Спосіб експресії мітогенного білка ендотеліальних клітин людини

Способ экспресии митогенного белка эндотелиальных клеток человека в Escherichla coll. заключающийся в том, что выделяют мРНК из вытяжки ствола мозга человека, получают из мРНК поли(А+)мРНК, синтезируют кДНК с помощью указанной мРНК, колонируют кДНК в вектор лямбда gt10 или лямбда gt11, отбирают клоны кДН К, кодирующие митогенный белок эндотелиальных клеток путем гибридизации указанных клонов с олигонуклеотидной пробой, имеющей следующую нуклеотидную последовательность: АТТ ТТТ CCI GAT CCI ACI GTI GAT GGT ACT AAA, субклонируют кДНК из отобранных клонов в плазмиду pUC8, выделяют плазмидные ДНК pDH14 и pDH15, трансформируют полученными ДНК штамм-реципиент с последующим отбором трансформированных клонов и индукцией экспрессии целевого белка. Изобретение относится к генетической инженерии, в частности к синтезу митогенного эндотелиального белка методом рекомбинантных ДНК. Фактор роста эндотелиальных клеток (ФРЭК) является митогеном эндотелиальных клеток In vitro. ФРЭК выделяют путем осаждения сульфатом стрептомицина, гель - проникающей хроматографией, осаждения сульфатом аммония и аффинной хроматографией на гепарин-сефарозе. Выделены многочисленные формы бычьего ФРЭК путем элюирования его линейным градиентом натрийхлорида из колонки на гепарин-сефарозе или обращенно-фазовой высокожидкостной хроматографией (ВЖХ). Два выделенных полипептида, обозначенные альфа- и бетаФРЭК, имеют мол.м. 17000 и 20000. Используя указанную методику, бычий ФРЭК, содержащий в 8500 мл вытяжки из мозга быка (6,25х107 суммарных единиц), концентрируют с выходом в сумме 6 мл альфа ФРЭК(3,0хЮ6 единиц) и 3 мл бета-ФРЭК (5,2x10s единиц). Сущность изобретения состоит в получении ФРЭК и его фрагментов, не содержащих других белков человеческого происхождения, ФРЭК получают в клеткахреципиентах, при этом конструируют векторы экспрессии, содержащие последовательность ДНК. кодирующую ФРЭК, трансформируют полученными рекомбинангами ДНК штаммы со О 13321 E.coli клеток хозяев, осуществляют культивирование трансформаторов в условиях , обеспечивающих экспрессию ФРЭК , и выделяют белок. Вектор экспрессии ФРЭК конструируют путем получения дн-к ДНК из5 мРНК ФРЭК и введения дн-к ДНК в вектор . мРНК обогащают поли(А ) содержащим мРНК материалом посредством хроматографии на олиro(d^целлюлозе или поли(у)сефа-розе с последующим элюированием 10 фракции мРНК. содержащей поли(А) последовательность. Поли(А) содержащую мРНК используют для синтеза комплементарной кДНК (он-кДНК). используя обратную транскриптазу. 15 В результате синтеза ДНК у 3-конца ДНК образуется шпилечная петля, инициирующая синтез двунитевой ДНК. При соответствующих условиях эту шпилечную петлю используют для осуществления синтеза дн- 20 кДНК в присутствии полимеразы и деоксирибонуклеотидтрифосфатов. Вектор экспрессии обрабатывают с помощью эндонуклеазы рестрикции, которая образует по крайней мере два тупых или 25 липких конца. Дн-кДНК встраивают в вектор. Клоны, содержащие полные последовательности ФРЭК, идентифицируют, используя в качестве зонда вставку кДНК 30 рекомбинантов ФРЭК, выделенных во время начального скриннинга библиотеки кДНК рекомбинэнтного фрагмента фага лямбда с олигонуклеотидами, специфическими к ФРЭК. Метод секвенирования нуклеотидов 35 используют для определения последова тельности аминокислот , кодированных фрагментами кДНК. Эту информацию можно использовать для определения клонов кДНК ФРЭК при сравнении с известной 40 аминокислотой последовательностью ами ноконца бычьего ФРЭК и пептида , выделенного в результате расщепления ФРЭК бромидом цианогена. ПримерА, Получение тотальной РНК. 45 Тотальную РНК (матричную, рибосом-ную и транспортную) экстрагируют из вытяжки ствола мозга человека двухдневной