Лікувальний засіб “кальмофіл” для заміщувальної терапії сурфактантної системи легенів при її розладах та спосіб його одержання

1. Лікувальний засіб для заміщувальної терапії сурфактантної системи легенів при її розладах, який відрізняється тим, що він одержаний з морських гідробіонтів та містить біологічно активні речовини у комплексі фосфоліпіди з омега-3 поліненасиченими жирними кислотами (ПНЖК) та плазмалогенні фосфоліпіди: пламенілфосфатидилхолін і плазменілфосфатидилетаноламін, загальний холестерол, жирні кислоти, пептиди, амінокислоти, гепарин, вітамін Е в наступному співвідношенні компонентів, мас. %: фосфоліпіди 75-85 плазмалогенні фосфоліпіди: плазменілфосфатидилхолін і плазменілфосфатидилетаноламін 0,1-0,5 загальний холестерол 0,2-2,5 не більше пептиди 0,5 не більше вітамін Е 0,05 гепарин 0,1-0,15 жирні кислоти, амінокислоти решта. 2. Лікувальний засіб за п.1, який відрізняється тим, що одержаний з репродуктивних органів морських гідробіонтів. C2 2 (19) 1 3 76074 4 Аналіз сучасної інформації вказує, що сурфакни [4], які вводили дітям з дихальним синдромом. тант легенів є сумішшю ліпідів та білків, які синтеПри цьому не було виявлено побічних токсичних зуються і секретуються в альвеолярній рідині епіефектів. теліальними клітинами другого типу, що З встановленням факту, що штучний сурфаквистилають легеневі альвеоли та зменшують потант зменшує тяжкість захворювання дихальних верхневий натяг. Головна функція сурфактанту розладів і попереджує захворювання, проводиться зниження поверхневого натягу при стані легеніпошук і створення синтетичних сурфактантноподіповітря/рідина з утворенням поверхнево-активної бних засобів для лікування синдрому РДС. Для плівки, яка містить ліпідний моношар, збагачений отримання швидкого зниження поверхневого натядипальмітоїлфосфатидилхоліном (ДПФХ) до (40гу легенів можливе використання ліпідної суміші, 50)%. ДПФХ вміщує 2-насичені ацильні ланцюги. подібної легеневому сурфактанту in vivo, яка склаЛіпіди з ненасиченими жирними кислотами можуть дається з гетерогенної суміші ліпідів, що включає щільно пакуватись в моношари. Ненасичені ліпіди ДПФХ та інші фосфоліпіди з більш низькою темперозглядаються як дуже важливі для функції сурратурою плавлення. В зв'язку з цим є актуальним і фактанту в зв'язку з тим, що рідинність сурфактаннеобхідним пошук фосфоліпідних сумішей приротної плівки захищає плівку від жорсткості. До складного походження, які були б близькі за своїм ду поверхнево-активних речовин (ПАР) складом до сурфактанту і могли б використовувановонароджених дітей входять такі фракції фостися для лікування людини з недостатністю сурфоліпідів, як ДПФХ, фосфатидилетаноламін фактанту. (ФЕА), фосфатидилсерин (ФС), фосфатидилгліцеВідомо одержання штучного сурфактанту на рид (ФГ), сфінгомієлін (CM), фосфатидилінозитол основі ДПФХ або фосфоліпідної суміші в різних (Ф1), фосфатидна кислота. В складі жирних кислот концентраціях, до складу яких входять такі компорідинних фосфоліпідів найбільшу перевагу має ненти, як цукри, амінокислоти, спирти та жирні пальмітинова кислота. кислоти [5]. При клінічних і фармакологічних виОскільки ряд захворювань легенів є наслідком пробуваннях не всі штучні сурфактанти виявляють недостачі сурфактанту, основою специфічного високу ефективність. проявлення відомих препаратів-сурфактантів як Відомо декілька синтетичних сурфактантів природних, так і штучних є заміщувальна тера("Ecxoswf" - США [6], "Aiek" - Велика Британія), пія [1]. напівсинтетичні ("Survanta" - ROSS - США), прироДПФХ є єдиним міцним фактором зниження дні ("Куросурф" - США) [7]. поверхневого натягу, який відповідає за властивоВідомий патент, де представлено застосувансті зниження поверхневого натягу легеневого сурня сумішей фосфоліпідів і нейтральних ліпідів як фактанту сумісно з іншими фосфоліпідами, а тазаміщувальної сурфактантної