Спосіб підвищення процесу азотфіксації та продуктивності сільськогосподарських культур

1.Способ повышения процесса азотфиксации и продуктивности сельскохозяйственных культур путем использования ассоциативных и ризобиальных штаммов азотфиксирующих микроорганизмов, отличающийся тем, что дополнительно используют регуляторы роста растений. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что дополнительно используют углеаммонийные соли. 3.Способ по любому из пп. 1,2, отличающийся тем, что обработке подвергают семена и/ или опрыскивают вегетирующие растения регуляторами роста растений. Зоя (13) 39199 (11) UA как природные фитогормоны для активизации различных физиологических процессов (1,2). Литературных данных об использовании РРР для усиления процессов фиксации молекулярного азота атмосферы, за исключением вышеописанных соединений индивидуально или в сочетании с ризобной или ассоциативной микрофлорой – нет. Использование РРР для повышения процессов фиксации азота атмосферы в сочетании с углеаммонийными солями (бикарбонатом аммония) описаны в наших заявках на получение патентов Украины (3,4). В практике сельского хозяйства широко используется способ повышения процесса азотфиксации молекулярного азота из воздуха за счет инокуляции семян различных культур высокоактивными бактериями (5–7). Этот способ нами выбран в качестве прототипа. Недостатком данного способа является то, что для биологических препаратов необходимы особые условия хранения, а также ограничения во времени (от отработки семян до посева) и способе применения (обработка только семян). Помимо этих недостатков существующего способа, использование его на злаковых травах, выращиваемых, в основном, в смеси, инокуляция штаммами становится малоэффективной из-за от (19) Изобретение относится к области сельского хозяйства, а именно к использованию биологически активных веществ – регуляторов роста растений (РРР), в том числе производных пиридина, индола, пурина и других при выращивании сельскохозяйственных культур. Указанные РРР обладают ауксиновой, цитокининовой активностью и способны активизировать (усиливать) процессы фиксации молекулярного азота атмосферы микроорганизмами-азотфиксаторами, повышать продуктивность сельскохозяйственных культур и эффективность использования удобрений. Некоторые производные пиридина описаны нами в ранее поданных заявках на получение патентов, в том числе: акво N-окись 2-метилпиридинмарганец (II) хлорид (Патент РФ 2027719), обладающий цитокининовой и ауксиновой активностью, свойством регулятора роста растений (РРР), повышающий продуктивность яровой пшеницы, моногидрат комплекса хлорида кобальта с N-окисью -2 метилпиридина и соль ди-(N-окиси 2,6 диметилпиридина) и янтарной кислоты, используются как средства для усиления эффективности симбиотической азотфиксации материалы заявок № 5067133/04 от 18.09.92 и № 5050140/04 от 30.06.92; b-индолилуксусная и b-индолилмасляная кислоты используются в сельском хозяйстве C2 _______________________ 39199 сутствия специфичности бактериальных препаратов по отношению к различным растениям. Предлагаемый способ использования РРР для активизации процессов фиксации молекулярного азота атмосферы микроорганизмами имеет ряд преимуществ перед прототипом: – заявляемые препараты не требуют особых условий хранения и устойчивы более 2 лет; – семена, обработанные РРР, в отличие от биологических препаратов (ризоторфин, ризоэнтерин) могут храниться без изменения активности более года; – препараты можно использовать не только для обработки семян, но и при вегетации в