свежести. Клеточный осадок в пробирке после центрифугирования гомогенизируют в 5 50 объемах раствора, содержащего 4М тиоцианата гуанидина и 25 мМ антивспенивателя А. Гомогенат центрифугируют в роторе в течение 15 мин при скорости 6000 об/мин при 10°С. Надосадочную жидкость доводят до 55 рН 5,0 при прибавлении уксусной кислоты и РНК , осажденной 0,75 объемами этанола при -20°С в течение 2 ч. РНК собирают цен трифугированием и растворяют в 7,5 М гидрохлорида гауанидина, содержащего 2 мМ цитрата натрия и 5 мМ дитиотреитола. После двух дополнительных осаждений 0,5 объемами этанола оставшийся хлоргидрат гуанидина экстраг ируют из п рецип итата абсолютным этанолом. РНК растворяют в стерильной воде, центрифугированием удаляют нерастворимые вещества и осадок после центрифугирования повторного экстрагируют водой. РНК доводят до концентрации 0,2 М ацетата калия и осаждают при добавлении 2,5 обьемов этанола в течение ночи при -20°С. Б. Получение поли(А) содержащей РНК. Преципитат тотальной РНК растворяют в 20 мМ Hepes-буфера (рН 7,2), содержащего 10 мМ ЭДТА и 1%, додецилсульфат натрия, нагревают до 65°С в течение 10 мин затем быстро охлаждают до 25°С. Раствор РНК затем разбавляют равным объемом воды и прибавляют NaCI для доведения конечной концентрации до 300 мМ NaCI. Образцы, содержащие до 240 Агбо единиц РНК, хроматографируют на поли(\/)сефарозе. Поли(А) содержащую РНКэлюируют70% раствором формамида, состоящим из 1 мМ Hepes-буфера (рН 7,2) и 2 мМ ЭДТА. Элюат устанавливают до концентрации 0,24 М NaCI и полученную РНК осаждают 2,5 объемами этанола при -20°С. В. Конструирование клонов кДНК в фаге лямбда. мРНК (20 мкг) копируют в дн-кДНК с помощью транскриптазы и ДНК-полимеразы. дн-кДНК обессоливают на сефадексе G50 и фракции с незаполненным объемом дополнительно очищают на колонке в соответствии с инструкциями изготовителя. При инкубации с Sl-нуклеазой получают днкДНК с тупыми концами . Реакционную смесь, состоящую из 0,2 М цитрата натрия (рН 4,5), 0,4 М хлорида натрия, 2,5 мМ ацетата цинка и 0,1 ед. Sl-нуклеазы на нг дннДНК, доводят до конечного реакционного объема 100 мкг, дн-дДНК инкубируют при 37DC в течение 1 ч. экстрагируют смесью фенол-хлороформ и затем обессоливают на сефадексе G-50. Дн-кДНК затем обрабатывают метила зой E.coRI и фрагментом Кленова ДНК-полимеразы 1. кДНК опять обессоливают на сефадексе G-50, а затем лигируют с 0,5 мкг фосфорилированных линкеров E.coRI, используя Т4 ДНК-лигазу. Полученную смесь расщепляют эндонуклеазой рестрикции Е. coRI и фракционируют в 8% акриламидном геле в трис-боратном буфере. ДНК размером боле 1 кб элюируют из геля и извлекают при связывании с колонкой, элюируют 1 М NaCI, а затем собирают преципитацией этанолом. 13321 Фрагменты ДНК затем вставляют в фрагмент gtn фага лямбда расщепленного рестриктазой E.coRI и обработанного фос фатазой, используя ДНК-лигазу Т4. Получают библиотеку, состоящую из 5,7x10 фагов, 5 65% которой составляют рекомбинантные фаги . Библиотеку фагов амплифицируют продуцированием штоков при 42°С на штамме E.coil Y1088(sup.E supF mtc В trpR hsdR' hsd M+ton A 21 str A lac И 169 (proc:: Тп5). К 10 важным генетическим признакам указанного штамма относятся (1) sup F {необходимый для супрессии амбер-мутации фаза по S-re-ну), (2) hsd R hsd М+, необходимые для предотвращения рестрикции чужеродной ДНК 15 до модификации клетки хозяина и (3) lac И 169 (ргос:: Тп 5). и {4) (рМС9) (Lac 1-несущее производное плазмиды pBR322, которое подавляет в присутствии индуктора экспрессию чужеродных генов, которые могут 20 разрушать фаг и/или подавлять клеточный рост. Г. Идентификация клонов, содержащих ФРЭК-последовательности. Для скриннинга библиотеки кДНК 25 ФРЭК, содержащей рекомбинантные фаги , клетки фагов с титром 1,5x10 высевают на чашке на газон штамма Е.