Стабільний водний розчин людського еритропоетину без вмісту серумальбуміну

1. Водна композиція людського еритропоетину, яка містить людський еритропоетин та неіонну поверхнево-активну речовину, багатоатомний спирт, нейтральну амінокислоту і цукровий спирт у ролі стабілізаторів, ізотонічний реагент та буферний реагент і у якій зазначена неіонна поверхневоактивна речовина являє собою полісорбат 20, зазначений багатоатомний спирт – пропіленгліколь, зазначена нейтральна амінокислота – гліцин, зазначений цукровий спирт – манітол, зазначений ізотонічний реагент – C2 2 82241 1 3 82241 02610). Через те еритропоетин уже давно показаний як ліки проти різних захворювань. Однак еритропоетин, як і інші білкові препарати, треба готувати дуже ретельно, щоб уникнути денатурації внаслідок утрати стабільності і тим забезпечити його ефективне застосування. Взагалі, протеїни мають короткий період напіврозкладу й легко піддаються денатурації, наприклад, через агрегування мономерів, осадження внаслідок агрегації та поглинання стінками ампул під дією надмірних температур, явища на границі розділу води та повітря, високий тиск, фізичні та механічні напруження, дію органічних розчинників, забруднення мікроорганізмами тощо. Денатуровані протеши втрачають притаманні їм фізико-хімічні властивості та фізіологічну активність, причому денатурація протеїну є, як правило, необоротна. Отже, якщо протеїн денатурований, він не може повернути свої первинні властивості. Особливо у випадку таких протеїнів, як еритропоетин, які вводяться разовими дозами усього у кілька мікрограмів, коли вони поглинаються стінками ампули внаслідок зникнення стабільності, втрати, що виникають при цьому, дуже помітні. Більш того, протеїн, який поглинається таким чином, легко утворює агрегати у ході денатурації, а введення денатурованого протеїну до організму викликає спонтанне утворення антитіл проти цього денатурованого протеїну, а відтак, його можна вводити лише у суттєво стабільному вигляді. Відповідно вивчалися різні способи протидії денатурації протеїну у водному розчині (John Geigert, J.Parenteral Sci.Tech., 43, # 5, 220-224, 1989; David Wong, Pharm.Tech., October, 34-48, 1997; Wei Wang, IntJ.Pharm., 1 85, 129-188, 1999; WillemNorde, Adv.Colloid Interface Sci., 25, 267-340, 1986; Michelle et al., IntJ.Pharm. 120, 179-188, 1995). У деяких протеїнових композиціях проблема денатурування вирішується шляхом ліофілізації. Утім, ліофілізовані продукти надто незручні, бо їх треба відновлювати перед ін'єкцією, а процес обробки потребує холодильника-сушарки великої потужності, що пов'язане зі значними інвестиціями. Також одержують порошкоподібні форми протеїну розпилювальною сушкою; однак недолік полягає в економічній неефективності внаслідок низького виходу продукту, до того ж дія високих температур може привести до денатурації протеїну під час обробляння. Альтернативою обмеженням зазначених способів є спосіб поліпшення стабільності протеїну шляхом додання стабілізаторів до водного розчину протешу. Відомими стабілізаторами протеїну є поверхнево-активні речовини, серумальбумін, полісахариди, амінокислоти, макромолекули та солі (John Geigert, J.Parenteral Sci.Tech., 43, # 5,220-224, 1989; David Wong, Pharm.Tech., October, 34-48, 1997; Wei Wang, Int.J.Pharm., 1 85, 129-188, 1999). Однак до кожного протеїну треба підбирати належний стабілізатор у відповідності до його фізикохімічних властивостей; у іншому разі, наприклад, при вживанні стабілізаторів у певних сполученнях 4 можуть мати місце конкурентні або бічні реакції, наслідки яких будуть протилежні бажаним. Більш того, оскільки для кожного стабілізатора існують суворі обмеження концентрацій, стабілізація водних розчинів протеїнів вимагає величезної ретельності та обережності (Wei Wang, IntJ.Pharm., 