терапії різних форм кож із сурфактантом апопротеїну (білкові РДС. Ці суміші показали значне підвищення поверечовини, що підсилюють адсорбцію сурфактанрхнево-активних ліпідів при використанні штучного ту). Вважається, що фосфатидилхолін (ФХ), ФЕА, сурфактанту [8]. ФГ і ФІ вносять значний вклад у підсилення власВідомо про компонент, що забезпечує активтивостей розповсюдження та адсорбції легеневого ність композицій - аналогів препаратів для заміщусурфактанту. вальної сурфактантної терапії легеневих захворюВідомо, що натуральний легеневий сурфаквань на основі гідрованого соєвого ФХ тант включає суміш багатьох сполук, де головним (фосфоліпон-90Н) як активного компоненту [9], що є дипальмітоїлФХ, а саме 1,2-дипальмітоїл,3забезпечує поверхнево-активні властивості препагліцероФХ – 41%, холестерол - біля 9%, суміш рату для заміщувальної сурфактантної терапії. білків – 9%, ФЕА – 5%. ФГ і ФС – 4%, ФІ – 2%, CM Відомо про вплив короткострокового ентера– 1%, жирні кислоти – 1%. Вказані компоненти мольного вживання омега-3 ліпідів на жирнокислотжуть бути використані при дихальній недостатносний склад легенів макрофагів і сурфактантні фості, яка є супутником "респіраторного дистресфоліпіди, що підтверджує швидку модифікацію синдрому" (РДС) у дорослих і дітей, який характемембранних фосфоліпідів і поліненасичених жирризується дефіцитом легеневого сурфактанту при них кислот (ЖК) [10]. захворюванні "гіалінових мембран" у новонароНа даний час є важливі досліди, які вказують, джених, а також при порушеннях біосинтетичних що дефіцит есенціальних ЖК та фосфоліпідів процесів в альвеолоцитах другого типу, що виробвпливає на розвиток різних захворювань і, в тому ляють сурфактант. Пошкодження сурфактанту числі, свідчать про проявлення клініки захворюможе викликатись як гіпоксією, так і гіпероксією, вання легенів і недостатність сурфактанту. Це моінфекцією дихальних шляхів. Широкий діапазон же бути пов'язано з відсутністю в організмі хворих етіологічних факторів підкреслює актуальність полі ненасичених ЖК та есенціальних фосфорпроблеми недостатності сурфактанту, яка може ліпідів [11]. виникнути в любому віці, особливо в реанімаційІснує гіпотеза, що низький рівень легеневих них хворих при штучній вентиляції легенів [2]. захворювань ескімосів є наслідком особливості Відомо про замісну терапію для відновлення харчування, в якому виявлено значний вміст втраченого сурфактанту тварин. В зв'язку з цим ПНЖК -3 та -6. виникає необхідність одержання штучних аналогів Імовірно, що ПНЖК переводять продукцію ейсурфактанту на основі підбору компонентів, які козаноїдів на інший шлях синтезу від арахідонової подібні за складом речовинам природного сурфаккислоти. Таким чином, відбувається зменшення танту. Показано позитивний вплив екзогенних супродукції бронхозвужуючих лейкотриєнів. Дослірфактантів із легенів корови [3] і амніотичної рідидження на тваринах показали, що додавання ей 5 76074 6 козапентаєнової (ЕПК) або гама-ліноленової кису якості заміщувальної терапії при розладах сислоти тваринам, які були під дією ендотоксинів, теми сурфактанту. Одержаний засіб забезпечує приводить до зменшення дії останніх на тромбокпідвищення поверхневої активності та зменшення сан В-2 і підвищує стійкість легеневих судин [12]. Є антигенних властивостей. деякі відомості про те, що додавання ЕПК привоПоставлена задача вирішується тим, що сподить до збільшення її вмісту у складі фосфоліпідів сіб одержання лікувального засобу (торговельна та до зменшення утворення лейкотриєнів у нейтмарка - "Кальмофіл") для відновлення порушень рофілах. У зв'язку з цим захисний вплив ПНЖК при сурфактантної системи людини, включає подріблегеневих хворобах біологічно ймовірний. Резульнення сировини репродуктивних органів морських тати епідеміологічних випробувань показали можгідробіонтів (молочко, ікра головоногих молюсків ливість