Спосіб виділення та очистки igm людини

Реферат: UA 69272 U UA 69272 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до імунохімії, біохімії та біотехнології і може бути використана для специфічного виділення та очистки IgM людини високого ступеня чистоти, придатних для використання в імуноаналізі. Для виділення та очистки імуноглобулінів звертаються до широкого арсеналу методів молекулярної імунології та біохімії. При цьому всі підходи базуються на застосуванні фізикохімічних та біологічних властивостей даної групи молекул. Найчастіше використовують наступні відмінності антитіл різних класів від інших молекул, що присутні у сироватці, а саме: молекулярну масу, спорідненість до низки протеїнів (білки А та G), ізоелектричну точку, розчинність за різних умов [1-3]. На використанні зазначених відмінностей біомолекул базуються методи гель-фільтрації, афінної та іонообмінної хроматографії, діалізу, осадження солями та органічними розчинниками. Більшість підходів, що зустрічаються у літературі [1, 4, 5], передбачає поєднання декількох методів. Проте багатьом із запропонованих методик бракує чіткості протоколів експерименту, а також адекватних способів контролю чистоти імуноглобулінів. Методи виділення та очистки IgG людини як правило базуються на використанні афінної хроматографії на протеїнах А та G, вони чітко та повно описані у науковій літературі, дають добре відтворювані результати та, на нашу думку, не потребують оптимізації. У той же час, існують різні підходи до очистки та виділення імуноглобулінів людини класів М та А: описані різними авторами схеми, є багатоетапними, не завжди забезпечують добре відтворюваних результатів, призводять до відчутних втрат імуноглобулінів, їм бракує чітких та адекватних методів контролю процесу очистки та кінцевого продукту. Описана схема отримання IgM людини заснована на використанні гель-фільтрації [6], яка передбачає використання як вихідного матеріалу еуглобулінової фракції сироватки крові з подальшим осадження IgM людини 5 % розчином поліетиленгліколю 8000 (для деконтамінації α2-макроглобуліном), двоетапне хроматографування розчиненого преципітату на колонці з сефакрилом S-300. Недоліком даної методики є її багатоетапність та низькій вихід цільового продукту. Найбільш близьким до запропонованого способу з методологічної точки зору є використання афінного сорбенту (колонка «HiTrap Protein G HP», GE Healthcare Bio-Sciences AB, Швеція) для виділення IgG людини із сироватки або плазми крові людини [7]. В основу даної схеми покладено відмінності біологічних властивостей класів імуноглобулінів людини, а саме їх різну спорідненість до білків А та G. Разом із тим недоліком згаданої методики стосовно до виділення та очистки IgM людини є вкрай низька спорідненість даного класу імуноглобуліну до протеїну А й відсутність такого афінітету до прототипу G. Метою наших досліджень було створення високоефективної та легко відтворюваної методики специфічного виділення та очистки IgM людини. Поставлена задача вирішувалася шляхом розробки методики імуноафінної хроматографії для виділення IgM людини, що передбачало: підбір моноклональних антитіл й оптимальних умов для синтезу імуноафінного носія, підвищення специфічності зв'язування IgM з імуноафінним сорбентом, підбір умов відмивання колонки й елюції IgM, контроль чистоти одержуваного препарату. У порівнянні із іншими підходами запропонований нами спосіб виділення та очистки IgM людини передбачає: пропущення сироватки через передколонку; нанесення сироватки на імуноаффінну колонку з анти-IgM МКАТ; відмивання колонки фосфатним буфером; елюція IgM хлоридом магнію; відмивання колонки фосфатним буфером; переведення IgM у фосфатний буфер на сефадексі G-25. Запропонований спосіб дає можливість одержувати добре відтворені результати при використанні різних сироваток. Оригінальна схема має відчутні переваги в порівнянні зі схемами, заснованими на неспецифічних біохімічних та фізико-хімічних методах виділення даного імуноглобуліну. Вона не вимагає значних кількостей сироватки, втрати