1 85,129-188, 1999). Найчастіше стабілізаторами водних протеїнових композицій слугують серу-мальбумін та желатин, ефективність яких доведена. Однак при застосуванні людського серумальбуміну існує небезпека забруднення вірусами, а желатин та бичачий серумальбумін можуть переносити хвороби типу губчастої енцефалопатії або викликати алергію в деяких хворих; через те у Європі все більш обмежується застосування матеріалів людського та тваринного походження як фармацевтичних добавок ((EMEA/CPMP/BWP/450/01 "Доповідь експертної групи з людських клі-тин-супресорів та медичних продуктів, що походять із людської крові та плазми (1 грудня 2000), CPMP/PS/201/98 "Висновок щодо нового варіанта CJD та медичних продуктів із людської плазми" (замінений CPMP/BWP/2879/02). Отже, існує потреба створення способів складання стабільних протеїнових композицій без людського або тваринного серумальбуміну для вирішення проблеми існуючих еритропое-тинових композицій, які містять серумальбумін. У патенті США 4879272 описано додання людського або бичачого серумальбуміну, лецитину, декстрану та целюлози як інгібіторів прилипання протеїну до стінок ампули. Згідно з цим патентом вихід еритропоетину становить аж 69-98 % після зберігання протягом 2 годин при 20°С проти лише 16 % - без такої добавки, але мають місце значні втрати внаслідок адсорбції. У патенті СІЛА 4806524 йдеться про ліофілізовану композицію та водну композицію еритропоетину з умістом поліетиленгліколю, протеїну, сахаридів, амінокислот, органічних солей як стабілізаторів еритропоетину. Згідно з цим патентом ліофілізована композиція після зберігання протягом 7 днів при 25°С дає високий вихід еритропоетину - 87~98 %, тоді як у водної композиції вихід становить лише 60~70 %, тобто водна композиція відносно менш стабільна. У патенті США 4992419 описані водна композиція та ліофілізована композиція еритропоетину, в якій для протидії абсорбції застосовано 0,5~5 г/л неіонної поверхневоактивної речовини, а стабілізаторами слугують 5~50 г/л сечовини та 5~25г/л амінокислот. Однак водна композиція за цим патентом має меншу стабільність у порівнянні з тими, що містять людський серумальбумін, а ліофілізована композиція потребує відновлення, щоб підтримувати достатню активність. За патентом США 5376632 водна композиція, ліофілізована композиція та висушена розпилювальною сушкою композиція еритропоетину містять β або γ-циклодекстрини, але не мають жодних інших фармацевтичних наповнювачів. До того ж композиції з 5 82241 циклодекстринами на практиці не можна застосовувати внаслідок їх токсичності для нирок. У патенті США 5661125 композиція еритропоетину містить бензиловий спирт, парабени, фенол та їх суміші, а також описується експеримент, що доводить її стабільність у порівнянні з композицією еритропоетину, яка містить людський серумальбумін. Однак така композиція показує низьку стабільність і значне осадження еритропоетину навіть при низькій температурі. У WO 01/87329 А1 описані водні композиції еритропоетину та багатозарядний неорганічний аніон у фармацевтично прийнятному буфері, для підтримування рН розчину у межах від біля 5,5 до біля 7. У цій заявці наводиться порівняльний експеримент щодо стабільності, у якому після витримки ΕΠΟ та обробленого поліетиленгліколем ΕΠΟ при різних температурах протягом 6 місяців вимірюють вміст сіалової кислоти та стандартну біоактивність у відсотках кожного зразка ΕΠΟ у різних композиціях; утім, оскільки не визначалася кількість мономерів ΕΠΟ, немає можливості точно визначити вихід мономерів ΕΠΟ у відсотках. Отже, бажано створити нову водн у композицію, яка б мала довгострокову стабільність без умісту протеїнових компонентів тваринного походження, таких, як серумальбумін. Метою цього винаходу є створення водної композиції