Спосіб діагностики анаплазмозної інфекції шляхом визначення рівня (титру) протианаплазмозних антитіл в реакції непрямої імунофлюоресценції (рніф)

Спосіб діагностики анаплазмозної інфекції шляхом визначення рівня (титру) протианаплазмозних антитіл в реакції непрямої імунофлюоресценції (РНІФ), який відрізняється тим, що як діагностичний препарат анаплазмозного антигену (Анг) при відтворенні РНІФ застосовують повний корпускулярний антиген штаму Anaplasma marginale ВИЭВ1. (19) (21) u201005597 (22) 11.05.2010 (24) 11.10.2010 (46) 11.10.2010, Бюл.№ 19, 2010 р. (72) ПОХИЛ СЕРГІЙ ІВАНОВИЧ, ТИМЧЕНКО ОЛЕНА МИКОЛАЇВНА, ЧИГИРИНСЬКА НІЛА АНАТОЛІЇВНА, КИЛИПКО ЛЮДМИЛА ВІТАЛІЇВНА, СЕМЕРЕНСЬКА ЄВГЕНІЯ ІВАНІВНА, КОСТИРЯ ІРИНА АНАТОЛІЇВНА, КРУГЛОВА ТЕТЯНА АНАТОЛІЇВНА (73) ДЕРЖАВНА УСТАНОВА "ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ ТА ІМУНОЛОГІЇ ІМ. І.І. МЕЧНИКОВА АМН УКРАЇНИ", ПОХИЛ СЕРГІЙ ІВАНОВИЧ, ТИМ 3 інфекційного процесу супроводжується формуванням специфічного (протианаплазмозного) імунітету в зараженому організмі. Перші протианаплазмозні антитіла вдається виявити на 4-7-му добу після початку прояву захворювання. Впродовж послідуючих 2-3-ох тижнів їх рівень стрімко зростає, досягає максимуму на 4-му тижні та зберігається до 6-го тижня, а потім поступово знижується. Після перенесеного захворювання невисокий (анамнестичний) рівень протианаплазмозних антитіл може зберігатись більше року [5-7]. Кількісні і якісні характеристики відповіді гуморальної ланки імунної при АІ оцінюють як за динамікою накопичення загальних протианаплазмозних антитіл, так і - імуноглобулінів (Ig) класів М і G. При умові первинного захворювання людини на ГАЛ, спочатку продукуються IgM (їх максимальний титр виявляється на 5-8-му добу), а після декількох діб відбувається переключення на синтез IgG. Рівень останніх у сироватці крові швидко зростає, значно перевищуючи - IgM для яких характерна швидка зворотна динаміка. Анамнестичні протианаплазмозні антитіла представлені в основному IgG. На основі кількісних і якісних показників формування специфічної імунної відповіді при анаплазмозі розроблено критерії серологічної (імунологічної) діагностики цього захворювання [5, 7]. На теперішній час спорадичні і групові випадки ГАЛ зареєстровані на всіх континентах (за винятком Антарктиди) більш ніж в 50 країнах світу, в тому числі в країнах Європи та в Україні. В США, де налагоджена лабораторна етіологічна діагностика ГАЛ і де з 1997 року введена його обов'язкова реєстрація, рівень захворюваності на ГАЛ складає 24-58 випадків на 100 000 населення в рік. При цьому, рівень летальності при субклінічних і легких формах (на які припадає переважна більшість випадків) перебігу анаплазмозу становить 0,5-1,0%, а при середній важкості і важких формах захворювання досягає 7-10% [1, 2]. Вперше етіологічну верифікацію випадків ГАЛ в Україні здійснено у 2007 році співробітниками лабораторії трансмісивних вірусних інфекцій Львівського НДІ епідеміології та гігієни МОЗ України [8]. При цьому були використані (одноразово імпортовані в Україну) діагностичні препарати для твердофазного імуноферментного аналізу (ELISA), що містили в якості анаплазмозного антигену клітини A. phagocytophilum, виготовлені в National Center for Zoonotic, Vector-borne, and Enteric Disease, CDC (1600 Clifton Rd., Atlanta, GA 30333, USA). Однак, через відсутність загальнодоступних, простих у застосуванні, ефективних і недорогих діагностичних біопрепаратів і до теперішнього часу випадки ГАЛ у людей діагностуються дуже рідко, хоча