захисних ефектів ПНЖК проти астми у кальмарів та морських риб) у замороженому стані, дітей і позитивні результати їх дії на бронхіти. Таекстракцію сировини етанолом, відокремлення кож показано, що споживання морських риб може етанольного екстракту від залишків сировини фізахистити від епідемій та хронічних бронхітів. В льтрацією, упарювання етанольного екстракту до останні роки омега-3 ПНЖК у вільному вигляді або остаточного видалення етанолу, очищення одерв складі риб'ячого жиру використовуються для жаної фракції від похідних вуглеводнів, ефірів ЖК, лікування деяких хвороб. Але відомо, що вільні продуктів окислення холестеролу та його ефірів омега-3 ПНЖК як нестабільні речовини можуть перерозчиненням ліпід-білкової фракції в гексані, окислюватися в препаратах і в організмі при недододаванням до гексанової фракції (5-15)%-го водстатності антиоксидантів. В той же час в складі ного розчину 10мМ СаСІ2 в етанолі у співвіднофосфоліпідів ПНЖК проявляють стабільну резисшенні 1:5 та 1:10, відокремлення гексанового шару тентність до окислювальної деградації [ІЗ]. Крім від спиртово-водної фракції, додавання до гексацього відомо, що омега-3 ПНЖК в дієті швидко нової фракції вітаміну Е до концентрації не менше включаються в мембрани фосфоліпідів альвеоля0,05% і після упарювання гексанової фракції одерних макрофагів, легенів і сурфактанту. Було таржані ліпіди суспендують протягом 30-60 хвилин в кож показано, що фосфоліпіди з омега-3 ПНЖК фізіологічному розчині, додають гепарин у співвідбільш активно включаються в мембрани клітин ніж ношенні ПАР-.фізіологічний розчинтепарин = вільні ЖК - ЕПК і ДГК. При цьому омега-3 ПНЖК 1:100:(0,1-0,115), а отримані ліпосоми ліофілізують специфічно збільшуються в мембранних фосфоліта одержують субстанцію кінцевого продукту. підах і не конкурують із зменшенням рівня арахіДо складу ПАР з гонад кальмарів входять: фодонової кислоти, яка є найбільш важливою омегасфоліпіди-(75-85)% серед яких основний - ФХ, що 6 у складі ЖК фосфоліпідів у біологічних мембравміщує до (27-35)% пальмітинової кислоти, (16нах у порівнянні з ейкозапентаєновою кислотою. 17)% ейкозапентаєнової кислоти, (17-18)% докозаВ основу винаходу поставлено розробку спогексаєнової кислоти, в тому числі плазмалогенні собу одержання лікувального засобу для відновфосфоліпіди (плазменілфосфатидилхолін і плазлення сурфактантної системи легенів при її розламенілфосфатидилетаноламін), які ефективно змедах шляхом застосування нового способу обробки ншують поверхневий натяг [14], загальний холесрепродуктивних органів із морських гідробіонтів терол (0,5-2,5)%, жирних кислот (0,1-0,5)%, для одержання природного поверхнево-активного вуглеводи (0,1-0,5)%, в том числі вільні ЖК (0,1лікарського засобу на основі комплексу фосфолі2,8)%, амінокислоти (5-7мг/мл), вітамін Е не більпідів із омега-3 ПНЖК у структурі, що включають ше 0,05 %, гепарин (0,1-0,15)% [2]. плазмалогенні фосфоліпіди, регуляторні короткоПри дослідженні складу компонентів сурфакланцюгові пептиди та амінокислоти, якому притатанту - поверхнево-активних речовин (ПАР) з морманні поверхнево-активні властивості сурфактанту ських організмів виявлена їх подібність до складу і який, таким чином, виявляє позитивні властивості ПАР, вилучених з тканин легенів (таблиця 1, 2). Таблиця 1 Якісний та кількісний склад компонентів ПАР Компоненти ПАР з морських організмів, що мають властивості сурфактанту Назва компоненту Фосфоліпіди Загальний холестерин Вільні жирні кислоти Похідні вуглеводнів Пептиди, не більше Фосфатидилхолін Фосфатидилетаноламін Сфінгомієлін Фосфатидилгліцерид Фосфатидилінозитол Фосфатидилсерин Плазмалогени (плазменілфосфатидилетаноламін, плазменілфосфатидилхолін) Вуглеводи Гепарин (ПАР: фізіологічний розчинтепарин) Вітамін Е, не більше Вміст, % 75-85 0,2-2,5 0,1-2,8 0,1-0,3 0,5 72-87 7,0-12,8 5,7-9,0 0,4-8,0 1,5-2,2 