определенные фазы развития растений. Задача данного изобретения – разработка и применение более дешевых, доступных и экологически безвредных для человека и окружающей среды соединений и приемов их использования, способных существенно повышать эффективность фиксации азота атмосферы микроорганизмами и урожай сельскохозяйственных культур. Поставленная задача достигается за счет изыскания перспективных препаратов и приемов для их использования. Для лучшего понимания описания материалов заявки приводятся конкретные примеры выполнения задания. Пример 1. Влияние препаратов на продуктивность ячменя при обработке семян. Место проведения опыта – колхоз "Россия", Красногвардейского района, Республика Крым. Опыт полевой, объект исследования – ячмень яровой, сорт Одесский 100". Почва – чернозем южный, среднесуглинистый, с общим содержанием азота 0,3–0,39%. Методика проведения опыта. Предпосевную обработку семян проводили как индивидуальными препаратами, так и в сочетании с биологическим препаратом – ризоэнтерином методом полусухого протравливания из расчета 20–30 л рабочего раствора на 1 тонну семян. Площадь делянок 8 м2, повторность четырехкратная. В контрольном варианте семена обрабатывали водой. Результаты исследований и схема опытов представлены в табл.1. Анализируя результаты исследований (табл.1) можно заключить, что все способы обработки семян I–V повышают продуктивность ячменя, относительно контроля, за счет увеличения коэффициента кустистости растений, количества колосков в колосе и крупности зерен. Наилучшие результаты по этим показателям приходятся на способы IV–V совместного использования биологического препарата – ризоэнтерина с N-окисью 2,6 диметилпиридина и акво N-окисью 2-метилпиридинмарганец (II) хлоридом. Так урожай ячменя при использовании способов IV и V, относительно контроля увеличился на 19,7 и 27%, а относительно эталона – на 3,7 и 10% соответственно. Пример 2. Влияние (производных пиридина) на продуктивность сои. Место проведения опыта – колхоз "Россия" Красногвардейского района республики Крым. Опыт полевой, объект исследования – соя, сорт Южанка. Почва – чернозем южный, среднесуглинистый, с общим содержанием азота 0,3–0,39%. Методика проведения опыта. Предпосевную обработку семян сои проводили как индивидуальными препаратами так и в сочетании с биологическим препаратом – ризоторфином (штамм М–8) методом полусухого протравливания из расчета 10–20 л рабочего раствора на 1 т семян. Площадь делянок 8 м2, повторность четырехкратная. В контрольном варианте семена обрабатывали водой. Результаты исследований и схема опытов представлены в табл. 2. Анализ результатов опытов по урожайности сои указывает на то, что исследование химических препаратов, производных пиридина, по способу I и II не уступает эталону, в то время как использование этих препаратов совместно с эталоном (способы IV и V) позволило повысить урожай сои, относительно контроля, на 13,9 и 22,8%, а относительно эталона на 5,8 и 14,1%. Максимальный урожай сформирован при обработке семян сои по способу V и IV по той причине, что соединение N-окись 2,6-диметилпиридина и, в особенности ди-(N-окись 2-метилпиридин) цинк (II) хлорид проявили стимулирующее действие не только на макросимбионт (растение), но и на активность бобово-ризобиального симбиоза в целом. По количеству и массе клубеньков, нитрогепазной активности азотфиксирующих бактерий в случае применения способа V превосходил контроль на 88,4%, а эталон на 25%. Пример 3. Изучение влияния РРР (индивидуально и в сочетании с аммиачной селитрой и углеаммонийными