цільового продукту зводяться до мінімуму, і методика в цілому є більше простою. Ступінь чистоти одержуваного за розробленою схемою IgM не коливається від партії до партії й досягає близько 100 %, що дає можливість його використання для імунізації тварин й імуноаналізу. Приклад 1. Отримання імуноафінних сорбентів. Для іммобілізації на сефарозі використали отримані раніше моноклональні антитіла до IgM людини [8]. Підбір МКАТ проводили виходячи з результатів дослідження властивостей анти-IgM МКАТ у варіанті ТІФА IgM-«пастка». Для синтезу імуноафінного сорбенту було відібрано 4 клони МКАТ (112С5.2, 111С2, 126G6, 125В5), які виявили високу активність у поєднанні із достатньою специфічністю при використанні їх у складі імуносорбенту в ТІФА для виявлення IgM-антитіл до вірусу простого герпеса та Toxoplasma gondii [8]. Встановлення оптимального часу іммобілізації МКАТ на сефарозі проводили шляхом визначення залишкової антитільної активності в реакційному буфері. Зниження титру антитіл 1 UA 69272 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 112С5.2 в імуноферментному аналізі вказувало на падіння концентрації МКАТ у розчині і їхнє зв'язування з носієм. 25 мл суспензії сефарози 6В («Sigma», США) промивали водою на скляному фільтрі і переносили в плоскодонну колбу на 100 мл. До сефарози додавали 25 мл 0,5 М карбонатного буферу (рН 11) і 6,25 мл дивінілсульфону («Sigma», США) і струшували на шейкері протягом 80 хв. Активований носій фільтрували на скляному фільтрі, промивали водою і ресуспендували у 15 мл розчину очищених моноклональних антитіл з концентрацією 5,3 мг/мл в 0,1 М карбонатному буфері (рН 9,2). Суспензію струшували при кімнатній температурі протягом 12 годин. Контроль процесу синтезу імуноафінного сорбенту проводили шляхом вивчення кінетики іммобілізації МКАТ на сефарозі. Для цього протягом перших чотирьох годин через кожні 30 хвилин і через 6 й 12 годин після початку іммобілізації з реакційної суміші відбирали по 50 мкл надосадової рідини. Як контрольні зразки використали інтактні МКАТ 112С5.2, інкубовані у карбонатному буфері при кімнатній температурі. Після відбору всі проби охолоджували й аналізували методом твердофазного імуноферментного аналізу (ТІФА). Для цього IgM людини сорбували на планшетах «Polysorp» («Nunc»), вихідні антитіла й відібрані проби розводили в 100 разів і титрували з log2 до 1:12800. Після інкубації й промивання вносили антивидовий кон'югат і хромоген, результати враховували при 492 нм на спектрофотометрі Multiskan Ascent 354 (TermoLab, Фінляндія). За результатами ТІФА будували криві залежності значень оптичної густини зразків з реакційної суміші від часу інкубації. Після завершення синтезу для інактивації груп, що не прореагували, носій відфільтровували, промивали водою й суспендували у 25 мл 0,1 М карбонатного буфера, що містить 1,5 мл етаноламіну («Fluka», США), а потім струшували на шейкері протягом 2 годин. Далі сефарозу відфільтровували на скляному фільтрі, промивали водою й суспендували у фосфатному буфері. Приготовлений у такий спосіб імуноафінний сорбент зберігали до використання при температурі 4 °C. Графік кінетики іммобілізації антитіл будували на підставі результатів ТІФА, отриманих для проб з розведенням 1:400, при якому спостерігалося зниження оптичної густини від часу синтезу імуноафінного сорбенту. Графік залежності оптичної густини зразків у ТІФА від часу інкубації в порівнянні з контролем наведений на Фіг. 1. Аналіз кінетики іммобілізації моноклональних антитіл указує на можливість скорочення часу синтезу імуноафінного сорбенту до 6 годин. Збільшення тривалості реакції більше 6 годин не приводить до відчутного підвищення питомої концентрації зв'язаних із сефарозою МКАТ і призводить до часткової інактивації останніх. Приклад 2. Розробка методики специфічного виділення IgM людини. Оптимізацію методики очищення IgM людини почали з порівняльної характеристики властивостей чотирьох імуноафінних сорбентів (з МКАТ 112С5.2, 111С2, 126G6, 125В5) і вибору умов елюції. Якість імуноафінних