соИ Y 1090 [ Д lac И 169 pro А Діоп ага D139 str A sup F(trp С 22::Tn 10) (рМС9) и инкубируют при 42°С в 30 течение 6 ч. После охлаждения чашек в холо дильнике в течение ночи их накрывают инт роцеллюлозным фильтром . Положение фильтра маркируют иголкой. Через минуту фильтр удаляют и дают просохнуть при ком- 35 натной температуре. С каждой чашки пол учают двойной фильтр , кроме того, что фильтр оставляют в контакте с чашкой в те чение 5 мин. Затем готовят все фильтры для гибридизации. Затем готовят все фильтры 40 для гибридации. Указанная методика вклю чает денатурацию ДНК в 0,5 М NaOH с 1,5 М NaCI, нейтрализацию в буфере 1М трис-НСІ, рН 7,5 и 1,5 М NaCI и нагревание фильтров в течение 2 ч в вакууме при 80°С. 45 атомной, бомбардировкой и определяют аминокислотный состав триптического пептида с концевой аминогруппой. По-видимому, аминоконцевая блокирующая группа ацетилирована. Если интактный бета-ФРЭК расщеплен трипсином, то, как определено, вторая аминокислотная последователь ность с аминоконцом, найденная в бета-, а не в альфа-ФРЭК, начинается с Phe Asn Leu... Данная последовательность также обнаружена у концевой аминогруппы кислого фибробластного фактора роста. Концевая аминогруппа ФРЭК представляет Asn Туг Lys... и является эквивалентом бета-ФРЭК без аминоконцевой элонгации. Для конструирования олигонуклеотида выбирают последовательность аминокислот lie Leu Pro Asn Gly Thr Val Asp Gly Thr Lys, соответствующую 19,29 включениям аминокислот альфа-ФРЭК. Вместо создания смеси из олигонуклеотидов, охватывающих все возможные кодирующие последовательности (вследствие деградации генетического кода), конструируют длинный уникальный олигонуклеотид. Такие олигонуклеотид-затравки. как показано ранее, являются эффективными зондами при скриннинге комплекс-ДНК. При конструировании ФРЭК-зонда используют три критерия: (1) исключают динуклеотидную пару CG. Данный подход основан на недостаточной встречаемости CG-nap динуклеотида в ДНК прокариота. В тех случаях, когда возможно, используют данные о предпочтительной утилизации кодона. Когда оба эти подхода не информативны, возможно необычное связывание пар оснований. Этот подход основан на природной частотности пар оснований G:T,I:T, I:A и !:С, которое возникает при взаимодействии между антикодонами тРНК и кодонами мРНК. Примерно 30 моль олигонуклеотида радиоактивно метят путем инкубации с 32 ргамма-АРТ и Т4 полинуклеотид-киназой. Полученные по методике, указанной выше, Для скриннинга в библиотеки кДНК нитроцеллюлозные фильтры предварительно ствола головного мозга человека для получения гибридизуют при 42°С в бхІЗБРЕ-буфере клонов, содержащих ФРЭК-вставки, (1xSSPE=0,18 M NaCI, 0,01 М (NaHPCMXpH конструируют специфический олигонуклео- 50 7,2), 0,001 М ЭДТА), 2хДенхардт-раствора (1 тид. Указанный олигонуклеотид базируется на х Денхардт-раствора содержит по 0,02 % фианализе частичной аминокислотной по - кола, поливинилпирролидона, бычьего сыследовательности концевых аминогрупп вороточного альбумина), 5% растворе ФРЭК. Бычий ФРЭК выделяют в виде двух сульфата декстрана и 100 мкг/мл денатуриформ, обозначенных как альфа- и бета-ФРЭК, 55 рованной ДНК спермы лосося. Через 4 ч которые отличаются только аминокислотами , вводят 42 Р-меченый олигонуклеотид и гибобнаруженными у соответствующих амино - ридизацию продолжают в течение ночи при концов. Последовательность выводят из 42°С. Негибридизовзнный зонд удаляют в масс-спектрального анализа с быстрой результате последовательного промывания 13321 при 37°С в 2xSSPE-6y4>epe и 0,1 % растворе ДДС натрия (SDS). Из скриннированных 1,5x10 клона дают положительные радиоавтографические сигналы после экспозиции в течение ночи. Эти клоны очищают до гомогенного состоя ния повторными циклами очистки, используя вышеуказанный