еритропоетину, здатної зберігати біологічну активність протягом тривалого часу in vi vo без застосування серумальбуміну людського або тваринного походження. Шляхом багатьох експериментів та поглиблених досліджень винахідник віднайшов водну композицію людського еритропоетину, яка попереджує присипання до стінок ампули та денатурацію протеїну внаслідок тривалого зберігання за рахунок поєднання фармацевтично ефективної кількості еритропоетину з певними компонентами, наприклад, стабілізаторами, ізотонічним реагентом та буферним реагентом, і здійснив свій винахід. Отже, цей винахід забезпечує створення водної композиції людського еритропоетину, яка містить фармацевтично ефективну кількість людського еритропоетину; неіонну поверхневоактивну речовину, багатоатомний спирт, нейтральні амінокислоти, цукровий спирт у ролі стабілізаторів; ізотонічний реагент та буферний реагент. Людський еритропоетин, який може використовува тися у водній композиції за винаходом, включає всі типи еритропоетину, які можна виділити та очистити з тваринних клітин методами природної або генетичної рекомбінації. Кількість еритропоетину у водній композиції переважно становить від 100 од./мл до 120000 од./мл. Водна композиція згідно з винаходом містить неіонну поверхнево-активну речовину для стабілізації композиції шляхом запобігання прилипанню до стінок ампули, причому поверхнево-активна речовина знижує поверхневий 6 натяг протеїнів, не допускаючи прилипання або агрегування протеїнів на гідрофобних поверхнях. Переважно поверхнево-активними речовинами згідно з винаходом є неіонні поверхнево-активні речовини на полісорбатній та полоксамерній основі, що їх можна застосовувати окремо або у комбінаціях по двох чи більше. Як приклади таких не-іонних поверхнево-активних речовин на полісорбатній основі можна навести полісорбат 20, полісорбат 40, полісорбат 60 та полісорбат 80, причому найсприятливішим із них є полісорбат 20. Полісорбат 20 інгібує хімічний розклад протеїну, а також знижує або попереджує злипання протеїнів у малих концентраціях, бо його критична концентрація міцел відносно низька. Застосовувати високі концентрації неіонної поверхнево-активної речовини у водній композиції недоцільно, бо такі концентрації спричинюють інтерференцію при УФ-спектроскопії та ізоелектричному фокусуванні під час вивчення стабільності та концентрації протеїну, що утруднює оцінку стабільності протеїну. Отже, у водній композиції згідно з винаходом поверхневоактивна речовина переважно наявна у кількості менше 0,01, бажано 0,0001-0,01 г у 100 мл розчину. Нейтральна амінокислота дозволяє присутність набагато більшої кількості молекул води навколо еритропоетину таким чином, що можна стабілізувати найвід-даленіші гідрофільні амінокислоти еритропоетину, а через те і сам еритропоетин (Wang, IntJ.Pharm., 185 (1999) 129188). Оскільки заряджені амінокислоти можуть сприяти агрегуванню еритропоетину за рахунок електростатичної взаємодії, у водній композиції за винаходом уживаються нейтральні амінокислоти. Переважно нейтральними амінокислотами, що їх можна використовувати у цьому винаході, є гліцин, алани, лейцин, ізолейцин тощо, краще за все гліцин. Такі нейтральні амінокислоти можна застосовувати окремо або у комбінаціях по двоє чи більше; однак експериментальні дані винахідників доводять, що гліцин діє ефективніше, коли застосовується сам по собі, ніж у комбінації з іншими амінокислотами. Утім, водна композиція згідно з винаходом не обмежується застосуванням лише однієї нейтральної амінокислоти. Кількість нейтральної амінокислоти за винаходом переважно становить від 0,001 до 2 г у 100 мл розчину. Нижче цього інтервалу можна не забезпечити стабільності. З іншого боку, якщо взяти амінокислоти більше цього інтервалу, не можна буде досягти високої