на території України існують чисельні осередки популяцій кліщів та досить часто реєструються інші трансмісивні кліщові інфекційні захворювання (наприклад, кліщовий бореліоз), природні ареали циркуляції збудників яких співпадають із ареалами циркуляції анаплазм [9]. Сучасні принципи і критерії діагностики ГАЛ основані на епідеміологічних, клінічних і лабораторних даних. Останнім відводиться вирішальне значення в етіологічній діагностиці ГАЛ, так як клі 53690 4 нічний перебіг цього інфекційного захворювання, як правило, не супроводжується специфічними клінічними проявами. В першу чергу, це стосується випадків із субклінічними та клінічно слабо вираженими формами АІ. Робоча група по вивченню Rickettsia, Coxiella, Anaplasma (Ehrlichia) і Bartonella (EVWOG) Європейського товариства з клінічної мікробіології та інфекційних хвороб рекомендувала основні (безсумнівні) та допоміжні (ймовірні) критерії для найбільш широко застосовуваних методів лабораторної діагностики ГАЛ: виявлення з допомогою світлової мікроскопії специфічних інтрацитоплазматичних мікроколоній (морул) збудника в клітинах-мішенях; виділення штамів збудника шляхом вирощування на спеціальних культурах евукаріотичних клітин; індикація специфічних фрагментів геному збудника з використаннямполімеразної ланцюгової реакції (ПЛР); виявлення в зразках клінічного матеріалу антигену збудника та (або) визначення рівня (титру) антитіл проти збудника в сироватці крові з допомогою імунологічних (серологічних) методів [10]. Завдяки простоті і уніфікованості технології відтворення, достатньо високого рівня специфічності, чутливості та відтворюваності результатів дослідження в теперішній час найбільш часто для лабораторної діагностики АІ застосовуються імунологічні методи: імуноферментний аналіз (ІФА), твердофазний імуноферментний аналіз (ТІФА), імуноблотинг, реакція тривалого зв'язування компліменту (РТЗК), реакція імунофлюоресценції (РІФ), реакція непрямої імунофлюоресценції (РНІФ) та ін. [2, 6, 10-12]. Використання РНІФ дозволяє діагностувати ГАЛ як на ранній стадії захворювання шляхом виявлення в досліджуваних зразках клінічного матеріалу самого антигену збудника, так і в період розпалу його клінічних проявів та на стадії видужання шляхом визначення рівня специфічних антитіл проти антигенів збудника в сироватці крові. Останній методичний підступ дозволяє здійснювати не лише діагностику ГАЛ, але й проводити епідеміологічні дослідження специфічної імуноструктури населення для встановлення територій поширення анаплазмозу та для оцінки об'єктивного рівня захворюваності цією інфекцією людей [5,11]. Принцип технології визначення в сироватці крові рівня (титру) протианаплазмозних антитіл методом РНІФ полягає в наступному [7, 13, 14]: препарати із нанесеним і зафіксованим анаплазмозним антигеном (АгАІ) оброблюють послідовними розведеннями досліджуваного зразку сироватки (ступінь розведення і кратність кроку в ряду послідовних розведень сироватки визначається завданням дослідження), яка потенційно може містити антитіла проти збудника АІ (АнтАІ), що зв'язуються (адсорбуються) із АгАІ, виконуючи функцію антитіл першого порядку (Ант1); в послідуючому, адсорбовані на АгАІ антигені Ант1 виявляються шляхом додаткової обробки препаратів флуоресціюючими антитілами (сироватками або імуноглобулінами) противидовими проти імуноглобулінів людини, які є антитілами другого порядку (Ант2). Таким чином, на поверхні АгАІ утворюється двошаровий комплекс із Анті і Ант2, який містить 5 флуоресціюючий барвник, що дозволяє