Спосіб одержання та виділення білка, що має активність фактора viii та лінії клітин людини, що експресують білок, що має активність фактора viii

1. Спосіб одержання та виділення білка, що має активність фактора VIII, який передбачає ви C2 2 UA 1 3 77383 4 Галузь: Даний винахід відноситься до покраприсутня в одному міллілітрі плазми. Один пг факщеного методу одержання фактора VIII та його тора VIII, взагалі, є еквівалентним приблизно 5 похідних. Взагалі, метод відноситься до конструкмікроодиницям активності FVIII. ції вектора, трансфекції та селекції клітинних ліній Як використовується у контексті даної заявки, з покращеною продуктивністю в умовах відсутності білок, що має прокоагулянтну активність фактора білка. Зокрема, цей винахід пов'язаний зі спосоVIII, є білком, який зумовлює активацію фактора X бом одержання білка з прокоагулянтною активнісу модельних системах in vitro або in vivo. Як приктю фактора VIII у промислових масштабах. лади, що не обмежують даний винахід, це визнаПередумови: Людський фактор VIII представчення включає повну довжину рекомбінантного ляє собою глікопротеїн, що міститься у слідовій людського фактора VIII та фактор VIII з делетовакількості в плазмі крові, та втягнений як кофактор у ним доменом В, послідовність якого наведена на процес активації фактора X та фактора ІХа. УспаФігурі 1. дкована недостатність фактора VIII приводить до Високий рівень експресії білка, що має прокоаХ-зв'язаного розладу кровотечі гемофілії А, яка гулянтну активність фактора VIII, означає принайможе успішно лікуватись за допомогою очищеного мні близько 2мікроодиниць/кл/день, або бажано фактора VIII. Замісна терапія гемофілії А розвивапринаймні близько 4мікроодиниць/кл/день, або лася від використання фактора VIII, що одержаний найбільш бажано принаймні близько з плазми крові, до використання рекомбінантного 5мікроодиниць/кл/день активності фактора VIII при фактора VIII, одержаного шляхом клонування та вирощуванні на середовищі, що походить від плаекспресії кДНК фактора VIII у клітинах ссавців зми крові, та не містить білків, або принаймні бли[Wood et al., 1984, Nature 312:330]. зько 4 мікроодиниць/кл/день, або бажано принайФактор VIII має наступну організації доменів: мні близько 8мікроодиниць/кп/д, або найбільш А1-А2-В-А3-С1-С2, та синтезується як єдиний ланбажано принаймні близько 10мікроодиниць/к/д цюг поліпептиду, що складається з 2351 амінокисактивності фактора VIII при вирощуванні на серелоти, з яких 19 амінокислот сигнального пептиду довищі, забезпеченому білками, що походять з вирізуються під час перенесення у структури енплазми крові. Якщо білок, що експресується, є доплазматичного ретикулума. Завдяки тому факBDD-FVIII, клітинні лінії, що мають специфічну ту, що фактор VIII є сильно глікозильованим, склапродуктивність більшу від приблизно дно досягти його експресії на високому рівні 15мікроодиниць/кл/день, бажано більшу від приб(>0,2пг/клітина/день) [Lind et al., 1995, Eur J. лизно 20мікроодиниць/кл/день, одержують метоBiochem. 232: 19-27; Kaufman et al., 1989, Mol.Cell дом, що описаний у даній заявці. Biol. 9: 1233-1242]. Рівень експресії фактора VIII у Як використовується у контексті даної заявки клітинах ссавців є типово на 2-3 порядки нижчим, для опису походження клітинних ліній, термін «поніж той, який спостерігають з іншими генами, при ходять від» включає, але не обмежений, нормальвикористанні тих. самих векторів та підходів. Проний мітотичний поділ клітин та такі процеси як дуктивність утворення фактора VIII клітинними трансфекція, злиття клітин, або інші способи генелініями знаходиться на рівні 0,5тичної інженерії, що використовуються для зміни 1мікроодиниць/кл/день (0,1-0,2пг/кл/день). клітин або одержання клітин з новими властивосБуло продемонстровано, що В-домен фактора тями. VIII є несуттєвим для прокоагулянтної активності. Фігура 