олигонуклеотид в качестве гибридизационного зонда. Два клона, которые выделены, клоны 1 и 29 ФРЭК, анализируют более детально. При переваривании с E.coRI в клонах 1 и 29 обнаруживают кДНК-вставки длиной 2,2 кБ и 0,3 кБ соответственно. При ник-трансляции клонированной кДНКи последующем ее использовании в качестве радиомеченого зонда в блот-гибридизации по Саузерну обнаруживают, что клоны 1 и 29 представляют собой связанные и перекрывающиеся клоны. Более детально клоны 1 и 29 анализируют по следующей методике. Конструируют два дополнительных олигонуклеотида на основе аминокислотной последовательности бычьего ФРЭК. Указанные олигонуклеотиды конструируют на основе таких же подходов, которые используют при конструировании олигонуклеотида, применяемого для выделения клонов 1 и 29. Эти два иукпеотида, а также олиго (аТ)18 радиоактивно метят в киназной реакции, как указано выше, и затем используют в качестве гибридизационных зондов в блот-анализе по Саузерну . Полученные данные этого анализа показывают, что кДНК-вставка 0,3 кб клона 29 гибридизуется с 1 и 11 олигонуклеотидами ФРЭК, а не с III или олиго (с!Т)1-8-нуклеотидами: кДНКвставка2,2 кб клона 1 гибридизуется с !,Н, III олигонуклеотидами, а также с олиго(оТ)18нуклеотидом. Из этих данных и последующего определения нуклеотидной последовательности клонов 1 и 29 видно, что 3-конец клона 1 заканчивается поли(А)-хвостом. При гибридизации клона 1 с олигонуклеотидом III ФРЭК, которая происходит на основе вырезания цианогенбромидом продукта бычьего ФРЭК, а также с олиго (сЛ)18-нуклеотидом указанный клон, как предполагают, включает оставшуюся кодирующую последователь ность для альфа-и бета-форм ФРЭК, а также длинную (более 1 кб)3'-концевую фланкирующую последовательность. Из клонов 1 и 29 выделяют кДНК-вставки, субклонируют в М13 р18, а открытую рамку считывания, кодирующую ФРЭК, и фланкирующиеся области секвенируют по методу терминации цепи. При анализе нуклеотидной последовательности обнаруживают открытую рамку считывания из 464 8 нуклеотидов, кодирующую ФРЭК человека. Установлено, что 155 аминокислот ФРЭК человека фланкированы кодонами блокирозки трансляции. Аминокислотой с концевой 5 (ЧНг-группой бета-ФРЭК человека, выделенной из кДНК-последовательности, является метионин , который, по всей вероятности, выступает в качестве остатка инициации трансляции, На основе указан10 ных данных, а также с негидрофобной природой первых 1 5 - 2 0 аминоконцевых остатков высказывается предположение, что бета-ФРЭК человека синтезируют без сигнального пептида с концевой 1ЧН2-груп15 пой. Аминокислотная последовательность с концевой аминогруппой бычьего бета ФРЭК, расщепленная трипсином, а также бычьего альфа-ФРЭК идентична аминокислотной последовательности, выведенной из 20 последовательности нуклеотидов клонов 1 и 29 лямбда ФРЭК. Полная гомология между двумя указанными видами, как установлено, составляет более 95%. При Northern-блот-анэлизе устанавли25 вают, что мРНК ФРЭК представляет вид единичной молекулы, которая мигрирует вместе с 28 S рРНК. С учетом допускаемой погрешности в расчетном размере 28 S рРНК приблизительный размер мРНК 30 ФРЭК составляет 4,8±1,4 кб. Последовательности, кодирующие зрелые формы как альфа-, так и бета-ФРЭК, закодированы в пределах клонов 1 и 29 ФРЭК, которые вместе имеют размер примерно 2,3 кб. Таким 35 образом, указанные данные демонстрируют, что область 51 и фланкирующая последовательности, кодирующие ФРЭК, довольно протяженные {примерно 2,5+1.4 кб}. Из клонов 1 и 20 вырезают кДНК-встав40 ки посредством гидролиза E.coRi и субклонируют в pvO8 и у сайта E.coRI. Плазмиду, сконструированную из клона 1, обозначают как pDH 13, а плазмиду, образованную из клона 29, как pDH14. Указанные плазмиды 45 депонируют в Американской коллекции ти повых культур. 