солями на повышение фиксации молекулярного азота атмосферы микроорганизмами (табл. 3, 4, 5, 6 и 7). Исследования проводились на райграсе пастбищном с. Вея, тимофеевке луговой с. Вик-5, костреце безостом с. Казаровичский, овсянице луговой с. Дотнувcкая 1 и люцерне в условиях вегетационных и полевых опытов. Вегетационные опыты проводили в условиях песчаной культуры (промытый и прокаленный до 800оС речной песок) и почвенной культуры (почва дерновоподзолистая супесчаная, рН–6,55, содержание гумуса 0,8–1,0%) в сосудах объемом 400 мл и 2000 мл. В субстрат вносили смесь Прянишникова с 0,5 дозы азота. Опыты проводили в люминостате при освещении 20000 лк со световым периодом 16 часов и температуре 26оС±2оС. Повторность опытов – пятикратная. Полевые опыты проводили на дерновоподзолистой почве опытного хозяйства Института сельскохозяйственной микробиологии (характеристика почвы приведена выше) по фону N40Р60К60. Площадь делянок 21 м2, повторность – четырехкратная. Для предпосевной бактеризации применяли штаммы азотфиксирующих микроорганизмов, вступающие в активные ассоциации с корнями растений: райграса – Azospirillum lipoferum, штамм В– 36; тимофеевке луговой – Bacilus subtilis, шт. Т–62; костреца безостого – Azospirillum brаsilense, шт. В–37. Численность клеток бактерий на семенах 2 39199 после инокуляции составляла около 200 тыс. на одно семя. В опытах на азотфиксирующую активность изучали следующие концентрации: для кинетина, b-индолилуксусной кислоты – 10-5 г/л, b-индолилмасляной кислоты – 10-6 г/л; моногидрата комплекса хлорида кобальта с N-окисью 2-метилпиридина, акво-N-окиси 2-метилпиридин-марганец (II) хлорида, ди-(N-окиси 2-метилпиридин) цинк (II) хлорида – 10-5 г/л. Обработку семян соответствующими регуляторами роста растений проводили путем замачивания семян (время экспозиции 12 часов). Обработку фитомассы трав растворами соответствующих препаратов проводили из ручного опрыскивателя: в полевых опытах после отрастания травостоя на высоту 15–20 см, перед 1, 2 и 3 укосами, а в вегетационных опытах – через 20 дней от начала выращивания растений.Азотфиксирующую активность определяли ацетиленовым методом в почвенно-растительных монолитах (8): в вегетационных опытах через 36 дней выращивания растений; в полевых опытах – динамика – 3 раза за вегетационный период укосами зеленой массы трав. Редукцию ацетилена в образцах измеряли на газовом хроматографе. "Chroom – 4" c плазменно-ионизационным детектором. Учет численности азотфиксирующих микроорганизмов проводили методом предельных разведений с использованием ацетиленового теста (9) на полужидких средах Доберайнера, Эшби и жидкой среде Федорова–Калининской. Количество нитратов в зеленой массе трав определяли с помощью ионселективного электрода (10). Анализ результатов исследований табл. 3–5 свидетельствует о том, что ряд соединений, обладающие ауксиновой или цитокининовой активностью, усиливают ассоциативную азотфиксацию на различных травах, выращенных как на песке, так и на почвенной культуре. Природные фитогормоны и синтетические препараты по своей азотфиксирующей активности не уступают эталону – инокуляции семян активными штаммами азотфиксирующих микроорганизмов. К примеру, величина азотфиксации от использования кинетина выше на райграсе и тимофеевке относительно контролю в 4,7 и 2,98 раза, относительно эталона на 65,1 и 50,4 % (табл.3). Применение акво N-окиси 2-метилпиридинмарганец (II) хлорида, позволило повысить азотфиксацию на этих же культурах в сравнении с контролем в 7,6 и 13 раз, относительно эталона на 51 и 