при проведенні люмінесцентно-мікроскопічного дослідження препаратів його виявляти (візуалізувати), визначаючи при цьому рівень (титр) Анті в досліджуваному зразку сироватки крові. За титр Ант1 досліджуваної сироватки приймається останнє (найбільше) її розведення, яке обумовлює специфічну флюоресценцію анаплазмозного антигену, що оцінюється на три хреста. При визначенні титру АнтАІ методом РНІФ критеріями результатів лабораторних досліджень, що дозволяють встановити діагноз анаплазмозу є: не менш ніж чотирьохкратне зростання титру АнтАІ у парних сироватках, відібраних у одного й того ж хворого в гостру фазу захворювання та в період реконвалесценції (із інтервалом в 2-3 тижні); наявність у сироватці протианаплазмозних IgG та/або IgM в титрі не менш ніж 1:128 і 1:64, відповідно, при одноразовому дослідженні сироватки і неможливості проаналізувати рівень АнгАІ в динаміці. При проведенні імунодіагностичних досліджень ставляться негативні і позитивні контролі в РНІФ із нормальною сироваткою (перевіреною на відсутність АнтАІ) та протианаплазмозною (позитивною) сироваткою яка містить АнтАІ в титрі не нижче 1:128. Антивидові флуоресціюючі сироватки та імуноглобуліни проти імуноглобулінів людини, які при відтворенні РНІФ виконують функцію Ант2 є універсальними і загальнодоступними імунобіологічними препаратами завдяки налагодженому комерційному їх виробництву та широкому застосуванню в медицині і біології. Навпроти, різні типи АгАІ які слугують основним компонентом при відтворення РНІФ є дефіцитними і високовартісними діагностичними біологічними препаратами. Крім того, в розвинутих країнах світу (США, Канада, Японія, країни Європи та ін.) як експериментальні зразки таких препаратів, так і комерційні діагностичні тестсистеми до складу яких вони входять (в якості окремого продукту або способу його отримання) захищені чинними документами правової охорони як об'єкти інтелектуальної власності, що робить їх недоступними для використання в Україні з метою лабораторної діагностики ГАЛ. В теперішній час відомо декілька різних типів АгАІ для імунологічної діагностики ГАЛ шляхом визначення титру АнтАІ в сироватці крові. Аналог 1: пептиди AnkA для детекції A. phagocytophilum [Патент США №6964855 від 15.11.2005 р]. Для виявлення і визначення кількості антитіл (та їх фрагментів) проти збудника ГАЛ запропоновано використовувати цитоплазматичні білки (AnkA) A. phagocytophilum масою 68 і/або 145kDa які мають анкіринові повтори. Встановлена гетеротипність білків AnkA у штамів A. phagocytophilum ізольованих у різних географічних регіонах (США і країнах Європи). Спільними ознаками даного аналогу із корисною моделлю яка заявляється є здатність білків AnkA вступати в імунологічну реакцію (зв'язуватись) з АнтАІ, що дозволяє визначати рівень останніх в сироватці крові з метою діагностики ГАЛ. Суттєвими недоліками які заважають досягнути бажаного технічного результату є технологічна складність і висока вартість отримання достатньої кількості білків AnkA з 53690 6 використанням молекулярно-біологічних технологій (гібридомних або рекомбінантних). Крім того, використання при відтворенні РНІФ в якості АгАІ білків AnkA ускладнює оцінку візуалізованих люмінесцентно-мікроскопічних результатів через відсутність ряду диференційних ознак (морфологічних особливостей мікроколоній і клітин анаплазм) які вдається виявляти за умови використання повного корпускулярного АгАІ (ПКАгАІ). Аналог 2: нуклеїнова кислота, що кодує головний білок зовнішньої мембрани збудника ГАЛ і пептиди нею кодовані [Патент США №6436399 від 20.08.2002 р.]