Спосіб виділення інгібітора трипсиноподібних протеаз із відходів одержання гамаглобуліну та альбуміну донорської крові людини

Спосіб виділення інгібітора трипсиноподібних протеаз із відходів одержання гамаглобуліну із клітин живого організму шляхом іонообмінної та афінної хроматографій, який відрізняється тим, 3 89778 сах з подальшою афінною хроматографією. Десорбцію білків проводять фосфатним буфером та діалізом проти води з подальшою ліофільною сушкою. Відходи від одержання гамаглобуліну з донорської крові людини розтирають у стерильній холодній ступці з фосфатним буфером у відношенні 1:2 (1гр:2мл), після чого гомогенізують ультразвуком інтенсивністю 15-20мГц на протязі 30-60с, центрифугують при 10000об/хв на протязі 25-30 хвилин, при температурі +2°С÷+4°С, після чого піддають роз'єднанню протеази та інгібітора за допомогою іоннобмінної хроматографії на ДЕАЕ целюлозі. Очищення до гомогенного стану інгібітора протеаз проводять за допомогою гельфільтрації на сефадексах G-15 та G-50 з подальшою афінною хроматографією на трипсин - сефарозі 4В [2]. До цього слід підготувати імобілізований сорбент трипсин-сефарозу 4В. Відважують потрібну кількість активізованої сефарози 4В (1г смоли дає 3,5мл геля), відмивають декілька разів на фільтрі зі скла, використовуючи 1мМ НСІ (200мл/1г смоли), розчиняють трипсин у робочому буфері, використовуючи 0,1М НСІ (10-15мг на 1мл гелю), змішують розчин трипсину із суспензією гелю, ставлять в отріпувачі на дві години при кімнатній температурі. Після чого відмивають надлишок трипсину і блокують залишок активних груп, використовуючи 0,1Μ NaHCO3, який утримує 0,5М NaCl, потім відмивають надлишок трипсину на протязі двох годин 0,1М боратним буфером. У подальшому відмивають надлишок реагенту та адсорбованого білка (спочатку робочим буфером (0,1М NaHCO3 з 0,5М NaCl, а потім 0,1М ацетатним буфером рН 4,0, що утримує 0,5М NaCl). Одержаний кон'югат білка з сефарозою використовують для афінної хроматографії, для проведення якої використовують колонку фірми Pharmacia fine chemical розміром 10/10. Об'єм нанесеної проби може бути довільним, так як інгібітор трипсину міцно сорбірується з гелем. Афінну хроматографію проводять у 0,05М трис-НСІ буфері, рН 7,5. Десо Комп’ютерна верстка А. Рябко 4 рбцію білків проводять послідовно буферними розчинами, які утримують 1М НСІ, 8М сечовину з розчином 0,2М КСІ-НСІ з рН 2,0. Інгібітор елююється з колонки одним піком з використанням буфера 0,2М КСІ-НСІ рН 2,0. При вказаному розмірі колонки інгібітор видаляється у трьох фракціях (23, 24, 25, об'єм фракції при цьому - 2мл, час одержання фракції 5 хвилин, швидкість 0,4мл/хв). Всього при хроматографії зібрано 30 фракцій. Одержаний розчин інгібіторів трипсина ліофільно висушували. Інгібітор трипсину у фракціях визначали за ступенем гальмування гідролізу БАПНА (№-бензоіл - 1 аргенін - р - нітронілід) кристалічним трипсином (3). Електрофорез ізоформ інгібіторів проводили у 7,5% гелі у трисгліциновому буфері при рН 8,3 (4). Перевага запропонованого способу у порівнянні з існуючим прототипом полягає у тому, що у прототипі одержано інгібітор трипсиноподібних протеаз із легенів білих мишей, а у даному способі він виділений із відходів донорської крові людини при одержанні гамаглобуліну та альбуміну. Література: 1. UA, Патент на винахід №23548А, 6А 61К35/00, Бюл, №.31.08.98, ОДМУ, Дівоча В.А. Спосіб одержання інгібітора трипсиноподібних протеаз. 2. Выделение, очистка, биохимические свойства и биологическая роль ингибиторов зерна злаковых / Левицкий А.П., Вовчук С.В., Зелинский В.Г., Малиновский В.А., Пыльнева П.Н., Адамовская В.Г. // Химия протеолитических ферментов. Материалы II Всесоюзного симпозиума - Углич, 1999. - С.107. 3. Использование показателя ингибитора трипсина и химотрипсина в селекции кукурузы и ячменя. / Левицкий А.П., Вовчук С.В., Пыльнева П.Н. и др. // Методические рекомендации, 1984. 4. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacterio phage T4, 1970. - Nature 272. - P.680-685. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601