Спосіб конструювання протипухлинної вакцини

Реферат: Спосіб конструювання протипухлинної вакцини шляхом одночасного використання комплексів білків теплового шоку з молекулярною масою 70 кДа з ксеногенними ембріональними білками курки і аутологічними пухлинними антигенами. UA 83120 U (12) UA 83120 U UA 83120 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель, що заявляється, належить до медицини, зокрема до онкології, і стосується технології одержання протипухлинних засобів. Одним з важливих механізмів, що дозволяють протистояти появі злоякісних новоутворень, є імунний нагляд. Адекватний рівень імунного захисту здебільшого визначає успіх протипухлинного лікування. Створення протипухлинних вакцин (ПВ), які використовуються для формування специфічної імунної відповіді на пухлинні антигени, суттєво підвищує ефективність лікування онкологічних хворих. Проте, для активного впровадження таких вакцин у клінічну практику потрібно позбутися ряду існуючих недоліків (слабка імуногенність, вузька специфічність тощо). Однією з успішних стратегій підвищення ефективності вакцинотерапії пухлин є поєднане застосування у ПВ імунотропних речовин природного і синтетичного походження - так званих ад'ювантів. В сучасній біотерапії раку використовують комплексні ПВ, які складаються з пухлинних клітин, які попередньо піддавали тепловому шоку, та дендритних клітин. Введення таких вакцин призводить до розвитку протипухлинної імунної відповіді за участю CD4+ та CD8+ Т-лімфоцитів [1]. Недоліками цього способу є складність і наявність трудомістких технологічних прийомів, що пов'язані з виділенням й очищенням аутологічних дендритних клітин, крім того, при їх використанні ймовірний розвиток побічних ефектів у вигляді аутоімунних реакцій. Відомо спосіб одержання аутологічної ПВ, яка складається з виділених з пухлинної тканини пацієнта пухлинних антигенів в комплексі з шаперонами [2]. Перед вакцинацією пацієнту вводять атенуйований вірус хвороби Ньюкасла як ад'юванту. Недоліками способу є високе антигенне навантаження за рахунок введення вірусних білків та можливість виникнення побічних запальних проявів. Вибраний як показник рівня техніки і водночас як прототип спосіб одержання ПВ шляхом модифікації ксеногенних ембріональних білків курки ад'ювантом бактеріального походження [3]. Цей спосіб є найбільш близьким по технічній суті до способу, що заявляється, і полягає у використанні для створення ПВ ембріональних ксеногенних протеїнів та як ад'юванту цитотоксичного білоквмісного метаболіту Bacillus subtilis IMBB-7025 з молекулярною масою 70 кДа. Однак, одержана таким чином ПВ не в повній мірі забезпечує протипухлинний ефект в зв'язку з тим, що ксеногенні ембріональні протеїни не активують специфічну ланку імунної системи, крім того, вакцина, одержана за відомим способом, містить значну кількість ксеногенних білків, тобто має високе антигенне навантаження, при цьому можливе виникнення побічних запальних проявів. В основу корисної моделі, що заявляється, поставлено задачу конструювання ПВ, здатної залучати неспецифічну і специфічну ланки імунної системи зі зниженням ризику виникнення побічних запальних процесів. Поставлена задача вирішується тим, що в способі конструювання ПВ використовують білки теплового шоку (БТШ), а саме: одночасно БТШ з ксеногенних ембріональних тканин курки і БТШ з аутологічних пухлинних клітин, що забезпечує залучення обох ланок імунної системи і покращує ефективність заявленої вакцини. Використання аутологічних (з пухлинної тканини) та виділених з ембріональної тканини курки БТШ з чітко визначеною молекулярною масою (70 кДа), які утворюють комплекси з пухлиноасоційованими антигенами (БТШ-пептидні комплекси), дозволяє забезпечити оптимальну кількість антигенних пептидів і зменшити, таким чином, антигенне навантаження на організм. Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю ознак способу, що заявляється, та технічним результатом корисної моделі наступний. Множинність функцій БТШ обумовлена їх здатністю зв'язуватись з іншими пептидами і у вигляді таких комплексів приймати участь у різноманітних клітинних процесах [4]. БТШ спроможні багаторазово підвищувати імуногенність антигенних пептидів, пов'язаних з ними [5]. Крім того, БТШ є сильними ендогенними ад'ювантами і можуть використовуватись як в асоціації із синтетичними антигенами, так і у вигляді комплексу БТШ-антиген, отриманого безпосередньо з поверхні пухлинних клітин. Вплив високої температури на пухлинні клітини (42-44 °C) призводить до підвищення експресії в них БТШ і, як наслідок, підвищення імуногенності пухлинних антигенів. Це стало основою для використання БТШ у різних технологіях виготовлення ПВ [6]. Одним з аналогів пухлинного матеріалу є ембріональні клітини. Вони