0,6-1,2 0,1-0,5 0,1-0,5 1:100:(0,1-0,15) 0,05 Компоненти ПАР з легеневої тканини тварин Назва компоненту Вміст, % Фосфоліпіди 68,6-90,7 Загальний холестерин 0-8,0 Вільні жирні кислоти 1,0-27,7 Вуглеводні 0,1-2,0 Білок 1,0-3,0 Фосфатидилхолін 58,4-85,0 Фосфатидилетаноламін 2,6-3,5 Сфінгомієлін 3,2-12,0 Фосфатидилгліцерид 0,1-12,0 Фосфатидилінозитол 1,2-6,6 Фосфатидилсерин 1,0-6,4 Вуглеводи 7 76074 8 Таблиця 2 Характеристика "сурфактанту", отриманого з гонад кальмару Досліджувані фракції ПАР фосфоліпідів /сурфактант/ Вміст неорганічного фосфору, мкг/мл 300-400 Сукупність визначених авторами операцій способу, його режимів застосування схем і обробки репродуктивних тканин морських головоногих молюсків (кальмари) дозволяє одержати засіб з новим спектром властивостей та вирішити поставлену задачу. Застосування операцій способу приводить до наступних переваг: - використання відходів рибної промисловості як сировини; - використання репродуктивних органів морських головоногих - молюсків (кальмарів) дозволяє одержати значний вміст фосфоліпідів з омега-3 ПНЖК, серед яких головним є ДПФХ з пальмітиновою кислотою та омега-3 ПНЖК в структурі, а також плазмалогенних фосфоліпідів (плазменілФЕА і плазменілФХ), цінних амінокислот, включаючи значний вміст аргиніну, гліцину, а також глютамінової кислоти, які мають відношення до коротколанцюгових пептидів та пептидних біорегуляторів, які підвищують сурфактантноподібні властивості засобу; - за рахунок маніпуляції з перерозчиненням екстракту в гексані з додаванням водного розчину 10мМ CaCl2 в етанолі вдається видалити значну кількість ефірів холестеролу, жирних кислот та вуглеводнів, що покращує якість субстанції; - перевага нового способу полягає в тому, що одержана субстанція містить комплекс фосфоліпідів з омега-3 ПНЖК, серед яких основний ДПФХ містить до (35-50)% пальмітинової кислоти, до 20% докозагексаєнової кислоти, (10-15)% ЕПК, причому всі фосфоліпіди одержаного комплексу вміщують пальмітинову кислоту; - одержана субстанція містить регуляторні пептиди, амінокислоти, незначну кількість білку, в зв'язку з чим одержаний препарат не має побічної дії і не проявляє антигенних властивостей по відношенню до місцевих клітинних імунних реакцій в легенях про що свідчать експериментальні дослідження інгаляційного введення препарату щурам з подальшим гістохімічним вивченням макрофагів. Число макрофагів при дії сурфактанту протягом 1 години та 1, 3, 7 діб не відрізняється від контролю. Наведені дані про відсутність антигенності препарату можуть бути обумовлені присутністю тільки невеликої домішки білку (0,1-0,5)% в препараті, що є позитивним фактором. Використання вказаного способу має такі переваги: - значний вихід (до 8 %) біологічних ПАР із відходів морських організмів (репродуктивних органів кальмарів) у порівнянні з ПАР із легеневої тканини ссавців (до 1,5%); - покращення якості очистки за рахунок перерозчинення біологічних ПАР в гексані з додаванням спиртового розчину СаСІ2; - проведення операції суспендування ліпідних компонентів для одержання ліпосом; Вміст азоту, мкг/мл 140-160 Вміст загальних ліпідів, мг/мл 3,5-5,0 Вміст амінокислот у гідролізаті, мкг/мл 5-7 - додавання до суміші ПАР гепарину, який покращує мікроциркуляцію кровообігу та стабілізує низькодисперсну структуру ліпосомного препарату; - наявність у фракції фосфоліпідів значної кількості плазмалогенів пояснює підвищення поверхневої активності сурфактантом з морських організмі; - спрощення способу одержання препарату; - одержана субстанція за рахунок фосфоліпідів з омега-3 ПНЖК в структурі має мембраннопротекторні та імунно-модулюючі властивості, відновлює недостатність ПНЖК в організмі - докозагексаєнової і ейкозапентаєнової та регулює вміст арахідонової кислоти, яка має відношення до синтезу простагландинів в організмі. Короткострокове збагачення організму