Спосіб імуноафінного виділення та очистки поверхневого антигену (hbsag) вірусу гепатиту в

Спосіб імуноафінного виділення та очистки поверхневого антигену (HBsAg) вірусу гепатиту В, в якому застосовується сироватка крові людини з високим вмістом HBsAg, який відрізняється тим, що сироватка послідовно пропускається через дві колонки: колонку з іммобілізованими моноклональними антитілами (МКАТ) миші, неспецифічними до HBsAg, і колонку зі специфічними анти-HBsAg МКАТ з подальшою елюцією HBsAg, які забезпечують найбільший вихід цільового продукту високого ступеня чистоти, придатного для імунізації тварин та використання в імуноаналізі. Корисна модель стосується імунології та вірусології і може бути використана для одержання поверхневого антигену вірусу гепатиту В (HBsAg). Відомі методи виділення HBsAg з використанням біохімічних та фізико-хімічних методів [1-3] Однак при одержанні HBsAg цими методами спостерігаються значні втрати HBsAg, а його чистота незадовільна для використання в Імуноаналізі В основу корисної моделі поставлено завдання розробити спосіб імуноафінного виділення та очистки HBsAg вірусу гепатиту В із сироватки крові людини хворої на гепатит В. У порівнянні з вищезгаданими методиками запропонована нами схема імуноафінного виділення й очистки HBsAg дає змогу одержувати добре відтворювані результати при використанні різних сироваток від осіб, заражених вірусом гепатиту В (ВГВ). Поставлене завдання вирішують шляхом послідовного пропущення сироватки крові з високим вмістом HBsAg через дві колонки: з імобілізованими моноклональними антитілами (МКАТ) миші, неспецифічними до HBsAg, і колонку з специфічними анти-HBsAg МКАТ з послідовною елюцією HBsAg. Оригінальна схема має відчутні переваги в порівнянні зі схемами, базованими на фізикохімічних методах виділення даного антигену, вона не вимагає значних кількостей сироватки, втрати цільового продукту зводяться до мінімуму, а методика в цілому простіша й безпечніша Ступінь чистоти HBsAg, одержуваного за розробленою схе мою, практично не змінюється від партії до партії і досягає 95-98%, що уможливлює його використання для імунізації тварин і застосування в імуноаналізі. У той же час втрати HBsAg при використанні гель-фільтрації та іонообмінної хроматографії становлять 60-70% [1, 2], а при використанні імуноафінноГ очистки - лише 10% Приклад 1. Спосіб отримання HBsAg Сироватку, що містить HBsAg, прогрівали ЗОхв при 56°С, фільтрували через фільтр з розмірами пор 0,8/0,22мкм і додавали 0,1% азиду натрію На першому етапі ЮОмл підготовленої сироватки пропускали через колонку №1 із імобілізованими МКАТ миші, неспецифічними до HBsAg, об'ємом Юмл зі швидкістю 2мл/хв. Елюат збирали та використовували на другому етапі виділення HBsAg Дану сироватку пропускали зі швидкістю 1мл/хв через імуноафінну колонку (колонка №2) об'ємом 7мл з іммобілізованими антиHBs МКАТ, клон 104С4 [4]. Колонку ретельно відмивали 0.02М фосфатним буфером з 0,15М NaCI (рН 7,2-7,4) зі швидкістю 2мл/хв. Елюцію HBsAg здійснювали з такою ж швидкістю слабокислим розчином 1,75М MgCI2 x Н2О та реєстрували вихід антигену спектрофотометрично при довжині хвилі 280нм Пік HBsAg збирали, а колонку відмивали фосфатним буфером протягом 20хв. зі швидкістю 2мл/хв. Приклад 2 Визначення концентрації HBsAg Концентрацію білку в препараті HBsAg визначали спектрофотометрично при 280нм (з огляду на, те що коефіцієнт екстинкції Е 01% =3,725). Окрім 00 ю 10589 цього, білок у препараті визначали за методом Бредфорда [5] з використанням як стандарту бичачого сироваткового альбуміну. Власне концентрацію HBsAg визначали шляхом титрування в імуноферментному аналізі. Для цього отриманий препарат титрували двократно проти стандартного HBsAg фірми "Chemicon" (США) у "сендвіч'-варіанті твердофазного імуноферментного аналізу Облік результатів проводили спектрофотометрично при довжині хвилі 492/620нм на приладі Multiscan ("Labsystems", Фінляндія). Враховуючи, що коефіцієнт екстинкції Е С1% =3,726, концентрація HBsAg у одержаному препараті становила 150мкг/мл. Таким чином, пропонований метод імуноафінного виділення та очистки HBsAg дозволяє без відчутних втрат одержувати даний антиген високого ступеню чистоти, придатний для імунізації тварин і використання в Імуноаналізі. Перелік літературних джерел: 1. Карелин В.П., Бабаева Е.Е., Будницкая П.З. Комп'ютерна верстка А. Крулевський и др. Выделение поверхностного антигена вируса гепатита В из плазмы крови доноров // Вопр. вирусол. - 1978. - №5. - С. 576-583. 2 Бакиров Р.Д., Карелин В.П. Методы количественного иммуноэлектрофореза для индикации и анализа поверхностного антигена вируса гепатита В // Вопр. вирусол. -1979, - №2. - С 118-125 3 Теория и практика иммуноферментного анализа / A.M. Егоров, А.П Осипов, Б.Б. Дзантиев, Е.М. Гаврилова - М.: „Высшая школа". -1991. - 288 с 4 Nikolaenko I.V., Rayevska G Y., Kostenko l.G. et al New monoclonal antibodies specific to HBsAg // Биоресурсы и вирусы. Тез докл. IV междунар научно-практической конференции (27-30 сент 2004 г., Киев). - К.1 Киевский университет. - 2004. - С. 154-155. 5. Справочник биохимика. Пер с англ. / Досон Р., Элиот Д., Элиот У , Джонс К. - М.: „Мир", 1991. 544 с. Підписне Тираж 26 грим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український-інститут промислової власності", вул. Глазунова, 1, м Київ - 42, 01601