колонок визначали по наступних властивостях: активності зв'язування IgM сироватки й чистоті елюйованого продукту. Дисоціація комплексу «антигенантитіло» при імуноафінній хроматографії можлива шляхом підвищення і зниження рН, а також застосуванням хаотропних агентів [1]. Елюція IgM при високому значенні рН була неможлива через нестійкість імуносорбенту в лужному середовищі. Для елюції в кислих умовах найчастіше застосовують 0,1 М НСl-гліциновий буфер, рН 2,5. Як хаотропний агент використали хлорид магнію, який ефективно руйнує комплекс «антиген-антитіло» і не має вираженого денатуруючого впливу. Порівняння МКАТ проводили по однієї й тій же схемі. Використали імуноафінні колонки однакового об'єму (2 мл), на кожну з яких наносили по 1 мл сироватки з концентрацією IgM 1,21 мг/мл зі швидкістю 0,2 мл/хв. Відмивання проводили 0,05 М фосфатним буфером (рН 7,2-7,4), що містить 0,14 М NaCl зі швидкістю 1 мл/хв. IgM елюювали двома способами: 3,5 М MgCl2×6H2O й 0,1 М гліцин-НСl, рН 2,5. Концентрацію IgM визначали у сироватці, пропущеної через колонку, а також в елюйованій фракції. Порівняльна характеристика варіантів імуноафінної хроматографії наведена в таблиці 1. Аналіз результатів імуноафінної хроматографії дозволяє зробити висновок про ступінь придатності чотирьох МКАТ для синтезу сорбенту. За даними таблиці 1, антитіла 125В5 проявляли кращі характеристики в порівнянні з іншими МКАТ. Моноклональні антитіла 125В5 активніше зв'язували IgM сироватки й, головне, чистота елюйованого імуноглобуліну була набагато вище, ніж у випадку з іншими антитілами. 2 UA 69272 U Таблиця 1 Порівняльна характеристика варіантів імуноафінної хроматографії Варіанти елюції Характеристика 112С5.2 Вихідна концентрація IgM, мг/мл Концентрація IgM у фракції, що не зв'язалася, мг/мл Кількість IgM в елюаті, мг MgCl2×6H2O 111С2 125В5 126G6 112С5.2 10 15 20 25 30 35 126G6 1,21 1,21 1,21 1,21 1,21 1,21 1,21 1,21 0,24 0,31 0,13 0,19 0,27 0,32 0,17 0,21 0,56 0,48 0,72 0,62 0,52 0,49 0,67 0,52 Примітка. Підрахунок концентрації IgM проводили хроматографічного аналізу у 4 повторюваннях; р < 0,05. 5 гліцин-НСl 111С2 125В5 за результатами проведення Серед двох варіантів елюції, за допомогою MgCl2×6H2O і гліцин-НСl, перший виявився кращим. При використанні розчину хлориду магнію IgM елюювався із колонки в більшій концентрації й елюція була повною. У той же час гліциновий буфер дисоціював комплекс «антиген-антитіло» менш ефективно, що приводило до залишків IgM на колонці. Після вибору виду агента для елюції бажано було знизити його концентрацію в розчині до мінімального значення, ефективно дисоціюючого комплекс «антиген-антитіло». Зниження молярності розчину хлориду магнію в 2 рази, до 1,75 М, не приводило до зменшення його здатності елюювати імуноглобулін з колонки. Тому в наступних експериментах використали саме цю концентрацію. Подальшим завданням по оптимізації процесу імуноафінної хроматографії було підвищення чистоти одержуваного IgM. Для реалізації цієї задачі можна використати два підходи [1, 9]: видалення баластових речовин сироватки, що зв'язалися зі колонкою, шляхом підбору умов відмивання; попередження неспецифічного зв'язування компонентів сироватки з імуноафінним носієм. Реалізація першого підходу зводилася до використання різних варіантів відмивання сорбенту із МКАТ 125В5 після нанесення сироватки. Імуносорбент відмивали наступними розчинами: 0,5 М NaCl, 0,5% тритоном й 0,05% деоксихолатом натрію, а також фосфатним буфером, на якому були приготовлені всі вищезгадані розчини. У всіх випадках елюцію проводили хлоридом магнію, а одержуваний продукт оцінювали, визначали по співвідношенню IgM : загальний білок. Концентрацію IgM людини визначали за допомогою Набору реагентів для імуноферментного визначення концентрації загального імуноглобуліну класу М в сироватці крові «IgM общий - ИФА - БЕСТ» (Вектор-Бест, Росія). Отримані результати вказували на незначне підвищення чистоти одержуваного IgM при використанні як відмиваючого розчину 0,5 М NaCl. Однак слід зазначити, що всі досліджувані