Спосіб одержання протипухлинної вакцини

Реферат: Спосіб одержання протипухлинної вакцини здійснюють шляхом обробки пухлинних клітин білоквмісним метаболітом культуральної рідини B. subtilis B-7025 з молекулярною масою 70 кДа та інкубації суміші. Як пухлинні антигени використовують протеїни ембріональної нервової тканини щура пізнього періоду гестації. UA 78756 U (12) UA 78756 U UA 78756 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі медицини, а саме до онкології, і стосується технології одержання протипухлинних засобів. Підвищення ефективності лікування хворих на злоякісні новоутворення - центральна проблема і мета експериментальної та клінічної онкології. Найбільш інтенсивно розробляються методи імунотерапії пухлин, які ґрунтуються на специфічній індукції протипухлинної резистентності організму шляхом імунізації протипухлинними вакцинами (ПВ). Розроблено цілий ряд ПВ, технологія виготовлення яких базується на використанні аутологічних або алогенних пухлинних антигенів [1, 2]. Завдяки експресії деяких антигенів ембріональні та пухлинні клітини подібні між собою, що забезпечує можливість їх використання з метою подолання імунологічної толерантності організму [3]. Більш того, ембріональні антигени більшості живих організмів мають спільне походження, а отже і спільні, але "модифіковані" антигенні детермінанти, на які може бути сформована повноцінна імунна відповідь. За рахунок формування перехресних імунних реакцій відбувається гальмування пухлинного процесу. Під впливом алогенних гомогенатів або екстрактів ембріональної селезінки та тимуса у онкологічних хворих відбувається гальмування росту пухлин, у деяких випадках розсмоктування новоутворень [4]. Експериментально обґрунтована можливість застосування для імунотерапії злоякісних пухлин ксеногенних фетальних протеїнів [5]. На сьогодні вже є окремі повідомлення щодо ефективності застосування ксеногенних ембріональних протеїнів для імунотерапії хворих на рак різного генезу [6, 7]. Для цього використовують екстракти з ембріональних і плацентарних тканин різних тварин [8-10]. Використання ембріональних протеїнів в якості "універсальних" специфічних імуногенів відкриває нові можливості для конструювання ПВ на їх основі. Спроби застосування ембріональних тканин для створення ксеногенних ПВ базуються на їх унікальних властивостях, зокрема наявності та продукуванні великої кількості речовин, які здатні стимулювати імунокомпетентні клітини [11]. Найбільш близьким способом одержання ПВ до способу, що заявляється, є спосіб приготування вакцини шляхом обробки пухлинних клітин продуктами метаболізму штаму В. 6 subtilis IMB В-7025 з молекулярною масою 70 кДа, в дозі 0,3 мг/мл препарату на 30,0×10 пухлинних клітин в 1 мл вакцини [12]. Одержану суміш струшують на шейкері 15 хв та інкубують в термостаті при 38 °C протягом 1 години. Після закінчення інкубації вакцину перевіряють на стерильність та життєздатність пухлинних клітин і зберігають при -20 °C. Однак, одержані таким чином ПВ не забезпечують високу антиметастатичну ефективність в зв'язку з імунологічною толерантністю організму до антигенів власної пухлини. Використання чужорідного аналога пухлинних антигенів дозволяє досягнути цієї мети - введення ксеногенних ембріональних протеїнів здатне викликати достатню імунну відповідь проти власних ендогенних протеїнів пухлини [6, 13]. Крім того, використання ксеногенних ембріональних протеїнів як "універсального пухлинного антигена" при одержання протипухлинної вакцини забезпечує можливість вакцинації при відсутності аутологічного пухлинного матеріалу. В основу корисної моделі поставлена задача одержати ПВ, здатну подолати імунологічну толерантність до білків власної пухлини. Для цього в способі одержання ПВ замість антигенів пухлинних клітин, які є слабко імуногенними для організму, використовують чужорідні ксеногенні ембріональні протеїни разом з ад'ювантом бактеріального походження. Такий підхід дозволяє покращити стандартизацію ПВ та забезпечує можливість проведення вакцинації при відсутності аутологічного пухлинного