1. Амінокислотна послідовність BDDВикористовуючи вкорочені варіанти фактора VIII, FVIII (SEQ ID NO:1). рядом груп вчених була описана покращена ексФігура 2. Послідовність термінальної ділянки, пресії фактора VIII у клітинах ссавців [Lind et al., що повторюється, ізольованої з вірусу Епштейна1995, Eur. J. Biochem 232:19-27; Tajima et al., 1990, Барр (SEQ ID NO:2). Proc 6th Int. Symp. H.T. p.51-63; Патент США Фігура 3. Карта плазміди pCIS25DTR. №5,661,008, Almstedt, 1997]. Проте рівень експреФігура 4(а). Походження клону 20В8. сії варіантів фактора VIII залишився нижчим Фігура 4(b). Порівняння продуктивностей декі1пг/кл/день у стабільному клітинному клоні. лькох клонів у різних середовищах. Три точки даНами було відкрито (і) спосіб одержання кліних представлені двохмісячним тестом на стабільтинних ліній з дуже високою продуктивністю білків, ність для кожного клону. що мають прокоагулянтну активність фактора VIII, Фігура 5. Об'ємна продуктивність клону 20В8. та (іі) спосіб одержання білків, що мають прокоаСпецифічні втілення гулянтну активність фактора VIII, в умовах відсутАналіз FVIII ності білків плазми. Активність фактора VIII, одержаного шляхом Спосіб одержання білків, що мають прокоагуекспресії рекомбінантного гена у популяції метотлянтну активність Фактора VIII у промислових марексат (МТХ)-стійких клітин, вимірювали за допосштабах. Використовуючи створену клітину-хазяїн, могою хроматографічного аналізу. Активність кільбули одержані клітинні клони зі специфічною прокісно оцінювали при використанні Coatest дуктивністю, що коливається у межах 2фактор VIII:C/4 набору (Cromogenix, Molndal, 4пг/кл/день (10-20мікроодиниць/кл/день). В умовах Sweden) згідно з інструкціями виробника. Стандавідсутності сироватки один клон підтримував дортний американський антигемофілічний фактор бову продуктивність на рівні 2-4пг/кл/день. Клони з (фактор VIII), що відомий як MEGA 1 (Office of таким високим рівнем продуктивності здатні вироBiologies Research and Review, Bethesda, MD), вибляти 3-4 мільйони одиниць на день у перфузійкористовували як стандарт для вимірювання у ному ферментаторі місткістю 15 літрів. Одна одицьому аналізі. [Див. Barrowcliffe, 1993, Thromb. ниця активності фактора VIII за визначенням Haem 70: 876]. 5 77383 6 Конструкція експресійних векторів для FVIII, ни трансфікували, використовуючи катіонний ліпіщо має делетований В-домен дний реагент DMRIE-C (Life Technologies, Послідовність FVIII, що має делетований ВGaithersburg, MD), згідно з прописом Life домен (BDD), представлена на Фігурі 1. Ланцюги Technologies. Ампліфікацію трансфікованих клітин масою 90кДа та 80кДа з'єднували за допомогою виконували з концентраціями метотрексату (МТХ), лінкера, що складається з 14 амінокислот. [Див. що збільшуються (100нМ, 200нМ, 400нМ та Chan, S.-Y., «Одержання рекомбінантного фактора 800нМ), при 1x106 клітин на 96 комірковий планшет VIII у присутності ліпосомо-подібних речовин зміу МТХ-селективному середовищі, в якому відсутній шаних композицій», патентна заявка США гіпоксантин та тімідин (DME/F12 середовище без №08/634,001, подана 16 квітня 1996 року]. Експрегіпоксантину та тімідину плюс 5% діалізована фесійний вектор для BDD-FVIII готували при використальна сироватка великої рогатої худоби з танні стандартних методів рекомбінантної ДНК. Hyclone, Logan, UT). Визначали ріст МТХ-стійких Структура експресійного вектора (pCIS25DTR) клітин, а скрінінг на секрецію BDD-FVIII виконувапредставлена на Фігурі 3. Вектор включає транскли, використовуючи Coatest® фактор VIII набір рипційну одиницю для BDD-FVIII та селективний через приблизно 2-3 тижні після трансфекції. Кумаркер, дигідрофолат редуктазу (dhfr). Крім того, льтивування клітин виконували при 37°С в інкубадля збільшення інтеграційної ефективності у векторі, зволоженому 5% СО2. тор вбудовували повторювану термінальну