Спосіб неінвазійної діагностики лейкозу великої рогатої худоби шляхом визначення антитіл до вірусу у молоці корів імуносенсором поверхневого плазмонного резонансу

Спосіб неінвазійної діагностики лейкозу великої рогатої худоби, який відрізняється тим, що за допомогою імуносенсорного аналізу на основі поверхневого плазмонного резонансу у сироватці молока корів визначають наявність антитіл до білків p24, pg 51 вірусу лейкозу великої рогатої худоби, присутність яких вказує на наявність хвороби в тварини. (19) (21) a200512689 (22) 28.12.2005 (24) 26.11.2007 (72) СТАРОДУБ МИКОЛА ФЕДОРОВИЧ, UA, АРТЮХ ВАЛЕРІЙ ПЕТРОВИЧ, UA, ПИРОГОВА ЛЮДМИЛА ВІТАЛІЇВНА, UA (73) ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ІМ.О.В.ПАЛЛАДІНА НАЦІОНАЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ НАУК УКРАЇНИ, UA (56) UA A 53267 15.01.2003 Пирогова Л.В., Стародуб М.Ф., Артюх В.П., Нагаєва Л.І., Добросол Г.І. Експересна діагностика лейкозу великої рогатої худоби за допомогою 3 наявності відповідних приладів для контролю процесу визначення, що обумовлює високу вартість аналізу і тому обмежує можливості масового обстеження тварин. Найближчим аналогом, запропонованого способу діагностики лейкозу ВРХ є спосіб, що базується на визначенні антитіл до вірусних білків р24 та pg 51 у сироватці крові хворих на лейкоз корів. У цій розробці було застосовано один із варіантів ППР де використовується тонка плівка золота (40нм), нанесена на шар нікелю, на межі двох прозорих середовищ з різними коефіцієнтами заломлення (скляна призма), які виконують роль функціональної поверхні оптичного біосенсора. При перевищенні критичного кута плоскополяризованого променя світла, при найвищому значенні коефіцієнта заломлення, відбувається повне внутрішнє віддзеркалення. В цих умовах в поверхневих плазмонних полярітонах спостерігають, обумовлений перекачкою енергії випромінювання, резонансний мінімум залежності інтенсивності віддзеркалення випромінювання від кута падіння лазерного променю на плівку золота. Взаємодія антигену (білки р24- та gp-51 вірусу лейкозу великої рогатої худоби) із специфічними до цього білка антитілами, реєструється за зміною кута віддзеркалення за типом, зазначеної вище залежності, що обумовлює можливість моніторингу процесу зв'язування антигену з антитілом і, врешті решт, обумовлює високу чутливість при визначенні рівня антитіл (антигену), а, значить, і можливість ранньої та статистичне достовірної діагностики лейкозу великої рогатої худоби. Аналіз здійснюється наступним чином. На поверхню трансдьюсера іммобілізують антиген або антитіла, попередньо розчинених у буферному розчині з вмістом NaCl 0,9 % (БФР) рН 7.4, 140 мМ NaCl протягом 15-20 хв при температурі 20±5°С. Далі вимірювальну комірку промивають ЗФР і реєструють величину резонансного кута. Після цього комірку наповнюють розчином антитіл або антигену, фіксують величину кута. При утворенні на поверхні трансдьюсера імунних комплексів спостерігається зсув резонансного кута. Зміна величини кута залежить від кількості утворених імунокомплексів і пропорційна концентрації специфічних антитіл або антигену в досліджуваному розчині. Тестування сироваток на наявність у них антитіл, специфічних до білків gp51 та р24 ретровірусу, проводили наступним чином. Спочатку реєстрували резонансний кут при введенні у вимірювальну комірку (об'ємом 10мкл) дистильованої води (контроль). Потім у неї вводили розчин специфічного антигену, витримували його там протягом 20хв. при температурі 20±5°С, промивали комірку дистильованою водою для видалення надлишку антигену, що не сорбувався на поверхні, та реєстрували зсув резонансного кута. Для запобігання подальшого неспецифічного зв'язування компонентів сироватки вільні місця зв'язування на поверхні трансдьюсера блокували за допомогою 1%-ного розчину БСА, який вносили 81045 4 в комірку, витримували його там протягом 10 хв при температурі 20±5°С, після чого комірку промивали БФР і реєстрували покази приладу. Далі комірку наповнювали розчином анти сироватки, послідовно зменшуючи кратність розведення: 1:20000; 1:1000. Час інкубації для кожної проби був 10 хвилин. Кожного разу комірку промивали буфером, що містив 0,1 % твин-20 в БФР, для видалення елементів, які не зв'язалися, і після цього реєстрували відгук імунного сенсора. [Пат. 53267 A, UA, МКИ7, Опубл. 