препаратом з фосфоліпідами омега-3 ПНЖК надає швидку модуляцію мембранних фосфоліпідів легеневих тканин, альвеолярних макрофагів, легеневого сурфактанту. Основою створеного комплексу є фосфоліпіди, серед яких головний є ДПФХ з омега-3 ПНЖК в структурі, плазмалогенні фосфоліпіди - плазменілФХ і плазменілФЕА із значною кількістю докозагексаєнової кислоти в структурі, які ефективно зменшують поверхневий натяг і стабілізують гексагональну структуру ФЛ та покращують поверхневу активність сурфактантноподібної фосфоліпідної суміші [14]. До цього комплексу входять також вільні амінокислоти із значним вмістом лізину, аргиніну, гліцину, глютамінової кислоти, які є біологічно активними речовинами, вітамін Е і гепарин. Усунення новим способом одночасно значної кількості небажаних ліпідів у комплексі з білком дозволяє виділити субстанцію, яка за складом біологічно активних речовин має відношення до відновлення порушень функції сурфактантної системи організму і лікування легеневих захворювань, недостатності сурфактанту в організмі, хвороби гіалінових мембран новонароджених. Суть винаходу полягає в тому, що для заміщувальної терапії легеневих захворювань та при недостатності сурфактанту особливо у новонароджених вперше виділена субстанція біологічно активних речовин з морських організмів (фосфоліпіди з омега-3 ПНЖК в структурі - сурфактантноподібний комплекс), яка використовується для заміщувальної терапії легеневих захворювань, що ілюструється конкретними прикладами його здійснення та результатами дослідження одержаного кінцевого продукту - субстанції препарату. Приклад 1 100г гонад кальмарів (молочко і ікра ) подрібнюють в замороженому стані на м'ясорубці, заливають 10 об'ємами етанолу, перемішують 3 години в реакторі з мішалкою, далі екстракт фільтрують, випаровують у вакуумі до повного видалення спирту. Одержану фракцію перерозчинюють в гек 9 76074 10 сані у співвідношенні 1:5 при температурі (25одержання лікарської форми препарату. Вихід 30)°С. У гексановий розчин додають 5%-й водний 7,0г (7%). розчин 10мМ СаСІ2 в етанолі. Осад, що містить Приклад 4 домішки білків і нейтральних ліпідів, після відстоДослідження дії фосфоліпідного препарату з ювання відокремлюють, а в гексановий розчин морських організмів як сурфактанту. додають вітамін Е у кількості не менше 0,05%, Проведення випробувань відбувалось в навипарюють у вакуумі та одержують ліпідну фракступних направленнях: цію, яку суспендують протягом 30 хвилин у фізіо- модулювання процесів інтоксикації, що призлогічному розчині, додають гепарин у кількості водить до порушень властивостей сурфактантної 0,1%, ліофілізують і отримують субстанцію, яку системи легенів і завершується літальним кінцем використовують для одержання лікарської форми без застосування спеціальної терапії; препарату. Вихід - 8г (8%). - застосування речовини із властивостями суПриклад 2 рфактанту шляхом інгаляційної дії на експеримен100г ікри кальмарів подрібнюють в заморожетальних тваринах; ному стані на м'ясорубці, заливають 10 об'ємами - спостереження за станом тварин (кількість етанолу, перемішують 3 години в реакторі з мішазагиблих, показники стану сурфактантної системи лкою, далі екстракт фільтрують, випарюють у валегенів); куумі до повного видалення спирту. Одержану - розробка рекомендацій по застосуванню фракцію перерозчинюють в гексані у співвіднопрепарату, одержаного з відходів переробки кальшенні 1:10 при температурі (25-30)°С. У гексаномарів (гонади) для аерогенного впливу в умовах вий розчин додають 10%-й водний розчин 10мМ інтоксикації. СаСІ2 в етанолі. Осад, що містить домішки білків і При проведенні досліду вимірюють наступні нейтральних ліпідів, після відстоювання відокремпоказники: загибель тварин, зміни маси тіла, знилюють, а в гексановий розчин додають вітамін Е у ження величини поверхневого натягу сурфактанту кількості не