. Для відтворення імунологічних реакцій з метою діагностики ГАЛ запропоновано використовувати білки групи Р44 (яка містить білки Р44, Р44-2, Р44-12, Р44-15, Р44-18 і Р44-19 із молекулярною масою від 8,5 до 11 kDa) зовнішньої мембрани A. phagocytophilum. Встановлено високий рівень імуноспецифічності білків групи Р44 та сконструйовано олігопептиди (довжиною 14-16 залишків амінокислот) для проведення хімічного (біохімічного) синтезу цих білків. Спільними ознаками даного аналогу із корисною моделлю яка заявляється є здатність білків групи Р44 (в якості антигену) зв'язуватись із специфічними АнтАІ сироватки крові при відтворенні імунологічних реакцій для лабораторної діагностики ГАЛ. Суттєвими недоліками які заважають досягнути бажаного технічного результату є технологічна складність і висока вартість отримання достатньої кількості білків групи Р44 із використанням методів хімічного (біохімічного) синтезу. Крім того, в структурі білків групи Р44 виявлено гіперваріабельні області, що може негативно впливати на ефективність їх використання з метою імунодіагностики ГАЛ у різних географічних регіонах в яких штами збудника АІ можуть відрізнятися за антигенною структурою. Застосування білків групи Р44 (аналогічно як і білків AnkA) при відтворенні РНІФ ускладнює оцінку її результатів. Найближчим аналогом (прототипом) корисної моделі, що пропонується є метод вирощування культури бактерій A. phagocytophilum в лінії клітин промієлоцитів HL-60 та виготовлення препаратів антигенів цього виду анаплазм (у формі знезаражених та іммобілізованих на твердофазному носію клітин HL-60, що містять інтрацитоплазматичні морули - мікроколонії, скупчення клітин збудника ГАЛ) з метою їх використання для лабораторної діагностики АІ [Патент США № 5955359 від 09.21.1999 p.]. Ознаками прототипу, які збігаються із суттєвими ознаками способу що заявляється, є використання в імунологічних реакціях (ТІФА, РНІФ) для визначення титру АнтАІ в сироватці крові ПКАгАІ інактивованих клітин A. phagocytophilum. Використання діагностичних тест-систем, до складу яких входять такий АгАІ, забезпечує достатньо високий рівень чутливості (82-100%) та специфічності (83-100%) і помірний рівень відтворюваності (75-95%) результатів досліджень, а також виключає необхідність проведення технологічно складних і високопрацеємких етапів очищення ПКАгАІ штаму A. phagocytophilum від дебрісу евукаріотичних клітин на яких анаплазми виду A. phagocytophilum було вирощено [3, 7, 12]. 7 53690 Причинами, що перешкоджають одержанню очікуваного технічного результату з допомогою прототипу є складність і висока вартість вирощування анаплазм виду A. phagocytophilum в культурі спеціальної лінії промієлоцитарних клітин HL-60 без використання антибіотиків, що потребує освоєння високотехнологічних та дорогих методів культивування цієї лінії евукаріотичних клітин in vitro і може здійснюватись лише у деяких спеціалізованих лабораторіях в умовах із високим рівнем асептики та біобезпеки в цілому. Крім того, у відомих колекціях культур мікроорганізмів України відсутні офіційно зареєстровані (задепоновані) штами A. phagocytophilum. В основу корисної моделі поставлено завдання розробити ефективний спосіб лабораторної діагностики ГАЛ шляхом визначення титру АнтАІ в РНІФ для відтворення якої використовувався б більш доступний тип АгАІ, виготовлення якого було б технологічно більш простим, дешевим та біобезпечним і використання якого б забезпечувало отримання чітких диференційних ознак