матеріалу. Поставлена задача вирішується тим, що в способі одержання ПВ використовують білоквмісний екстракт нервової тканини ембріонів щурів пізнього періоду гестації (22 доба ембріогенезу) та білоквмісний метаболіт В. subtilis В-7025 з молекулярною масою 70 кДа. Така ПВ має високу антиметастатичну активність, що здатна подолати імунологічну толерантність організму до пухлинних клітин. Білоквмісні екстракти нервової ембріональної тканини отримували методом ЕДТА-екстракції (етилендіамінтетраоцтовою кислотою). Для цього до 1 г ембріональної нервової тканини щура, подрібненої в гомогенізаторі Поттера, додають 10 мл 0,1 % розчину ЕДТА. Суміш струшують протягом 60 хв. В подальшому суспензію центрифугують протягом 15 хв при 8000 об./хв. Осад видаляють, а в надосадовій рідині визначають концентрацію білка та оцінюють білковий склад в SDS-електрофорезі. Білкові екстракти зберігають при t-20 °C. Використання білоквмісного метаболіту В. subtilis В-7025 з молекулярною масою 70 кДа в якості ад'юванта обумовлено тим, що цей бактеріальний метаболіт володіє цитотоксичною дією in vitro на пухлинні клітини за рахунок зв'язування з клітинною мембраною та "злущування" з її поверхні білків, викликаючи загибель пухлинних клітин [12]. 1 UA 78756 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Лабораторна технологія одержання ПВ, що заявляється. У стерильний флакон вносять 1 мл підготовленого екстракту ембріональних протеїнів нервової тканини щура в концентрації 0,3 мг/мл по білку та додають 1 мл білоквмісного метаболіту В. subtilis В-7025 70 кДа у концентрації 0,3 мг/мл по білку. Після цього одержану суміш струшують на шейкері 15 хв та проводять інкубацію в термостаті при 37 °C протягом 1 год. Після закінчення інкубації вакцину перевіряють на стерильність та зберігають при t-20 °C. Нетоксичність та імуногенність заявленої ПВ доведено на інтактних мишах лінії С57ВІ/6 масою 20-22 г розведення експериментальної бази Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України (далі ІЕПОР). Для цього ПВ вводили в ділянку спини підшкірно (п/ш) тричі з інтервалом в 3 доби (концентрація по білку сумарно 0,3 мг/мл). На 7-у добу після останнього введення ПВ оцінювали вагові та клітинні показники імунокомпетентних органів (селезінки, тимуса, периферичних лімфатичних вузлів), периферичної крові, активність природних кілерних клітин (ПКК), а також рівень в сироватці крові мишей циркулюючих імунних комплексів та перехресно реагуючих антитіл з антигенами карциноми легені Льюїса (КЛЛ). Протипухлинну та антиметастатичну ефективність заявленої ПВ досліджували на експериментальних тваринах - мишах лінії С57ВІ/6, масою 20-22 г, розведення експериментальної бази IEПОР, з модельною метастазуючою пухлиною - КЛЛ. Стандартний штам пухлини одержано з Національного банку культур тканин та штамів пухлин ІЕПОР. 5 Пухлинні клітини трансплантували шляхом введення 4,0×10 в 0,2 мл фізіологічного розчину 5 хлориду натрію у м'язи гомілки (досліди без хірургічного видалення пухлини) або 2,5×10 в 0,05 мл у стопу задньої кінцівки (досліди з хірургічним видаленням пухлини), згідно загально прийнятої методики. В експериментах in vivo застосовували терапевтичну модель використання ПВ: вакцинацію тварин проводили після прищеплення пухлин або після хірургічного видалення первинної пухлини. Для характеристики перебігу пухлинного процесу визначали розміри (об'єми) первинної пухлини, кількість і розміри метастазів. Розраховували індекси гальмування росту пухлин (ІГ) та індекси інгібіції метастазування (IIМ) в порівнянні з відповідним контролем. Прототипом заявленої вакцини є ПВ, розроблена в ІЕПОР, виготовлена на основі пухлинних клітин КЛЛ та вищезазначеного ад'юванту. Дана експериментальна модель була обрана як приклад низько імуногенної пухлини для оцінки ефективності ПВ. Суттєвою відмінністю між вакциною, що заявляється, та вакциною-прототипом є, по-перше, - використання як антигенної складової ПВ ембріональних протеїнів замість антигенів пухлинних клітин; по-друге, - наявність ксеногенної складової (протеїни ембріональної нервової тканини щура), за рахунок якої підсилюються імуногенні властивості вакцини. Приклади практичного застосування корисної моделі Приклад 1 Протипухлинна та антиметастатична ефективність вакцин, виготовлених на основі гомологічних пухлинних клітин (прототип) та ксеногеннних ембріональних білків (заявлена), на моделі КЛЛ (без хірургічного видалення первинної пухлини). 