концентрації еритропоетину внаслідок підвищеного осмотичного тиску, який діє на розчинність еритропоетину. У водній композиції згідно з винаходом багатоатомний спирт відіграє роль одного зі стабілізаторів еритропоетину в розчині. Кращими прикладами багатоатомного спирту є пропиленгліколь, поліетиленгліколь із низькою молекулярною масою, гліцерин та поліпропиленгліколь із низькою молекулярною масою, причому їх можна використовувати у комбінаціях по двоє або більше. Найприйнятнішим 7 82241 із них є пропиленгліколь. Він широко застосовується у парентеральних або непарентеральних фармацевтичних композиціях як розчинник гідрофобних матеріалів, екстрагент та консервант, бо вважається нетоксичним. Більш того, у харчових та косметичних продуктах він використовується як емульгатор або носій. Також він може слугува ти стабілізатором фармацевтичних продуктів для підвищення розчинності фосфоліпідів, коли останні виступають як стабілізатори водних композицій. Пропиленгліколь також може збільшува ти стабільність водних композицій протеїну і взагалі додатково поліпшує стабільність водних композицій у комбінації з іншими стабілізаторами у більшому ступені, ніж коли його вживають його одного. Однак треба зазначити, що, як установили автори цього винаходу, незважаючи на присутність поліпропиленгліколю, стабільність водної композиції несподівано знижується у разі неправильного підбору видів та інтервалів концентрацій інших стабілізаторів, які утворюють комбінації з поліпропиленгліколем. Уміст багатоатомного спирту переважно становить від 0,0001 до 0,2 г у 100 мл розчину. При меншому вмісті стабільність не підвищиться. З іншого боку, надто велика кількість спирту може спричинити проблеми з осмотичним тиском. Цукровий спирт як один із стабілізаторів водних композицій за винаходом відіграє роль стабілізатора еритропоетину, якщо вводиться до розчину разом із зазначеними поверхневоактивними речовинами, нейтральною амінокислотою та багатоатомним спиртом. Переважно цукровими спиртами є манітол, сорбітол, циклітол, інозитол тощо, які можна застосовувати поодинці або у комбінаціях по двоє чи більше. Найприйнятнішим серед них є манітол. Уміст цукрового спирту переважно становить від 0,1 до 1,0 г у 100 мл розчину. При меншому вмісті стабільність не підвищиться. З іншого боку, надто велика кількість спирту може спричинити проблеми з підвищеним осмотичним тиском. Деякі стабілізатори, наприклад, цукровий спирт та інші, функціонують не лише у буквальному значенні цього терміну, але можуть брати на себе також інші ролі при приготуванні водної композиції згідно з винаходом, наприклад, ізотонічного реагенту. Ізотонічний реагент - ще один компонент водної композиції за винаходом - підтримує осмотичний тиск, коли еритропоетин уводиться до організму у вигляді розчину, а також додатково стабілізує еритропоетин у розчині. Серед прикладів ізотонічного реагенту можна навести водорозчинні неорганічні солі, такі, як хлорид натрію, хлорид кальцію, сульфат натрію то що. Ці солі можна застосовувати поодинці або у комбінаціях по двоє чи більше, і найприйнятнішою речовиною серед них є хлорид натрію. Уміст водорозчинної неорганічної солі переважно становить від 0,001 до 0,7 г у 100 мл розчину і може відповідно регулюватися, щоб водна композиція з усіма вищенаведеними компонентами залишалася ізотонічною. 