12.01.2003, Бюл. №1]. В основу запропонованого способу поставлено завдання розробити новий неінвазійний метод діагностики вірусного лейкозу великої рогатої худоби (ВРХ) на основі використання відомого явища поверхневого плазменного резонансу (ППР). В розробці, що заявляється, використовують варіант ППР, де перетворювачем оптичного сенсора є тонка золота плівка, яка розташована між двома середовищами з різним коефіцієнтом заломлення - склом і досліджуваним розчином. Шар золота товщиною 45нм напилюють (термічне випарювання у вакуумі, 10-3Па) на поверхню скляної пластинки, яка попередньо оброблена в суміші перекису водню та сірчаної кислоти у співвідношенні 1:3. Остання поєднується з призмою оптичного приладу за допомогою імерсійної рідини (поліфенілового ефіру) із коефіцієнтом рефракції 1,61. Цей сенсорний чіп дозволяє з великою чутливістю виявляти речовини при реєстрації імунореактивної взаємодії та явища поверхневого плазмонного резонансу. Аналіз здійснюється за принциповою схемою прототипу при визначенні антитіл (антигенів) у сироватці крові хворих корів, але з урахуванням особливостей об'єкта дослідження - молока. Процедура дослідження починається з підготовки зразків матеріалу, що досліджується. Свіже молоко від РІД-позитивних та РІДнегативних корів, закислють 5 % оцтовою кислотою, центрифугують протягом 15 хв при 400 g та одержують сироватку. Для аналізу використовують зразки сироватки різного ступеню розведення, для чого використовують 0,01 М фосфатний буфер із рН 7,4, що містить 0,14 М хлористого натрію (ЗФР). 1% Розчин бичачого сироваткового альбуміну (БСА) готують, використовуючи ЗФР. Тестування сироваток молока на наявність у них антитіл, специфічних до білків gp51 та р24 ретровірусу, проводять наступним чином. Спочатку реєструють резонансний кут при введенні у вимірювальну комірку (об'ємом 10мкл) буферного розчину. Потім комірку наповнюють розчином специфічного антигену, витримують його там протягом 20хв при температурі (20±5)°С, промивають комірку ЗФР для видалення надлишку антигену, що не сорбувався на поверхні, та реєструють зсув резонансного кута. Для запобігання подальшого неспецифічного зв'язування компонентів сироватки вільні місця зв'язування на поверхні трансдьюсера блокують за допомогою 1%-ного розчину БСА, який вносять 5 в комірку, витримують його там 10хв. при температурі (20±5)°С, після чого комірку промивають ЗФР і реєструють покази приладу. Далі в комірку вводять розчин сироватки молока в розведенні: 1:10; 1:20; 1:40; 1:80; 1:160 та 1:320. Час інкубації для кожної проби складає 10хв. Кожного разу комірку промивають буфером, що містить 0,05 % твін-20 в ЗФР, для видалення елементів, що не зв'язалися, і після цього реєструють відгук імунного сенсора. На фіг.1 показано відхилення резонансного кута імунного сенсора на основі ППР при дослідженні сироваток молока корів рідпозитивних (Ухтерлоні) (1) та РІД-негативних (2) корів. На осі абсцис відкладено розведення сироватки. На осі ординат - зміна резонансного кута. На фіг.2 показано відхилення резонансного кута імунного сенсора на основі ППР при дослідженні сироваток крові та молока корів. 1, 2 сироватки крові у розведенні 1:500 (РІД-позитивні та РІД-негативні відповідно); 3, 4 - сироватки молока (у розведенні 1:20) від РІД-позитивних (3) та РІД-негативних корів (4). На осі абсцис відкладено розведення сироватки, на осі ординат зміна резонансного кута. Метод, що заявляється, має переваги перед методами, якими користуються нині, меншим часом аналізу - 10-15хв, тоді як за методом РІД (Ухтерлоні) він становить 72 годин, за методом ELISA - декілька годин, та значно меншою вартістю аналізу. Спосіб, що заявляється, має суттєві переваги перед відомими способами діагностики лейкозу ВРХ: - є неівазійним; - відпадає необхідність у взятті зразків крові процедури, яка потребує відповідних умов, часу, інструментального забезпечення, послуг кваліфікованого персоналу, дотримання стерильності; забезпечує можливість простого й оперативного контролю великих партій молока, що зменшує загальну вартість ветеринарного обслуговування; - забезпечує можливість індивідуальної діагностики корів, що сприяє запобіганню розповсюдження хвороби у гурті тварин; Таким чином, спосіб неінвазійної діагностики лейкозу ВРХ шляхом визначення антитіл до вірусу у молоці корів за допомогою ППР-імуносенсора забезпечить можливість контролю як для безпосереднього виробника молока, так і для підприємств переробної промисловості. Спосіб, що заявляється, забезпечує можливість моніторингу наявності чи появи лейкозу у гурті дійних корів окремих господарств, з метою виявлення вибраковки та вилучення хворих тварин та вакцинації здорових. Розробка може бути використана для створення компактного спеціалізованого приладу, придатного для використання в польових умовах. 81045 6