менш 0,05%, випарюють у вакуумі та легенів (сталагнометрично), кількість альвеоляродержують ліпідну фракцію, яку суспендують проних макрофагів в трахеобронхіальному лаваші, тягом 30 хвилин у фізіологічному розчині, додають клітинна реакція сурфактантної системи легенів, гепарин у кількості 0,15%, ліофілізують і отримустан функції легенів за показниками об'єму піни, ють субстанцію, яку використовують для одержанчасу випарювання. ня лікарської форми препарату. Вихід - 7,5г (7,5%). В дослідах для інгаляційного впливу викорисПриклад 3 товують білих щурів на звичайному раціоні. Час 100г молочка кальмарів подрібнюють у замоспостереження за тваринами -14 діб з моменту роженому стані на м'ясорубці, заливають 10 об'ємодулювання токсичного процесу. Речовина з мами етанолу, перемішують 3 години в реакторі з властивостями сурфактанту застосовується для мішалкою, далі екстракт фільтрують, випарюють у інгаляції в 1% - та 10%-му розчині на етанолі. Кільвакуумі до повного видалення спирту. Одержану кість речовини для інгаляції не перевищує фракцію перерозчинюють в гексані у співвідно0,25мл/хв. Розмір часток, що інгалюються, складає шенні 1:5 при температурі (25-30)°С. У розчин геквід 0,03 до 3,0мкм. В контрольних експериментах сану додають (5-15)%-й водний розчин 10мМ Савстановлена відсутність інгаляційного впливу на СІ2 в етанолі. Осад, що містить домішки білків і повадки та на тривалість життя щурів з масою тіла нейтральних ліпідів, після відстоювання відокремвід 185,0 до 210,0г. люють, а в розчин гексану додають вітамін Е у В результаті застосування речовини з властикількості не менш 0,05% і випарюють у вакуумі. востями сурфактанту при максимальних ознаках Одержану ліпідну фракцію суспендують протягом інтоксикації без застосування інших спеціальних 30 хвилин у фізіологічному розчині, додають гепаметодів антидотної терапії виживання щурів в дорин у кількості 0,15% для покращення мікроциркусліджуваних групах зросло відповідно - при мепроляціїї кровообігу, одержаний розчин ліофілізують і тановій, аміачній і бензиновій інтоксикаціях на 40, отримують субстанцію, яку використовують для 35 і 50 % (табл. 3 ). Таблиця 3 Поверхнево - активні властивості легенів експериментальних тварин Інтоксикація Мепротан Аміак Бензин Контроль без дії ФАР*** ІСТ 50* Макро фаги, 1 10-3,мл 7,8±1,7 6,4±0,9 8,2±1,02 15,2±0,66 ПН**, 1 10-3, н/м 54,9±0,7 51,3±1,6 49,9±0,5 40,1±0,3 ІСТ50 + речовина з властивостями сурфактанту в інгаляції ПН, Макро фаги, 1 10-3, н/м 1 10-3, мл 14,7±2,5 42,2±2,7 13,8±0,6 42,0±0,9 15,8±0,3 47,6±0,8 ІСТ 50 + антифомсилан ПН, 1 10-3, н/м 9,3±0,7 10,9±0,5 14,3±1,2 Макро фаги, 1 10-3, мл 47,3±1,6 48,1±2,0 48,2±0,9 * - ІСТ - інгаляційна доза токсичності; ** - ПН - поверхневий натяг; *** - ФАР - фізіологічно активна речовина. Токсикологічну оцінку нового препарату - штучного сурфактанту з гонад кальмару - вивчали шляхом інгаляційного введення за допомогою приладу ПАІ-2 білим щурам (вагою тіла 195,6±4,5г) та білим мишам (вагою тіла 23,4±1,7г) протягом 7 діб в інтервалах 1 година, 1, 3, 7 діб. В кожну з 4 11 76074 12 груп брали по 10 тварин. Масові концентрації аевпливу препарату. Встановлено, що для білих щурозолю препарату в межах від 33333,0мг/м3 до 666 рів середня летальна концентрація складає мг/м3 підтримують протягом 4 годин інгаляційного 11200,0±606,4мг/м3, а для білих мишей впливу для щурів і 2 години для мишей. До інгаля8000±542,0мг/м3. У відповідності з вимогами ДЕСТ ції і після неї тварини знаходяться в умовах зви12.1.007-76 препарат відноситься до 3 класу небечайного лабораторного утримання. Клінічні дослізпечності при інгаляційному впливі і є сполукою з ди за станом тварин і розподілом загибелі тварин помірно небезпечними властивостями (табл. 4). проводять протягом 14 діб з моменту інгаляційного Таблиця 4 Токсикологічна характеристика дії сурфактанту з гонад