8 Сполучення зазначених стабілізаторів з ізотонічним реагентом у водній композиції стабілізує еритропоетин у розчині синергійним, але не конкурентним чином. Дослідження авторів винаходу виявило, що якщо, наприклад, пропиленгліколь до певного ступеню стабілізує еритропоетин у розчині, навіть коли його вживають самого, стабільність суттєво зростає, якщо пропиленгликоль застосовувати разом із нейтральною амінокислотою. Також установлено, що при вживанні нейтральних амінокислот разом з іншими стабілізаторами, крім пропиленгліколю, стабільність буде нижчою у порівнянні із застосуванням нейтральних амінокислот разом з іншими стабілізаторами, включаючи пропиленгліколь. Отже, випущення будь-якого із зазначених вище стабілізаторів або ізотонічних реагентів призводить до помітного зменшення стабільності еритропоетину. Це доводять приклади та порівняльні приклади, наведені далі. У водних композиціях згідно з винаходом буферний реагент підтримує рН розчину з метою стабілізації еритропоетину. Переважно буферним реагентом слугує фосфатний буфер, цитратний буфер та подібні, причому найприйнятнішим є фосфа тний буфер. Наприклад, інтервал концентрацій фосфату, який утворює фосфатний буфер, переважно становить 5~50 мМ, а рН розчину переважно становить біля 6,0-8,0, найдоцільніше - біля 6,5~7,5. Водна композиція згідно з винаходом може за бажанням містити, крім стабілізаторів, ізотонічного реагенту та буферного реагенту, будь-які відомі речовини або матеріали, у кількості, яка не впливає на позитивні ефекти винаходу. Далі докладніше наводяться приклади композицій згідно з винаходом, однак вони носять суто ілюстративний характер і ніяким чином не обмежують обсяг винаходу. Приклад 1: приготування водної композиції людського еритропоетину-1 Готують ізотонічний розчин доданням 0,003 % полісорбату 20, 0,1 % пропиленгліколю, 1,5 % гліцину, 0,1 % хлориду натрію та 1,0 % манітолу до 10 мМ фосфатного буферного розчину та додають еритропоетину (фірми LG Life Science Co., Ltd.) до одержання біля 4000 од./мл. Одержаний розчин порціями по 2 мл обережно переливають до скляних флаконів на 3 мл та герметизують, після чого зберігають при температурах 25°С та 37°С відповідно. Порівняльний приклад 1: приготування водної композиції людського еритропоетину без добавок Еритропоетин у кількості 4000 од./мл додають до 10мМ фосфатного буферного розчину. Одержаний розчин порціями по 2 мл обережно переливають до скляних флаконів на 3 мл та герметизують, після чого зберігають при температурах 25°С та 37°С відповідно. Порівняльний приклад 2: приготування водної композиції людського еритропоетину з умістом лише полісорбату 20 Еритропоетин у кількості 4000 од./мл додають до 10мМ фосфатного буферного розчину з умістом 0,003 % полісорбату 20. Одержаний 9 82241 розчин порціями по 2 мл обережно переливають до скляних флаконів на 3 мл та герметизують, після чого зберігають при температурах 25°С та 37°С відповідно. Порівняльний приклад 3: приготування водної композиції людського еритропоетину без пропиленгліколю Готують ізотонічний розчин доданням 0,003 % полісорбату 20, 1,5 % гліцину, 0,1 % хлориду натрію та 1,0 % манітолу до 10 мМ фосфатного буферного розчину та додають біля 4000 од./мл еритропоетину. Одержаний розчин порціями по 2 мл обережно переливають до скляних флаконів на 3 мл та герметизують, після чого зберігають при температурах 25°С та 37°С відповідно. Порівняльний приклад 4: приготування водної композиції людського еритропоетину без гліцину Готують ізотонічний розчин доданням 0,003 % полісорбату 20, 0,5 % пропи-ленгліколю, 0,1 % хлориду натрію та 1,0 % манітолу до 10 мМ фосфа тного буферного розчину та додають біля 4000 од./мл еритропоетину. Одержаний розчин порціями по 2 мл обережно переливають до скляних флаконів на 3 мл та герметизують, після чого зберігають при температурах 25°С та 37°С відповідно. Порівняльний приклад 5: приготування водної композиції людського еритропоетину без гліцину Готують ізотонічний розчин доданням 0,003 % полісорбату 20, 0,5 % пропи-ленгліколю, 0,1 % хлориду натрію та 1,0 % манітолу до 10 мМ фосфа тного буферного розчину та додають біля 4000од./мл еритропоетину. Одержаний розчин порціями по 2 мл обережно переливають до