посліКлонування обмежуючим розведенням довність з вірусу Епштейна Барр, яка демонструє Одиничні клітинні клони (SCC) розмножували поліпшене відношення селекції ліків (Фігура 2). шляхом клонування обмежуючим розведенням Вектор представляє собою суттєво конструкцію (LDC) високопродуктивних популяцій у 96 комірковектора (депозитний номер АТСС 98879), який вих планшетах в умовах відсутності сироватки. було створено для включення транскрипційної Клітини висівали у кількості 1-10 клітин на пробірку одиниці, що відповідає послідовності, представлеу DMF/F12 середовище, забезпечене Humulin® ної на Фігурі 1. Додаткову інформацію стосовно рекомбінантним інсуліном (Lilly, Indianopolis, IN) повторюваної термінальної послідовності можна при 10мкг/мл, 10 x основними амінокислотами (Life знайти у пов'язаній з даною патентній заявці, що Technology, Gaithersburg, MD), та Plasmanate® введена в опис як посилання, та відноситься до людською білковою фракцією плазми (Bayer, заявки Cho та Chan, позначеної як MSB-7254, Clayton, NC). Plasmanate® білкова фракція плазми «Термінальна повторювана послідовність вірусу (HPP) (Bayer, Clayton, NC) містить альбумін (88%) Епштейна-Барр, що покращує відношення селекції та різні глобуліни (12%). Клони відбирали на проліків», яка подана у той самий день, що і дана заядуктивність BDD-FVIII, використовуючи набори вка. Coatest ® фактор VIII. Клони з найвищою продукПодібні вектори можуть бути сконструйовані та тивністю відбирали на стабільність у качалочних використані спеціалістами у даній галузі для одепробірках. Для НКВ клітин перший круг LDS проржання клітин, що експресують білки, які мають водили, використовуючи селективне середовище, прокоагулянтну активність фактора VIII. Напризбагачене 5% діалізованим FBS. Другий круг LDS клад, кодуючі послідовності, що кодують відомі проводили у вільному від сироватки Plasmanate® варіанти фактора VIII, та зберігають його прокоаHPP середовищі, що містить фракцію при викоригулянтну активність, можуть бути заміщені на костанні першого SCC, адаптованого до вільного від дуючу послідовність BDD-FVIII. Також, замість dhfr, сироватки середовища, та забезпеченого можуть використовуватись інші селективні маркеPlasmanate® HPP фракцією ри, такі як глутамін синтетаза (gs) або ген надання Походження НКВ клону 20В8 стійкості до різних ліків (mdr). Вибір селективного Як підсумовано на Фігурі 4(а), початкова попуагента повинен бути зроблений відповідним чиляція 1С 10 походила від НКВ клітин, трансфікованом, як це відомо у даній галузі техніки, тобто для них pCIS25DTR після ампліфікації 400нМ МТХ у dhfr бажаним селективним агентом є метотрексат, селективному середовищі з 5% FBS. Один з пердля gs бажаним селективним агентом є метіонін ших одиничних клітинних клонів (SCC), 10A8, що сульфоксимін, а для mdr бажаним селективним походить від 1С10 при використанні LDS, на селеагентом є колхіцин. ктивному середовищі, збагаченому 5% FBS, адапРобочі приклади тували у вільному від сироватки середовищі, збаПоходження клітинних ліній, що експресують гаченому Plasmanate HPP фракцією. BDD-FVIII; селекція на ліки на генна ампліфікація Несподівано, 1010А8 показав дуже високі рівні Тридцять мікрограмів pCIS25DTR ДНК перепродуктивності rFVIII на цій стадії (Фігура 4b). Таносили у НКВ11 [АТСС депозитний номер CRL ким же чином ми проводили друге LDC, викорис12568, депонована 16 вересня 1998 року, - гібрид товуючи середовище, збагачене Plasmanate HPP 293S клітин та людських клітин лімфоми Беркіта, фракцією. Продуктивність SCC (наприклад, 20В8), див. патентну заявку США, що подана Сhо у той що походять від другого LDC, була подібною з самий день, що і дана, та позначену як MSB-7241, Plasmanate HPP фракція-адаптованою 10А8. введена як посилання] клітини шляхом електропо20В8 показала вищі рівні BDD-FVIII, ніж оригінальрації при 300 Вольтах