кальмару Шляхи введення ЛД50 Дигестивне введення ЛД50 Аплікація на шкірі ЛД50 Інгаляція Тип тварин Вміст сурфактанту з гонад кальмару Миші 3300±36,6 мг/кг Щури 4800±127,5 мг/кг Миші Більше 2500 мг/кг Щури Більше 2500 мг/кг Миші 14700±433,6 мг/кг Щури 32500±2333,3 мг/м3 3 клас небезпечності за ДЕСТ 12.1.007-76 Фармакологічну оцінку сурфактанту, отриманого з гонад кальмару, проводять в умовах його інгаляційного введення. Концентрація препарату, який вводиться аерозольне, була кратна одній десятій середньолетальної дози для білих щурів вагою тіла 195,6±4,5г. Дослід проводять в динаміці (1 година, 1, 3, 7 діб). В групи брали по 10 тварин. Концентрація аерозолю препарату Клас небезпечності Повільно небезпечний -"Мало небезпечний -"Повільно небезпечний -" (1120,0±254,3мг/м3) підтримується в камері протягом 4 годин інгаляційного впливу. В умовах описаного досліду загибелі піддослідних тварин не зареєстровано. Як після інгаляції, так і протягом спостереження тварини відчували себе задовільно. Аерозольний вплив не приводить до наявних розладів з боку органів та систем (табл. 5). Таблиця 5 Стан кондиціонерної та гідродинамікорегуляторної функції Показники стану Об'єм піни, см3 При інгаляції сурфактанту Час випарення сурфактанту, мл/хв При інгаляції речовини, яка має властивості сурфактанту Досліди з перевірки препарату "Кальмофіл" на поверхневий натяг та сурфактантну дію проведені американськими дослідниками Університету (Каліфорнія, Лос-Анжелес) з препаратами - стандартами для замісної сурфактантної терапії "Survanta" та "Exosurf США. Показано близьку активність "Кальмофілу" до вказаних стандартів. При застосуванні препарату "Кальмофіл" порівняно з контролем підвищується виживання тварин. В дослідах in vivo та in vitro при токсичній дії окислювального стресу, індукованого гострим отруєнням CCl4, вве Контроль 1,32±0,09 1,09±0,08 0,0090±0,0001 0,0080±0,0001 Мепротан 5,9±0,6 2,3±0,8 0,030±0,001 0,0070±0,0001 Аміак 24,7±1,5 5,3±0,8 0,050±0,002 0,010±0,002 Бензин 32,4±0,8 6,9±0,9 0,020±0,001 0,0090±0,0002 дення препарату знижує токсичну дію метаболічної отрути, позитивно впливає на виживання тварин, знижує інтенсивність перекисного окислення ліпідів (ПОЛ), корегує токсичний вплив ССІ4. Дослідження in vivo властивостей сурфактанту на недоношених кроликах з недостатністю сурфактанту, проведені в порівнянні з препаратамистандартами "Survanta" та "Exosurf", показали зниження рівня респіраторного тиску легенів (табл. 6). Таблиця 6 Специфічна дія лікувального засобу "Кальмофіл" Препарат "Кальмофіл" Сурфактант тварин ССІ4 СОД Препарат-стандарт "Survanta" Препарат-стандарт "Exosurf Параметри вимірювання Поверхневий натяг, Виживання тварин при інтоксикації. Активність (АО*, (дин/см) Захисний індекс (одиниці) ПОЛ, СОД**), % In vivo: ПОЛ-153 Мін. - 11,7 1,5-2,0 СОД-72 Макс. - 48,5 in vitro: АО-50 Мін. - 10,3 Макс. - 42,3 In vivo: 265 In vivo: 46 Мін. - 4,1 Макс. - 37,5 Мін. - 21,0 Макс. - 67,5 Пік респіра торного тиску легенів 24,9±1,1 21,2±1,1 21,2±1,1 13 Вітамін Е Фосфоліпідна фракція тканин легенів 76074 14 АО - 53 АО - 17 * - АО - антиоксидантна активність ** - СОД - супероксиддисмутазна активність Досліджуваний препарат ПАР є інтактним відносно функціональної активності та морфології макрофагів легенів. Він не виявляє антигенних властивостей відносно місцевих клітинних імунних реакцій в легенях, про що свідчить структурна та функціональна стабільність легеневих макрофагів та експериментальні досліди з інгаляційного введення препарату щурам при послідовному гістохімічному вивченні макрофагальної функції. Число макрофагів при дії сурфактанту протягом інтервалів часу 1 година, 1, 3, 7 діб не відрізнялись від контрольних. Одержані дані про відсутність антигенності препарату можуть бути обумовлені присутністю лише незначної домішки білку (0,1-0,5%) в препараті, що є позитивним