скляних флаконів на 3 мл та герметизують, після чого зберігають при температурах 25°С та 37°С відповідно. Порівняльний приклад 5: приготування водної композиції людського еритропоетину без хлориду натрію Готують ізотонічний розчин доданням 0,003 % полісорбату 20, 1,7 % гліцину, 0,5 % пропиленгліколю та 1,0 % манітолу до 10 мМ фосфа тного буферного розчину та додають біля 4000 од./мл еритропоетину. Одержаний розчин порціями по 2 мл обережно переливають до скляних флаконів на 3 мл та герметизують, після чого зберігають при температурах 25°С та 37°С відповідно. Порівняльний приклад 6: приготування водної композиції людського еритропоетину без манітолу Готують ізотонічний розчин доданням 0,003 % полісорбату 20, 1,7 % гліцину, 0,5 % пропиленгліколю, 1,5 % гліцину та 0,1 % хлориду натрію до 10 мМ фосфатного буферного розчину та додають біля 4000 од./мл еритропоетину. Одержаний розчин порціями по 2 мл обережно переливають до скляних флаконів на 3 мл та герметизують, після чого зберігають при температурах 25°С та 37°С відповідно. Дослідний приклад 1: стабільність водних композицій людського еритропоетину Співвідношення мономеру та димеру еритропоетину у водних композиціях за прикладом 1 та порівняльними прикладами 1-6 визначають 10 рідинною гель-хроматографією високого розрізнення після зберігання протягом 3 та 5 тижнів відповідно. Результати наведені у табл. 1. Вихідний продукт, % 37°С 25°С 5 тиж. 3 тиж. 5 тиж. Приклад 1 Пор. пр. 1 Пор. пр. 2 Пор. пр. 3 Пор. пр. 4 Пор. пр. 5 Пор. пр. 6 3 тиж. 100 87,1 91Д 93,4 94,1 95,2 98,9 86,5 92,4 93,0 93,5 94,8 94,2 78,6 83,4 85,5 87,2 90,2 85,1 Як видно з табл. 1, у прикладі 1 - водній композиції еритропоетину згідно з винаходом вихідний продукт становить більше 92 % після зберігання протягом 5 тижнів при 37°С без жодних ознак димеру. З іншого боку, порівняльний приклад 2 з умістом у композиції лише полісорбату 20 показує високий вміст вихідного продукту проти порівняльного прикладу 1 без добавок, але димери мають місце. У порівняльних прикладах 36, де відсутній один із компонентів композиції за винаходом, виявляються димери при 37°С, за 3 тижні, а вміст вихідного продукту падає до приблизно 80 %. Більш того, у порівняльних прикладах 3 та 4, які не містять відповідно пропиленгліколю та гліцину, вміст вихідного продукту нижчий, ніж із композиції за прикладом 1, і димери мають місце. Ці результати підтверджують те, що пропиленгліколь та інші стабілізатори та ізотонічний реагент згідно з винаходом справляють синергійну дію, коли їх уживано у комбінації. Очевидно, що у той час, коли кожний з цих компонентів композиції за винаходом чинить стабілізуючу дію, протидія адгезії еритропоетину в розчині та стабільність водного розчину еритропоетину суттєво поліпшуються внаслідок синергійної дії усіх компонентів разом. Приклад 2: приготування водної композиції людського еритропоетину-2 Готують ізотонічний розчин доданням 0,01 % полісорбату 20, 0,1 % пропиленгліколю, 0,1 % гліцину, 0,55 % хлориду натрію та 1,0 % манітолу до 10 мМ фосфатного буферного розчину та додають біля 4000 од./мл еритропоетину. Одержаний розчин порціями по 0,5 мл виливають до заповненого шприца на 1 мл (фірми BectonDickinson), після чого зберігають при 40°С протягом 4 тижнів. Порівняльний приклад 7: приготування водної композиції людського еритропоетину без пропиленгліколю та манітолу До розчину з умістом 4,38 мг/мл хлориду натрію, 1,16 мг/мл монодинатрійфо-сфату (дигідрат), 2,23 мг/мл динатрійфосфату (дигідрат), 5 мг/мл гліцину та 0,3 мг/мл полісорбату 80 додають біля 4000 од./мл еритропоетину. 