45,6%. Данные опытов (табл. 6) указывают на то, что использование химических препаратов по способу I и II позволяет, в сравнении с контролем, увеличить азотфиксацию в 6,8 и 2,3 раза, урожай травостоя на 3,7 и 18,1%, содержание нитратов в этой продукции понизить на 4,8 и 28,3% соответственно. Использование заявляемых соединений на люцерне (табл. 7) существенно повышает процесс азотфиксации как при обработке семян, так и фитомассы за счет значительного увеличения нарастания клубеньков (ризобий). Так применение ди-(N-окиси 2-метилпиридин) цинк (II) хлорида при обработке семян люцерны и по вегетации позволяет повысить азотфиксирующую активность и количество клубеньков в сравнении с контролем соответственно в 2,1 и 1,8 раза и 2,4 и 2,9 раз. Аналогичная закономерность получена также на райграсе, где четко проявляется корреляция между увеличением численности основных групп диазотрофов в зоне корней и нарастанием биомассы корней и надземной массы растения (табл. 8). Использование акво N-окиси 2-метилпиридинмарганец (II) хлорида при выращивании райграса на различных средах позволило увеличить массу корней и надземной части растений в сравнении с контролем на 42,6 и 37,5% при одновременном нарастании численности диазотрофов на корнях в сравнении с контролем в 5,2 раза (среда Доберейнера); 4,2 раза (среда Эшби); 8,3 раза (среда Федорова–Калининской). В табл. 9 представлены результаты исследований о влиянии азотфиксирующей активности и продуктивности травостоя при использовании азотных удобрений и химических препаратов. Анализ результатов этих исследований позволяет судить о том, что азотфиксирующая активность и урожай травостоя увеличивается относительно абсолютного контроля (без внесения удобрений) при использовании аммиачной селитры и углеаммонийных солей на 64 и 24% в 15 раз и 34%. Использование моногидрата комплекса хлорида кобальта с N-окисью 2-метилпиридина позволяет увеличить соответствующие показатели на фоне: – без удобрений на 5 и 22%; – N40 (аммиачная селитра) в 12,1 раза и на 28%; – N40 (углеаммонийные соли) в 23,6 раза на 42%. Значительное повышение продуктивности сельскохозяйственных культур и усиление азотфиксации можно объяснить следующим образом. Известно, что соединение, обладающие ауксиновой или цитокининовой активностью, существенно усиливают рост и развитие корневой и надземной массы растений (2), усиливают процесс фотосинтеза (11). Эти факторы, а также уменьшение накопления нитратов в растительных тканях (табл. 6) свидетельствует о том, что помимо непосредственного фактора – увеличения количества ассоциативных диазотрофов и ризобий (табл. 7) идет, по-видимому, опосредованная активация деятельности этих микроорганизмов за счет уменьшения содержания азота в прикорневой зоне растений, подвергшихся воздействию биологически активных веществ. Представленные примеры свидетельствуют о целесообразности использования РРР для стимулирования процессов фиксации азота атмосферы микроорганизмами – азотфиксаторами. Использование их может осуществляться индивидуально в сочетании с биологическими препаратами и (или) с различными азотными удобрениями. Литература 1. Мельников Н.Н. и др. Справочник по пестицидам. – Изд-во Химия, 1985, с. 21, 36. 3 39199 2. Калинин Ф.Л. Биологически активные вещества в растениеводстве. – К.: Наукова думка, 1984, с. 38. 3. Вилесов Г.И., Дульнев П.Г., Волкогон В.В., Мальцева Н.Н. и др. ВИДЕКСы – средства, способствующие азотфиксации растений // Заявка на Патент Украины № 95052569, 29.05.95. 4. Вилесов Г.И., Дульнев П.Г., Волкогон В.В., Мальцева Н.