фактором. При використанні наведеного способу досягаються наступні переваги: - підвищується вихід ПАР з гонад кальмару основи штучного сурфактанту (до 8%) в порівнянні з ПАР, одержаних з тканин легенів телят (до 1,0%) [3]; - спрощується спосіб одержання цільового продукту; - ефективно зменшується поверхневий натяг при наявності плазмалогенів (плазменілФЕА і плазменілФХ), що діють як антиоксиданти проти ліпідної пероксидації, а також як антиоксиданти ліпопротеінів низької щільності; - вітамін Е захищає як ліпідні компоненти, так і білки сурфактанту легенів від оксидактивного окислення; - покращується мікроциркуляція кровообігу з додаванням гепарину; - покращуються властивості сурфактанту при інгаляційному застосуванні завдяки додаванню іонів Са2+ на стадії очистки препарату, що сприяє кращій адсорбції сурфактанту поверхністю легень і розправленню впалих альвеол. При інгаляційному введенні препарату ПАР з гонад морських організмів, одержаного за новим способом, досягається наступний ефект: - підвищується поверхнева активність легенів у тварин за рахунок зниження поверхневого натягу до нормальних показників (48,5 та 11,7дин/см); - практично не змінюється в порівнянні з контролем кількість альвеолярних макрофагів протягом досліджуваного періоду (6,5-6,9 10-3 макрофагів в мл). Одержані результати свідчать про доцільність винаходу для подальшого застосування в практиці лікування хворих. Одержаний лікувальний засіб "Кальмофіл" доцільно використовувати в ургентній токсикологічній практиці при порушенні функцій Комп’ютерна верстка Т. Чепелева сурфактантної системи легенів. Одноразове застосування сурфактантноподібної речовини з морських організмів не виявляє відхилень у нормальних тварин, а в умовах інтоксикації сприяє нормалізації порушень функції легенів: знижує інтенсивність процесів ціноутворення, нормалізує клітинну реакцію сурфактанту легенів і певним чином полегшує протікання токсичного процесу. Таким чином, запропонований винахід вирішує задачу одержання з гонад морських організмів лікувального засобу "Кальмофіл", до складу якого входять фосфоліпіди з омега-3 ПНЖК, плазмалогенні фосфоліпіди, регуляторні пептиди, амінокислоти, вітамін Е та гепарин. Створений комплекс біологічно активних речовин має адаптогенні та антиоксидантні властивості. Одержаний запропонованим способом лікарський засіб "Кальмофіл" може бути застосований для відновлення функції сурфактантної системи легенів людини при її розладах шляхом заміщувальної терапії. СПИСОК ПОСИЛАНЬ: 1. USA 5032585 Jul.16, 1991. 2. Березовский В.А. Возможности коррекции состояния сурфактантной системы. Врачебное дело, 1984, № 41, с. 107-111. 3. RU 2198670 СІ 20.02.2003. 4. RU 2066197 СІ 10.09.1996. 5. ЕР 0286011А2 12.16.88. 6. USA 5110866 1992. 7. Гребенников В.А. Респираторный дистресссиндром у новорожденных. М., 1995. 8. ДЕ 2900300 (Keitzing LV). JP 58222022 (Teijin К). ЕР 110498. USA 4312860. 9. RU 2213746 СІ 10.10.2003. 10. Palombo JD, Lydon E-E, Chen - PI et al. Fatty acid composition of lung, macrophage and surfactant phospolipids after short-term enteral feeding with n-3 lipids. - Lipids. - 1994. - 29,9. - p. 643 - 649. 11. Carrie I, Clement М, de Javel D at al. Phospholipid supplementation reverses behavioral and biochemical alterations induced by n-3 polyunsaturated fatty acid deficiency in mice. J Lipid Res 2000 Mar,41(3):473-480. 12. Lessons from the story of n-3 fatty acids. N-3 fatty acids. Role of polyunsaturated fatty acids in lung discase.Am .J. Clin. Nutr. 2000, 71, (1S):1S-398S. 13. Song J.H., Jhoul Y., Miyazawa Т., Biosci. Biotechnol. Biochem. 1997,01, № 12. 14. M.Rudiger, Kolleck, Puiz at al. Plasmalogens effectively reduce the surface tension of surfactant like phospholipid mixtures. Amer. J. Phisiol., 1998, v.274, 1, L.143-148. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601