93,5 75,6 82,6 83,7 85,1 88,3 81,1 3 тиж 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 11 82241 Одержаний розчин порціями по 0,5 мл виливають до заповненого шприца на 1 мл (фірми BectonDickinson), після чого зберігають при 40°С протягом 4 тижнів. Дослідний приклад 2: стабільність водних композицій людського еритропоетину-2 Визначають чистоту та ви хід еритропоетину з водних композицій за прикладом 2 та порівняльним прикладом 7 рідинною гельхроматографією високого розрізнення після зберігання протягом 0, 1, 3 та 4 тижнів відповідно. Результати наведені у табл. 2. 12 Вихід, % 37°С 25°С Приклад 1 Пор. пр. 9 Пор. пр. 10 Пор. пр. 11 Пор. пр. 12 Пор. пр. 13 Зтиж. 100 нд нд ** *** нд 5 тиж. 3 тиж. 5 тиж. 98,9 нд нд ** *** нд 94,2 68,1 48,2 ** *** нд 93,5 72,9 * ** *** нд * - дослід зупинено внаслідок осадження. ** - дослід зупинено внаслідок Таблиця 2 осадження після приготування композицій. Вихід*** - дослід зупинено внаслідок осадження мономеру, % після 1 тиждень приготування композицій. 3 тижні 4 тижні 0 тижнів НД - немає даних. Приклад 2 100,0 95,8 89,9 приклад Порівняльний 13: 92,9 результати Порівн. прикл. 7 100,0 93,9одержані при 30°С та 50°С. 85,2 86,4 Як видно з табл. 4, у разі заміни деяких Як видно з табл. 2, композиція за винаходом компонентів водних композицій за прикладом 1 показує високий вихід 92,9 % після 4 тижнів винаходу на інші компоненти бажаних результатів інкубації, тоді як порівняльна композиція лише одержати не вдається. 86,4%. Отже, встановлено, що композиція за Приклад 3: приготування водної композиції винаходом підвищує стабільність еритропоетину в людського ерит-ропоетину-3 розчині. З метою одержання водних композицій з Порівняльні приклади 9-13: одержання різних іншими, ніж пропиленгліколь, багатоатомними водних композицій людського еритропоетину спиртами готують водні композиції еритропоетину Одержують водні композиції за табл.3, які за методикою прикладу 1, лише замінюючи відрізняються вмістом тих чи інших компонентів пропиленгліколь на 0,025 % ПЕГ від композиції за прикладом 1, та зберігають їх при (поліетиленгліколю з молекулярною масою 300). температурах 25°С та 37°С відповідно за тих Одержаний розчин уміщують до скляного самих умов, що у прикладі 1. флакона, герметизують та зберігають при 37°С. Дослідний приклад 4: стабільність водних композицій людського еритропоетину-4 Таблиця 3 Визначають співвідношення мономеру та Склад в еритропоетині з водних композицій за димеру композиції ΕΠΟ 4000 од./мл у ФБ, 0,5 %прикладом % 3 рідинною мМ цукрози, 1 мг/мл ПГ, 0,003 Tween 20, 0,5 гель-хроматографією Порівн. прикл. 9 NaCl високого розрізнення після зберігання протягом 3 Порівн.прикл. 10 ΕΠΟ 4000 одУмл у Tris, 0,5 % ПГ, 0,003 % Tween 20, 1,5% Gly, 1 мг/мл наведені у та 5 тижнів відповідно. Результати NaCl ΕΠΟ 4000 од./мл у ФБ, 0,5 % ПВП 15К, у порівнянні з результатами 0,1 % водної табл. 5 0,003 % Tween 20, 1,5 % Gly, для NaCl, Порівн. прикл. 11 1 % манітолу композиції за порівняльним прикладом 3 без ΕΠΟ 4000 од./мл у ФБ, 0,5 %умісту багатоатомного спирту. Gly, 1 мг/мл NaCl, ПГ, 0,003 % Tween 20, 1,5 % Порівн. прикл. 12 0,00001 % карбоксиметилцелюлози ΕΠΟ 4000 од./мл у ФБ, 2,0 % ПГ,2 % глюкози, 0,002 % лецитину, 0,001 % Порівн. прикл. 13 Tween20 Вихід, % ФБ - фосфатний буфер 5 тижнів ПГ – пропиленгліколь 3 тижні ПВП - полівінілпіролідон Приклад 3 100,0 97,2 Дослідний приклад 3: стабільність водних Порівн. прикл. 