5 Живі пухлинні клітини (КЛЛ) перещеплювали у м'язи гомілки тварин із розрахунку 4,0×10 в 0,2 мл фізіологічного розчину хлориду натрію за стандартною методикою. Введення вакцинипрототипу та заявленої розпочинали на 2 добу після перещеплення пухлинних клітин і проводили тричі з інтервалом в 3 доби (п/ш, концентрація по білку 0,3 мг/мл, по 0,3 мл/тварину на 1 ін'єкцію). Протипухлинний ефект досліджуваних вакцин оцінювали на 15 та 28 добу після перещеплення КЛЛ за об'ємом первинного пухлинного вузла та індексом гальмування росту пухлини (табл. 1). Таблиця 1 Об'єм первинної пухлини та індекс гальмування росту КЛЛ при застосуванні вакцини з гомологічних пухлинних клітин (прототип) і ксеногенних ембріональних білків (вакцина заявлена), виготовлених за допомогою білоквмісного метаболіту В. subtilis В-7025 (70 кДа) Лікування Об'єм первинної пухлини, мм 3 Індекс гальмування росту пухлини, % 15 доба 28 доба 15 доба Контроль пухлинного росту (фізіологічний розчин NaCl) Вакцина (прототип) 28 доба 1598,1±875,6 2759,3±307,1 521,6±148,3 2095,0±361,5 67,4 24,1 2 UA 78756 U Продовження таблиці 1 Об'єм первинної пухлини, мм Лікування 15 доба 963,5±182,9 Вакцина (заявлена) 5 10 3 28 доба 3759,9±616,9 Індекс гальмування росту пухлини, % 15 доба 28 доба 39,7 0,0 Використання вакцини (прототипу) і вакцини (заявленої) однаково не впливало на частоту (100 %) та термін виникнення пухлин (латентний період виходу новоутворень, який у контрольній та дослідних групах був практично однаковим і в середньому становив 8-9 діб). При аналізі показника середнього об'єму пухлини на 15-у добу було зафіксовано гальмування росту пухлини на 67,4 % (вакцина-прототип) і на 39,7 % (вакцина (заявлена). На 28-у добу росту КЛЛ зазначений показник був на рівні не вакцинованих тварин (контроль пухлинного росту). Таким чином, при аналізі показників росту первинної пухлини КЛЛ не одержано даних про перевагу вакцини заявленої над вакциною-прототипом. В цілому їх протипухлинна активність без хірургічного видалення первинної пухлини була досить низькою. Результати аналізу антиметастатичної активності зазначених ПВ істотно відрізнялись (табл. 2). Таблиця 2 Частота метастазування КЛЛ після застосування вакцин з гомологічних пухлинних клітин (прототип) та ксеногеннних ембріональних білків (заявлена), виготовлених за допомогою метаболіту B. subtilis B-7025 70 кДа (строк спостереження - 28 доба після перещеплення КЛЛ) Група тварин Контроль пухлинного росту Вакцина (прототип) Вакцина заявлена Частота метастазування, % Середня кількість метастазів на мишу/(*ІМ, %) 100,0 16,5±5,3 66,7±17,2 66,7±19,2 27,5±10,2 (+66,7 %) 14,5±4,9 (-12,1 %) **ІІМ, % Середній об'єм 3 метастазів, мм /(*ІМ, %) 117,7±85,5 +11,2 % -41,4 % 89,6±52,4 (-23,9 %) 12,8±5,1 (-89,1 %) Примітки, в таблицях 2 і 3: * - індекси модуляції (%) розраховані на основі показників відповідного контролю перещеплення за формулою: (дослід-контроль/контроль) х 100 %. ** - індекси інгібіції метастазування (ІІМ, %) розраховані за формулою: А хВ  АхВ IIM  к к х100% , Ак хВк де Ак і А - кількість тварин з метастазами в контрольній і дослідній групах; Вк і В - середня кількість метастазів в легенях тварин контрольної і дослідної груп. 15 20 25 Вони свідчать про те, що використання вакцин (прототипу та заявленої) однаково зменшувало частоту метастазування до 66,7 %, але за показниками кількості і об'єму метастазів заявлена вакцина мала суттєві переваги над вакциною-прототипом. Так, індекс інгібіції метастазування для зазначених вакцин відповідно складав -41,4 та +11,2 %. Крім того, середній 3 об'єм метастазів у мишей, які одержали вакцину (заявлену), складав 12,8±5,1мм , що було вірогідно меншим (р