12301 Parklawn Drive, Rockvill ATCC 20852. Плазмиде из клона 1, то есть pD H15, присваивают номер АТСС 53336, а плазмиде мз клона 29, то есть 50 pDH14, - АТСС 53335. Таким образом, указанный пример представляет экспериментальные методики, которые предусматривают получение фактора роста зндотелиальных клеток чело55 века, не содержащих других белков человеческого происхождения. ФРЭК применяют для выращивания и амплификации эндотелиальных клеток в культуре. В настоящее время ФРЭК, используемый для выращивания клеток, экстраги 13321 10 руют из бычьего мозга Этот неочищенный клетки культивируют на этих поверхностях с бычий ФРЭК является митогеном эндотелия использованием эффективных доз ФРЭК в эллантоисной вены человека . Использова питательной среде, покрывая их монослоем ние гепарина с ФРЭК и матрикса на основе эндотелия. В результате этого получают пофибропектина позволяет получить стабиль- 5 верхность предупреждающую образование ные клоны эндотелиальных клеток . Реко тромбов в приспособлении для протезиромендуемая концентрация сырого бычьего вания, тем самым уменьшая опасность возФРЭК для использования в качестве митоге - можных случаев закупорки тромбами , на In vitro составляет 150 мкг на мл пита которые угрожают жизни, вследствие имптельной среды. 10 лантации этих протезов. Рекомбинантный ФРЭК человека, пол Так, разработан иммунологический анаученный таким образом, пригоден в качест лиз с помощью двойного антитела для бычьве замены бычьего неочищенного ФРЭК при его ФРЭК. В этом анализе 96-луночные культивировании In vitro эндотелиальных планшетки из поливинилхлорида покрываклеток человека и других мезенхимных кле- 15 ют антиФРЭК кролика и остающиеся участки ток для научных исследований . Полагают, связывания затем блокируют , используя что активность ФРЭК человека в условиях 10% стандартную сыворотку кролика. Далее роста эндотелиальных клеток такая же или образцы ФРЭК вводят е лунки и инкубиру превосходит активность бычьего ФРЭК ют. После промывки прибавляют ФРЭК с вследствие высокой гомологии в аминокис- 20 моноклональными антителами мыши. После лотных последовательностях обоих белков . инкубации и нескольких промывок прибавПредполагаемый предел эффективной дозы ляют связанные пероксидазой IgG мыши с для усиления клеточного деления и роста in антителом из кролика. Реакционный проvitro составляет 5-10 нг очищенного ФРЭК дукт квантируют спектрофотометрически на 1 мл питательной среды. 25 после конверсии 0-фенилендиамина е приРекомбинантный ФРЭК человека также сутствии перекиси водорода. Аналогичный пригоден для активации клеточного роста в иммуноанализ можно использовать для успротезном приспособлении, а не в склянке или тановления дозировки ФРЭК в зависимости колбе для культивирования тканей , Это от состояния болезни, которая воздействует приспособление может быть покрыто или не 30 на рост зндотелиальных клеток. Очищенный покрыто другими молекулами, которые должны РЭК-продукт пригоден в качестве стандартспособствовать прикреплению эндотелия к ного реагента для количественного опредеуказанному устройству. Такие молекулы ления неизвестных образцов ФРЭК. могут включать белки с внутриклеточным матриксом (например, фибронектин, 35 ламинин ФРЭК также может быть потенциаль или один из коллагенов ), человеческий ным средством при лечении поврежденных сывороточный альбумин гепарин или другие или для регенерации кровяных сосудов или гликозамингликаны или инертные других строений организма с покровом эн органические молекулы. Эндотелиальные дотелиальных клеток. Упорядник Замовлення 4110 Техред М.Моргентал Коректор М. Керецман Тираж Підписне Державне патентне відомство України, 254655, ГСП, Київ-53, Львівська пл.. 8 Відкрите акціонерне товариство "Патент", м. Ужгород, вул.ГагарІна. 101