Н. и др. Способ повышения азотфиксации // Заявка на Патент Украины № 95020714, 17.02.95. 5. Толкачев Н.З. и др. Физиология и биохимия культурных растений, 1994, т. 26, № 4, с. 344. 6. Патыка В.Ф. Микроорганизмы в сельском хозяйстве // Тез. докл. Республ. конференции 23– 30 июня 1988, Кишинев, с. 99. 7. Паников П.С. Проблемы азота в интенсивном земледелии // Тез. докл. Всесоюзн. совещания 23–28 июля 1990, Новосибирск. 8. Волкогон В.В. Микробиол. журнал I, 1984, т. 46, № 2, с. 89. 9. Калининская Т.А. и др. Применение ацетиленового метода для количественного учета разных групп азотфиксаторов методом предельных разведений // Микробиология, 1981, т. 50, № 5, с. 924. 10. Ягодин Б.А. Практикум по агрохимии. Агропромиздат, 1987, с. 512. 11. Бабаджанов М.А. Результаты роста и развития растений. – М.: Наука, 1981. Таблица 1 Влияние производных пиридина и их композиций с биологическим препаратом ризоэнтерином на продуктивность ячменя (при обработке семян) Способ обработки Норма Высота Коэфрасхо- расте- фицида, г/т ний, см ент кустистости Препараты Контроль Эталон – ризоэнтерин N-окись 2,6 диметилпиридина Акво N-окись 2-метилпиридинмарганец (II) хлорид N-окись 2,6-диметилпиридина + ризоэнтерин Акво N-окись 2-метилпиридинмарганец (II) хлорид + ризоэнтерин НСР05 ц/га I II III IV V Количество колосков в колосе шт %к контролю 100 115 Масса 1000 зерен, Уро- Прибавка к жай, контролю ц/га ц/га % % к контролю г 35,8 39,2 100 109,5 30,4 35,1 – – 4,7 15,5 22,8 107,5 36,2 101,1 32,4 2,0 3,2 23,3 109,9 40,2 112,2 34,8 5,4 14,5 76 3,9 24,9 117,4 39,6 110,6 36,4 6,0 19,7 76 3,7 29,6 139,6 40,6 114,2 35,9 2,5 5,5 18,1 73 76 2,8 3,9 21,2 24,4 3,0 77 3,7 3,0 76 3,0 3,0 6,5 Таблица 2 Влияние производных пиридина и их композиций с биологическим препаратом ризоторфином на продуктивность сои (при обработке семян) Способ обработки I II III IV V Препараты Концентрация, мг/л Контроль Эталон – ризоторфин N-окись 2,6 диметилпиридина Ди- /N-окись 2-метилпиридин/ цинк (II) хлорид Ризоторфин +N-окись 2,6-диметилпиридина Ризоторфин + ди-/N-окись 2-метилпиридин/ /цинк(II) хлорид 4 Урожай, ц/га Прибавка к контролю ц/га % – 5,0 5,0 5,0 31,5 33,9 33,6 34,1 35,9 – 2,4 2,1 2,6 4,4 – 7,6 6,6 8,2 13,9 5,0 38,7 7,2 24,4 39199 Таблица 3 Влияние биологически активных препаратов на азотфиксирующую активность в корневой зоне различных трав (вегетационный опыт, почвенная культура) Способ обработки Активность азотфиксации, мкг N2/сосуд/час Райграс паст- Тимофеевка Овсянница бищный луговая луговая Препараты 0,030 0,086 0,084 0,129 0,140 0,03 Контроль Инокуляция b-индолилуксусная кислота b-индолилмасляная кислота Кинетин НСР05 I II III IV 0,054 0,107 0,110 0,054 0,161 0,019 0,040 – 0,061 0,654 0,140 0,017 Таблица 4 Влияние биологически активных препаратов на азотфиксирующую активность в корневой зоне различных растений (песчаная культура) Способ обработки Активность азотфиксации, мкг N2/сосуд/час Райграс пастбищ- Тимофеевка луный говая Препараты Контроль Инокуляция Ди-/N-окись 2-метилпиридин/цинк (II) хлорид Моногидрат комплекса хлорида кобальта с Nокисью 2-метилпиридина Акво N-окись 2-метилпиридинмарганец (II) хлорид НСР05 I II III IV 0,059 0,151 0,135 0,070 0,250 0,105 0,246 0,324 0,090 0,278 0,260 0,081 Таблица 5 Влияние биологически активных препаратов на азотфиксирующую активность в зоне корней злаковых трав (почвенная культура) Способ обработки Препараты Активность азотфиксации, мкг N2/сосуд/час Райграс паст- Тимофеевка Кострец Овсянница бищный луговая безостый луговая Контроль Инокуляция Ди-/N-окись 2-метилпиридин/цинк (II) хлорид Моногидрат комплекса хлорида кобальта с N-окисью 2-метилпиридина Акво N-окись 2-метилпиридинмарганец (II) хлорид НСР05 I II III IV 0,040 0,202 0,028 0,250 0,052 0,233 0,046 – 0,075 0,184 0,021 0,081 0,271 0,312 0,215 0,370 0,305 0,075 0,364 0,084 0,239 0,058 0,355 0,090 Таблица 6 Влияние биологически активных препаратов на продуктивность травостоя, содержание нитратов и азотфиксирующую активность в зоне корней Способ обработки I II Препараты Урожай, ц/га Содержание нитратов, мг/кг Азотфиксирующая активность, мкг/N2/м.