3 85,5 83,7 композицій людського еритропоетину-3 Визначають співвідношення мономеру та Як видно з табл. 5, приклад 3 - водна димеру в еритропоетині з водних композицій за композиція еритропоетину за винаходом із порівняльними прикладами 9-13 рідинною гельвикористанням поліетиленгліколю в якості хроматографією високого розрізнення після багатоатомного спирту - дає вихід мономеру 97 %, зберігання протягом 3 та 5 тижнів відповідно. а димерів не виявлено. Це суттєво відрізняється Результати наведені у табл. 4 у порівнянні з від водної композиції за порівняльним прикладом результатами для водних композицій за 3 без застосування багатоатомного спирту. прикладом 1. Приклад 4: стабільність водних композицій з високою концентрацією еритропоетину Таблиця % Готують ізотонічний розчин доданням 0,01 4 полісорбату 20, 0,1 % пропилен-гліколю, 1,5 % 3 ти 0,0 нд нд ** *** 46, 0,0 7,2 13 82241 14 гліцину, 1,0 % манітолу та 0,1 % хлориду натрію до 10 мМ фосфатного буферного розчину та додають біля 12000 од./мл еритропоетину. Одержаний розчин порціями по 0,5 мл виливають до заповненого шприца на 1 мл (фірми BectonDickinson), після чого зберігають при 5°С, 25°С та 40°С протягом 3 місяців відповідно. Дослідний приклад 5: стабільність водних композицій з високою концентрацією еритропоетину З метою підтвердження стабільності водних композицій з високою концентрацією еритропоетину визначають вихід та чистоту композиції, одержаної за прикладом 3, після зберігання протягом 0, 6 та 12 місяців при 5°С, протягом 2,4 та 6 місяців при 25°С і протягом 1,2 та 3 місяців при 40°С за допомогою рідинної гельхроматографії високого розрізнення та рідинної хроматографії високого розрізнення зі зворотною фазою. Ступінь фізіологічної активності визначали, вводячи композиції мишам лінії B6D2F1 та вимірюючи зростання ретикулоцитів. Результати наведені у табл. 6. Зберігання при 5°С Термін зберігання, 0 6 12 місяців Вихід, % 100,0 107,8 104,9 Чистота, % 100,0 99,9 99,9 Фізіологічна 89,7 90,8 Н.д. активність, % 8,0 8,5 9,0 81,7 69,8 55,3 Як видно з табл. 7, вихід мономеру перевищує 90 % навіть після 3 тижнів зберігання при 40°С у разі рН від 6,0 до 7,5. З цього витікає, що водні композиції еритропоетину згідно з винаходом, які містять неіонну поверхнево-активну речовину, пропиленгліколь, нейтральну амінокислоту, хлорид натрію та ізотонічний реагент, характеризуються дуже високою стабільністю при рН 6,0-7,5. Як зазначалося вище, водна композиція еритропоетину згідно з винаходом, яка містить людський еритропоетин та неіонну поверхневоактивну речовину, багатоатомний спирт, нейтральну амінокислоту, цукровий спирт у ролі стабілізатора, ізотонічний реагент та буферний реагент, протидіє зменшенню фізіологічної активності внаслідок денатурації при тривалому зберіганні у розчині, а крім того, запобігає адгезії еритропоетинових протеїнів до стінок ампул. Інші приклади та сфери застосування Таблиця 6 винаходу стануть очевидні для фахівців при вивченні опису та практичному здійсненні Зберігання при 25°С винаходу. Розуміється,40°С опис та Зберігання при що описаного приклади носять суто ілюстративний характер, а 2 4 6 1 2 3 обсяг конкретних випадків здійснення винаходу 100,0 визначається у наступній формулі. 100,0 103,9 100,0 96,1 94,1 100,0 99,8 99,3 99,8 99,3 99,2 90,4 90,8 93,8 105,3 82,8 91,8 Як видно з табл. 6, висока концентрація еритропоетину у водних композиціях показує повний вихід, чистоту та фізіологічну активність після зберігання аж до 12 місяців при 5°С та до 6 місяців при 25°С. Далі, вихід 94 % спостерігається після 3 місяців зберігання при 40°С при незначному зменшенні чистоти та фізіологічної активності. Отже, підтверджена дуже висока стабільність композицій за прикладом 2. Дослідний приклад 6: залежність стабільності від рН Додають 0,003 % полісорбату 20, 0,5 % пропиленгліколю, 1,5 % гліцину, 1,0 % манітолу та 0,1 % хлориду натрію до 10 мМ фосфатного буферного розчину та додають біля 4000 од./мл еритропоетину, після чого коригують рН ацетатом та гідроксидом натрію. Одержаний розчин розливають порціями по 2 мл до 3 мл пробірок, герметизують та зберігають при 40°С 3 тижні, після чого вимірюють співвідношення мономеру та димеру еритропоетину. Результати наведені у табл. 7. ТАБЛИЦЯ 7 рН 6,0 6,5 7,0 7,5 Вихідний продукт, % 94,4 95,2 94,3 90,3 Димер, % 0,0 0,0 0,0 0,0