подібні між собою завдяки експресії цілого ряду білків - онкофетальних антигенів, ростових факторів, факторів ангіогенезу, їх рецепторів тощо. Оскільки більшість пухлиноасоційованих антигенів чи білківучасників канцерогенезу (фактори росту і ангіогенезу) представлена еволюційно консервативними молекулами, то наслідком цього є високий ступінь гомології між цими білками 1 UA 83120 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 людини і тварин. З іншого боку, саме ці невеликі міжвидові структурні відмінності можна успішно використовувати при конструюванні ПВ [7]. Курячі ембріональні білки є зручним об'єктом при створенні ПВ завдяки доступності матеріалу, відсутності вірусів патогенних для людини та підвищеного вмісту БТШ з молекулярною масою 70 кДа (БТШ 70). Застосування ксеногенних БТШ-пептидних комплексів, отриманих з ембріональної тканини курки, здатне подолати імунологічну толерантність до антигенів пухлини. Для виготовлення вакцин використовують лише збагачені БТШ фракції білкових екстрактів, що зменшує антигенне навантаження на організм, при цьому БТШ підвищують імуногенність пухлинних антигенів, а використання ксеногенних БТШ-пептидних комплексів призводить до посилення протипухлинної активності вакцини за рахунок стимуляції неспецифічної ланки імунної системи та використовується як додатковий ад'ювант. Лабораторна технологія конструювання ПВ, що заявляється. Індукцію БТШ у пухлинній тканині проводили шляхом прогрівання пухлини (до 1 см в діаметрі) при температурі 43,0±0,30 °C з експозицією 1 год. на експериментальному генераторі (434 МГц, "Istok", Російська Федерація). Пухлини видаляли через 24 год. після гіпертермії (оптимальний термін накопичення БТШ в тканині). Для виділення білкових екстрактів з ембріональної та пухлинної тканин використовували метод висолювання білків сульфатом амонію; для поділу отриманих білкових екстрактів на окремі складові використано методи колонкової хроматографія на Sephacryl S-100 [8] та йонообмінної хроматографії з використанням ДЕАЕ-целюлози [9]. Білковий склад фракцій оцінювали за допомогою SDS-електрофорезу (метод Леммлі). Відбір фракцій здійснювали за наявністю в них БТШ з молекулярною масою 70 кДа, вміст даних білків підтверджували методом імуно-блот тесту з використанням моноклональних антитіл до БТШ-70 фірми ENZO (США). У стерильний флакон вносять 1 мл БТШ-пептидного комплексу з ембріональної тканини курки в концентрації 0,3 мг/мл по білку, додають 1 мл БТШ-пептидного комплексу з аутологічних пухлинних клітин в концентрації 0,3 мг/мл по білку, та 1 мл білоквмісного метаболіту В. subtilis B-7025 70 кДа у концентрації 0,6 мг/мл по білку. Після цього одержану суміш струшують на шейкері 15 хв. та проводять інкубацію в термостаті при 38 °C протягом 1 години. Після закінчення інкубації вакцину перевіряють на стерильність та зберігають при t°-20 °C. Ефективність ПВ, сконструйованої на основі очищених БТШ-пептидних комплексів, отриманих з пухлинної та ембріональної тканин, і метаболіту В. subtilis В-7025 з молекулярною масою 70 кДа як ад'юванту – (вакцина заявлена) порівнювали з такою ПВ, що виготовлена за допомогою вказаного ад'юванту на основі курячих ембріональних білків (вакцина відома). Як модельну пухлину використовували метастазуючу карциному легені Льюїс (КЛЛ) [10]. Пухлинні клітини (КЛЛ) перещеплювали в праву задню кінцівку тварин із розрахунку 6 10 /тварину по стандартній методиці. Вакцини починали вводити на 2 добу після перещеплення, вакцинотерапію проводили 4-разово (2, 5, 12 та 19 доба). Вакцину, виготовлену на основі БТШпептидних комплексів (вакцина заявлена), вводили підшкірно (концентрація по білку 0,3 мг/мл, по 0,3 мл/тварину на 1 ін'єкцію). Вакцину на основі курячих ембріональних білків (вакцина відома) готували із розрахунку по білку 0,3 мг/мл, на 1 мг/мл розчину білоквмісного метаболіту В.subtilis В-7025 і вводили підшкірно по 0,2 мл/тварину на 1 ін'єкцію. Порівняння впливу ПВ на перебіг пухлинного процесу та основні реакції протипухлинного захисту оцінювали за показниками активності цитотоксичних Т-лімфоцитів (ЦТЛ) та макрофагів (Мф). Для характеристики перебігу пухлинного процесу визначали гальмування розвитку метастазів. Розраховували індекси інгібіції метастазування (ІІМ) в порівнянні з відповідним контролем. Приклади практичного застосування корисної моделі. Приклад 1. Антиметастатична активність вакцин, сконструйованих на основі ксеногеннних ембріональних білків (вакцина відома) та БТШ-пептидних комплексів з ксеногенних ембріональних та аутологічних пухлинних тканин (вакцина заявлена). Частота метастазування КЛЛ у легені після використання вакцини відомої зменшувалась до 30,0 %. Відповідні показники для вакцини заявленої були суттєво кращими і складали 17,5 % (р