8,0. Розчин білка переосаджують рівним об'ємом насиченого розчину сульфату амонію при рН 7,0 і витримують 12 годин при температурі +4°С. Надосадову рідину зливають, а осад центрифугують при 3000об/хв. протягом 20 хвилин. Потім осад розчиняють у дистильованій воді у співвідношенні 1:5-1:7, після чого проводять його знесолювання проти дистильованої води. Одержаний концентрат розчину туберкуліну розводять розчином хлористого натрію, що вміщує гліцерин і фенол до вмісту в 1см 3 розчину туберкуліну 1мг білка, 0,85% хлористого натрію, 10% гліцерину, 0,3% фенолу. Виготовлений таким чином стандартний розчин туберкуліну стерилізують на установці Sartorius і в асептичних умовах розливають у стерильні флакони ємністю 10-20см 3. Виготовлений туберкулін перевіряють на активність, сенсибілізуючи властивості з референтною серією (прототип) ППД-туберкуліну для ссавців згідно ГОСТ 16739-88, видову специфічність згідно ТУУ10-19-516-87 Алерген сухий очищений із атипових мікобактерій (КАМ). Приклад 1. При перевірці на морських свинках сенсибілізованих живою культурою БЦЖ встановлено, що активність у виготовленого туберкуліну становить 50000ТО/см 3, що відповідає вимогам ГОСТ. Приклад 2. При визначенні видової 4 специфічності одержаного туберкуліну в порівнянні з еталонною серією туберкуліну ППД для ссавців (Курська біофабрика) на морських свинках, сенсибілізованих сумішшю живих культур атипових мікобактерій видів М.scrofulaceum, М.intracellulare встановлена більш виражена видова специфічність на виготовлений туберкулін, ніж на туберкулін Курської біофабрики (прототип). При цьому кількість морських свинок, реагуючих на виготовлений туберкулін становить 6 голів, тоді як на туберкулін (прототип) для ссавців реагувало всі 10 голів. При цьому необхідно відмітити, що інтенсивність внутрішньошкірних реакцій на виготовлений туберкулін у реагуючи х морських свинок була менше, ніж на прототип. Приклад 3. При триразовому внутрішньошкірному введенні здоровим морським свинкам випробуваного туберкуліну з інтервалом 5 діб та через 15 діб після останньої ін'єкції туберкуліну в дозі 500ТО препарату в об'ємі 0,1см 3 в жодному випадку не було виявлено реагуючих тварин. Результати дослідів свідчать про те, що виготовлений за запропонованою технологічною схемою туберкулін є активним (50000ТО), більш видоспецифічним і не володіє сенсибілізуючими властивостями та може застосовуватись для алергічної діагностики туберкульозу у сільськогосподарських тварин (див. Таблицю). Активність туберкуліну Група Кількість Сенсибілізованих тварин тварин мікобактеріями виготовлений I 10 II 10 III 5 БЦЖ Атипові мікобактерії Здорові тварини прототип 50000ТО/мл 50000ТО/мл «-» - дослідження не проводились Р Сп ту вигот лен 10 6