для оцінки результатів РНІФ. Поставлене завдання вирішувалось тим, що в способі діагностики ГАЛ шляхом визначення титру АнтАІ в сироватці крові в РНІФ у якості АгАІ, згідно із запропонованою корисною моделлю, використовують ПКАгАІ штамів анаплазм виду A. marginale, а не штамів - A. phagocytophilum. Використання діагностичних препаратів ПКАгАІ отриманих із штамів A. marginale для імунологічної діагностики ГАЛ в РНІФ обґрунтовано високим рівень (більше 60%) антигенної спорідненості між A. marginale і А. phagocytophilum [15]. 8 В Україні та в інших багатьох країнах світу вихідні субстрати для отримання препаратів ПКАгАІ із штамів A. marginale є загальнодоступними і недорогими. Наприклад, комерційне виробництво такого субстрату (у формі біобезпечної - інактивованої, ліофілізованої бактерійної маси штаму А. marginale ВИЭВ1) здійснює Всеросійський НДІ експериментальної ветеринарії ім. Я.Р. Коваленко РАСХН (м. Москва; http://www.viev.ru), що в свою чергу, дозволяє їх широко використовувати в установах, закладах та організаціях медичного, біологічного та ветеринарного профілю для виконання наукових і практичних завдань. Із інактивованої ліофілізованої бактерійної маси штаму A. marginale ВИЭВ1 нами було виготовлено експериментальні зразки діагностичного препарату ПКАгАІ для імунодіагностики ГАЛ в РНІФ. Специфікація експериментальних зразків препарату ПКАгАІ представлена в таблиці 1. В експериментах на модельних зразках та зразках клінічного матеріалу проведено лабораторно-клінічне випробування діагностичного препарату ПКАгАІ, що дозволило встановити рівні чутливості, специфічності та відтворюваності результатів досліджень з використанням запропонованого способу визначення титру АнтАІ в РНІФ. В якості модельних зразків використано 11 типів гомологічних і гетерологічних (по відношенню до ПКАгАІ) діагностичних сироваток та імуноглобулінів (далі означені як Ант) проти видів мікроорганізмів, які є найбільш філогенетичноспоріднені з анаплазмами та Ант проти патогенів інших таксономічних груп, що є збудниками кліщових бактеріальних інфекцій. Таблиця 1 Специфікація діагностичного препарату ПКАгАІ Прозора, однорідна із незначною опалесценцією рідина, яка після струшування не містить помітних неозброєним оком включень і осаду. Суспензія ПКАгАІ штаму A. marginale ВИЭВ1 у ФСБ (рН=7,0), яка містить в якості конЗагальна характесерванту 0,05% азиду натрію. Концентрація корпускул ПКАгАІ в суспензії становить ристика (1,7±0,7)х106/мл. ПКАгАІ виготовлено із інактивованої ліофілізованої бактерійної маси штаму A. marginale ВИЭВ1 за технологією, яка включає етапи: очищення корпускул антигену Метод отримання (шляхом різношвидкісного центрифугування і відстоювання), стандартизацію концентрації корпускул, хімічну постінактивацію та стабілізацію, фасування і маркування препарату. ПКАгАІ здатний вступати в імунологічні реакції із АнтАІ, адсорбуючи їх на своїй поверхні, що забезпечує при відтворенні РНІФ отримання чіткої люмінесцентно-мікроскопічної картини для оцінки диференційних характеристик. ПКАгАІ має деякий рівень природної Основні біологічні антигенної подібності із корпускулярними антигенами клінічно-значущих видів рикетсій, властивості бартонел, бруцел, францізел, що обумовлює можливість перехресних імунологічних реакцій між ПКАгАІ та сироватками крові (або імунодіагностичними препаратами) із високим рівнем антитіл проти вказаних груп мікроорганізмів. Зовнішній вигляд Модельні зразки гомологічних Ант були представлені: експериментальним зразком протианаплазмозних