варіанти відмивання показали дуже близькі результати, тому зміна її умов практично не впливає на чистоту одержуваного імуноглобуліну. Наступним кроком по оптимізації процесу імуноафінної хроматографії було нівелювання неспецифічного зв'язування компонентів сироватки із сорбентом. Одним з прийомів для підвищення ефективності імунохроматографічної очистки білків є використання так званої передколонки із неспецифічними МКАТ [4, 9]. Імуноафінну очистку IgM проводили у двох варіантах (із передколонкою і без неї), що дозволяло зробити висновок про ефективність використання передколонки. Проводили елюцію імуноглобуліну й визначали його вміст. Результати порівняння даних варіантів імуноафінної хроматографії наведені у таблиці 2. Отримані результати свідчать про значне підвищення ефективності процесу очищення IgM при використанні передколонки: концентрація одержуваного продукту виросла в 1,32 рази. Ефект передколонки пояснюється можливістю попереднього видалення компонентів сироватки, які взаємодіють із імуносорбентом й елюються разом із IgM, забруднюючи препарат останнього. 40 3 UA 69272 U Таблиця 2 Порівняльна характеристика імуноафінної хроматографії із використанням перед колонки Характеристика Вихідна концентрація IgM, мг/мл Концентрація IgM у фракції, що не зв'язалася, мг/мл Сумарна кількість IgM в елюаті, мг Вміст IgM в елюаті, % Варіант хроматографії без передколонки з передколонкою 1,21 1,21 0,12 0,09 0,75 74 0,87 98 Примітка. Підрахунок концентрації IgM проводили хроматографічного аналізу у 4 повторюваннях; р < 0,05. 5 10 15 20 25 за результатами проведення Приклад 3. Контроль чистоти препарату IgM людини. Кінцеву перевірку чистоти одержаного IgM проводили за допомогою електрофорезу у ПААГ з ДСН. Для препарату імуноглобулінів було виявлено лише дві смуги, що відповідали важким та легким ланцюгам: на Фіг. 2 зображено електрофореграму препарату IgM людини (1 - маркери молекулярної маси; 2 - IgM людини). Такі результати електрофорезу засвідчували високу чистоту одержаного препарату, вміст IgM наближався до 100%. Джерела інформації: 1. Антитела. Методы: Кн. 1: Пер. с англ. / Под ред. Д. Кэтти. - М.: Мир, 1991.-288 с. 2. Richman D.D., Cleveland P.H., Oxman M.N. et al. The binding of staphylococcal protein A by the sera of different animal species // J. Immunol. -1982. - Vol. 128. - P. 2300 - 2305. 3. Kronvall G.A surface component in group A, C, and G streptococci with non-immune reactivity for immunoglobulin G-binding properties // J. Immunol.-1973.-Vol. 111.-P. 1401-1406. 4. Harlow E., Lane D. Antibodies. A laboratory manual. - N.-Y.: Cold Spring Harbor, 1988. - 726 p. 5. The human IgG subclasses. Molecular analisis of structure, function and regulation / Ed. F. Shakib. - Oxford: IRL Press, 1990. - 280 p. 6. Галкін О. Ю. Біотехнологія одержання та використання моноклональних антитіл до IgM людини: автореф. дис. ... канд. біол. наук: 03.00.20. Одес. нац. ун-т ім. I. I. Мечникова. - О., 2010. - 20 с. 7. Nikolayenko I.V., Galkin O.Yu., Grabchenko N.I. et al. Preparation of highly purified human IgG, IgM, and IgA for immunization and immunoanalysis // Ukrainica Bioorganica Acta. - 2005. - N. 2. - P. 3-11. 8. Галкін О.Ю., Дуган О.М. Порівняння схем імунізації мишей лінії Balb/c для одержання моноклональних антитіл до IgM людини // Імунологія та алергологія. - 2009. - № 1. - С. 68-73. 9. Goding J. Monoclonal antibodies. Principles and practice. - San Diego: Academic press, 1996. 492 p. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 30 Спосіб виділення та очистки IgM людини, що дає можливість одержувати препарати IgM високого ступеня чистоти, який відрізняється тим, що передбачає: пропущення сироватки через передколонку; нанесення сироватки на імуноафінну колонку з анти-IgM моноклональних антитіл; відмивання колонки фосфатним буфером; елюцію IgM хлоридом магнію; відмивання колонки фосфатним буфером; переведення IgM у фосфатний буфер на сефадексі G-25. 4 UA 69272 U Комп’ютерна верстка В. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5