та 300 мікро Фарадах (ВТХ ний 10А8, що походить від першого LDS, у вільноElectro cell Manipulator 600), при використанні кюму від сироватки середовищі. У кінці 20В8 адаптувети на 2мм (ВТХ частина #620). У порівняльних вали до росту у вільному від білків плазми експериментах проводили паралельну роботу з середовищі (PPF). Зразки 20В8 депонували в НКВ11 клітинами, СНО (яєчник китайського хом'яАмериканській Типовій колекції культур (Manassas, чка) та 293S (людська ембріональна нирка). КлітиVA) (АТСС депозитний номер CRL-12582, депоно 7 77383 8 вана 6 жовтня 1998 року)). вність. З 28 дня до кінця перебігу ферментації, Як показано у Таблиці, НКВ клони демонструклітини піддавали перфузії тим самим вільним від ють переважаючу продуктивність для BDD-FVIII. сироватки продукційним середовищем, але без 10-20 кратне збільшення продуктивності спостеріPlasmanate HPP фракції. Як показано на Фігурі 5, гали у клітинах НКВ при порівнянні з клонами, що клітини продовжували виробляти високі рівні FVIII походять від трансфікованих СНО та 293S клітин. у середовищі, вільному від білків плазми. «Вільне НКВ клітини, які не формують великих агрегатів від білків плазми» означає, що суттєво ніяких білпри рості у суспензійній культурі, є бажаними кліків, ізольованих з плазми, не додавали до середотинами для експериментів по експресії білків, що вища. мають прокоагулянтну активність фактора VIII. Обговорення Походження НКВ клітин забезпечує продукційТаблиця ну систему, вільну від білків, для утворення не тільки BDD-FVIII, але і інших терапевтичних білків Експресія FVIII та BDD-FVIIIу людських також. Білки, одержані за допомогою НКВ клітин, клітинних лініях та клітинних лініях гризунів мають людську модель глікозилування, яка може збільшити напівперіод життя певних глікопротеїнів Специфічна продуктивність (мікроодиin vivo. Ці клітини можуть також бути корисними ниць/кл/день)* для продукції аденовірусу та аденовірусасоційованих штамів, що призначені для цілей FVIII похідні ВНК 293S СНО НКВ генної терапії. Наведені вище приклади призначені для ілюсFVIII повної довжини 0,45 1,2 0,5 1,0 трації винаходу, який також охоплює можливі варіBDD-FVIII НП 2,5 1,0 20 анти, що зустрічаються, та є очевидними для спеціалістів у даній галузі. Згідно з цим, зрозуміло, що * Середнє значення 5 високопродуктивних галузь винаходу обмежена тільки пунктами форклонів (у вільному від сироватки середовищі) мули, що представлена нижче. НП-не проводили Адаптація клонів до середовища, вільного від білків плазми НКВ клони, що були адаптовані до росту як вільні від сироватки суспензійні культури, були далі відлучені від забезпечення білками плазми. Відлучення проводили у стерильних полікарбонатних качалочних пробірках (Corning, Corning, NY) при щільності клітин близько 0,5x106 клітин/мл, використовуючи середовище, вільне від білків плазми. Середовищем, вільним від білків плазми (PPF), було DME/F12 середовище, забезпечене плюроніком F68 (0,1%), CuSO4 (50нМ) та FeSO4/EДTA (50мкМ). Повну заміну середовища проводи кожні 48 годин та пробірки пересівали при 0,5х106клітин/мл. Ферментація клону 20В8 Продуктивність клону 20В8 оцінювали у 15літровому перфузійному ферментаторі. Ферментатор засівали клоном клітин 20В8 при щільність близько 3х106клітин/мл. Ферментатор піддавали перфузії при нормі 4 об'єми на день з середовищем, вільним від сироватки, так, як описано у попередніх розділах. Заключну концентрацію клітин 2х107клітин/мл підтримували протягом періоду оцінки (45 днів). Як показано на Фігурі 5, протягом перших 4 тижнів ферментації, клон 20В8 піддавали перфузії з вільним від сироватки продукційним середовищем, що збагачене на Plasmanate HPP фракцію, та здатне підтримувати високу продукти 9 77383 10 11 77383 12 13 Комп’ютерна верстка О. Гапоненко 77383 Підписне 14 Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601