кв./ /час - среднее за вегетационный период Контроль Моногидрат комплекса хлорида кобальта с Nокисью 2-метилпиридина Акво N-окись 2-метилпиридинмарганец (II) хлоpид НСР05 212,6 584 332,8 220,6 251,2 20,5 556 419 2290,9 778,1 5 39199 Таблица 7 Влияние биологически активных препаратов на формирование клубеньков и азотфиксирующую активность в корневой зоне люцерны посевной (опыт вегетационный) Способ обработки Препараты Количество клубеньков, единиц/сосуд, % к контролю Контроль 59 Инокуляция (Rhizobium meliloti – шт. 425а) 109 Предпосевная обработка семян Ди-/N-окись 2-метилпиридин/ цинк 141 (IІ)хлорид Акво N-окись 2-метилпиридинмарганец (II) хлорид 109 Обработка фитомассы Ди-/N-окись 2-метилпиридин/ цинк (II) хлорид 174 Моногидрат комплекса хлорида кобальта с N-окисью 2-метилпиридина 150 Акво N-окись 2-метилпиридинмарганец (II) хлорид 92 НСР05 31 I II III IV V VІ Азотфиксирующая активность, мкг/N2/cосуд/час, % к контролю 100 0,084 100 184 0,167 198 238 0,175 208 184 0,168 200 294 0,157 186 254 0,171 203 155 0,126 4,2 150 Таблица 8 Влияние препаратов на биологический уровень райграса пастбищного и численность основных групп диазотрофов в зоне корней Способ обработки Препараты Урожай, г/сосуд Численность диазотрофов на корнях, тыс/г сухого вещества Среда ДоСреда Эшби Среда Фебейрейнера дороваКалининской надземная масса Контроль Моногидрат комплекса хлорида кобальта с N-окисью 2-метилпиридина Акво N-окись 2-метилпиридинмарганец (II) хлорид НСР05 I II корни 1,04 0,89 950,0 262,0 245,0 1,5 1,13 5400,0 1050,0 2200,0 1,43 0,25 1,27 0,19 4950,0 1100,0 2050,0 Таблица 9 Влияние биологически активных препаратов на азотфиксирующую активность и продуктивность травостоя с одновременным использованием аммиачной селитры и углеаммонийных солей Способ обработки Препараты ц/га I II III IV V Урожай, % к контрою N0 (без внесения удобрений) Контроль 171,7 Моногидрат комплекса хлорида кобальта с N-окисью 2-ме209,2 тилпиридина Акво N-окись 2-метилпири202,2 динмарганец (II) хлорид N40 (внесение аммиачной селитры) Аммиачная селитра 212,6 Моногидрат комплекса хлорида кобальта с N-окисью 2-ме220,6 тилпиридина Акво N-окись 2-метилпири251,2 динмарганец (II) хлорид 6 Азотфиксирующая активность, мкг/N2/час (среднее за вегетационный период), % к контрою 100 182,9 100 122 192,0 105 118 178,3 97 124 300,9 164 128 2227,4 в 12,1 раз 146 221,5 121 39199 Продолжение табл. 9 Способ обработки Препараты ц/га VI VII VIII Урожай, % к контрою Азотфиксирующая активность, кг/N2/час (среднее за вегетационный период), % к контрою N40 (внесение углеаммонийных солей) 2810,3 134 Углеаммонийные соли 230,5 Моногидрат комплекса хлорида кобальта с N-окисью 24325,0 142 243,3 метилпиридина Акво N-окись 2-метилпири3337,2 147 252,1 динмарганец (II) хлорид HCP05 40,9 – в целом по опыту в том числе: 20,5 – для удобрений 20,5 – для препаратов Тираж 50 екз. Відкрите акціонерне товариство «Патент» Україна, 88000, м. Ужгород, вул. Гагаріна, 101 (03122) 3 – 72 – 89 (03122) 2 – 57 – 03 7 в 15,3 раз в 23,6 раз в 18,2 раз