імуноглобулінів кролячих (протиАнапІgКр), комерційною діагностичною ("позитивною") сироваткою ВРХ проти Anaplasma marginale, зразками сироваток крові клінічно здорових людей, в які дозовано додавали пpoтиАнапlgKp до визначеної кінцевої концентрації останніх. Модельні зраз ки гетерологічних Ант склали комерційні і експериментальні препарати "позитивних" контрольних сироваток (Ант) із видовою специфічністю проти: Rickettsia prowazekii, R. sibirica, Bartonella henselae, B. quintana, Brucella abortus, Borrelia garinii, Francisella tularensis, Coxiella burnetii. При цьому модельні зразки гомологічних і гетерологічних Ант тестувались як у нативному стані, так і в 9 53690 робочому титрі, який вказано підприємствомвиробником цих імунобіологічних препаратів. При випробуванні ПКАгАІ також було тестовано 101 зразок клінічного матеріалу: 21 зразок сироватки крові осіб, укушених кліщем та 80 зразків сироватки клінічного здорових людей - донорів крові. Із кожним модельним зразком та зразком клінічного матеріалу РНІФ ставили в трьох повторах. В усіх випадках тестування гомологічних Ант (в тому числі, розведених до титру фарбування найбільшого розведення Ант яке забезпечує фарбування ПКАгАі з яскравістю люмінесценції на три хреста) був зафіксований позитивний результат РНІФ. Із використанням методу специфічної адсорбції (АнтАІ+ПКАнгАІ) та подальшим визначенням титру в постадсорбованих модельних препаратах гомологічних Ант була встановлена межа чутливості досліджень способу діагностики АІ шляхом визначення рівня титру АнтАІ в РНІФ із використанням ПКАгАІ, що становить: в модельній системі протиАнапIgКр+ФСБ (0,197±0,039)мг білку/мл, а в модельній системі протиАнапIgКр+сироватка крові людини (0,249±0,067)мг білку/мл. При тестуванні 10 гетерологічних типів Ант були встановлені такі закономірності. Перехресні позитивні результати РНІФ відмічали у випадках тестування нативних (нерозведених) препаратів комерційних діагностичних сироваток та імуноглобулінів проти R. prowazekii, R. sibirica, В. henselae, В. quintana, В. abortus, В. garinii, F. tularensis. Проте, в усіх випадках тестування гетерологічних Ант в їх робочому розведенні результати РНІФ були негативними. Крім того, в медичній практиці у випадках наявності перехресних реакцій при імунологічній (серологічній) діагностиці інфекційних захворювань, етіологія захворювання визначається за правилом "найвищого титру", тобто, верифікується етіологічний лабораторний діагноз того захворювання проти збудника якого виявлено найвищі діагностичнозначимі титри специфічних антитіл. Узагальнені результати визначення титру АнтАІ в сироватках крові осіб, укушених кліщем, та сироваток клінічно здорових людей (донорів крові) в РНІФ із використанням ПКАгАІ представлено в таблиці 2. Таблиця 2 Узагальнені результати визначення титрів АнтАІ в сироватці крові осіб, укушених кліщем та сироваток клінічно здорових людей (донорів крові) Походження зразків Кількість досліджених зразків Сироватка крові осіб, укушених кліщем Сироватка крові клінічно здорових людей Всього Титр протианаплазмозних антитіл 21 80 101 Як свідчать дані цієї таблиці, середнє арифметичне значення m титру АнтАІ в сироватці крові осіб, укушених кліщем, є достовірно (з рівнем достовірності р0,05) наявну тенденцію щодо більш високого m титру IgM у сироватках крові осіб першої групи, у порівнянні із аналогічним показником титру IgM у сироватках крові людей другої групи. Навпроти, m титру протианаплазмозних IgG в сироватках крові осіб, укушених кліщем достовірно (р