Спосіб підвищення ефективності протипухлинної вакцини

Спосіб підвищення ефективності протипухлинної вакцини шляхом застосування імуномодулюючого препарату бактеріального походження, який відрізняється тим, що в період імунізації протипухлинною вакциною 5-15-кратно перорально вводять препарат субалін. Винахід відноситься до медицини, а саме, до онкології і стосується способу підвищення ефективності протипухлинних засобів. Центральна проблема і мета експериментальної і клінічної онкології підвищення ефективності лікування хворих злоякісними новоутвореннями. Найінтенсивніше розробляються засоби імунотерапії пухлин, які ґрунтуються на специфічній індукції протипухлинної резистентності організму, а саме, імунізації протипухлинними вакцинами, що містять пухлиноасоційовані антигени. Такі вакцини являють собою вбиті і модифіковані вірусами чи мікробами пухлинні клітини або їх фрагменти. Встановлено, що при застосуванні протипухлинних вакцин спостерігається позитивна динаміка в лікуванні хворих колоректальним раком, меланомою, раком нирок та інших локалізацій [1-3]. Результати експериментальних та клінічних досліджень ефективності вітчизняної протипухлинної аутовакцини для профілактики рецидивів та метастазів показали її стимулюючий вплив на активність клітинного і гуморального імунітету [4-6]. Проте, аналіз сучасних даних щодо застосування в онкологічній практиці протипухлинних вакцин свідчить про неможливість досягнення високого ступеня профілактичної і терапевтичної ефективності лікування хворих за допомогою засобів імунотерапії. Відомо, що практично всі специфічні протипухлинні вакцини діють ефективніше при використанні їх з ад'ювантами різного походження (RANES, DETOX, БЦЖ, цитокіни та ін. імуномодулятори). Для лікування онкологічних захворювань все частіше застосовуються комбіновані схеми лікування, використовуючи при цьому широкий спектр модифікаторів біологічних реакцій. В останній час інтенсивно вивчається можливість використання в якості ад'ювантів різних цитокінів, які здатні чинити стимулюючий вплив на ключовий ланцюг імунної відповіді. Відома ад'ювантна дія широкого спектру цитокінів: інтерферон (ІФН ) , , , ІЛ-1, -2, -5, -6 [7-9]. Однак їх використання обмежене високою вартістю і парентеральними формами введення препаратів. (19) UA (11) 76656 (13) (21) a200502695 (22) 24.03.2005 (24) 15.08.2006 (46) 15.08.2006, Бюл. № 8, 2006 р. (72) Потебня Григорій Платонович, Сафронова Лариса Анатоліївна, Підгорський Валентин Степанович, Черемшенко Надія Леонідівна, Лісовенко Галина Степанівна, Сорокулова Ірина Борисівна, Приходько Валерія Олексіївна, Танасієнко Ольга Андріївна, Чехун Василь Федорович (73) ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ ПАТОЛОГІЇ, ОНКОЛОГІЇ І РАДІОБІОЛОГІЇ ІМ. Р.Є. КАВЕЦЬКОГО НАН УКРАЇНИ, ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ІМ. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО НАН УКРАЇНИ (56) UA, С2, 57869, 15.07.2003 UA, C2, 26068, 30.04.1999 UA, C2, 47308, 15.08.2004 C2 1 3 76656 4 Останнім часом велику увагу приділяють синтезу універсального антивірусного агента розробці імуномодуляторів на основі різних штамів інтерферону людини. Здатність до синтезу людсьмікроорганізмів, які мають імуномодулюючу і прокого а-інтерферону є вагомою перевагою типухлинну активність. Такі препарати почали випробіотика з бацил порівняно з бластоленом. користовувати в онкології для підвищення Відомо, що рекомбінантний -інтерферон є одефективності протипухлинної хіміо- та променевої ним з перших цитокінів, який з успіхом терапії, зниження їх небажаної токсичної дії, або з використовується в клінічній практиці при вірусних метою запуску чи активації специфічних захворюваннях та імунодефіцитних станах. механізмів, які здатні елімінувати злоякісні клітини Інтерферон є одним з ключових факторів активації з організму чи запобігти їх розвитку. В цьому плані механізмів неспецифічної резистентності. Крім велику увагу приділяють пробіотикам - препаратам того, дуже важливим моментом є те, що синтез з живих мікробних культур, які є багатим джерелом інтерферону здійснюється бактеріями, які вводять отримання біологічно активних речовин, що мають перорально в шлунково-кишковий тракт. Такий протипухлинну дію [9-11]. спосіб введення інтерферону має ряд переваг Найближчим аналогом до способу, що порівняно з парентеральним надходженням заявляється, є підвищення ефективності відомих препаратів інтерферону. протипухлинної вакцини за допомогою При цьому знижується імунна відповідь по імуномодулюючого препарату бластолен, цей відношенню до інтерферону, який виробляється аналог ми беремо за прототип [12]. Дослідження бактеріями в кишечнику, збільшується термін його комбінованого застосування протипухлинної вакдії, а також не спостерігається побічної дії препацини та бластолену проведені на моделі солідної рату [15]. Розроблений в Інституті мікробіології і форми саркоми-37 у мишей лінії Balb/c. Протипухвірусології НАН України разом з науковолинну вакцину, виготовлену за способом [ІЗ], вводослідним конструкторсько-технологічним дили підшкірне на 1, 4 та 9-у добу, разова доза Інститутом біологічно активних речовин НПО "Векскладала 0,3 мл. Розчин бластолену готували ex тор" (RU) [Патент України № 26068 А61К35/74, tempore, разова доза складала 2 мкг в 0,2 мл C12N1/21] пробіотик субалін не має аналогів в ізотонічного розчину і вводили підшкірне на 1 і 9-у СНГ та за кордоном. Препарат субалін дозволений добу за 3 год до застосування протипухлинної комітетом з питань імунобіологічних препаратів вакцини. Доведене підвищення ефективності МОЗ України для медичного застосування [Протокомбінованого застосування протипухлинної ваккол № 8/99 від 03.11.99 р.]. цини і бластолену завдяки значніше вираженому Препарат характеризується високою гальмуванню пухлинного росту, ніж при антагоністичною активністю по відношенню до ізольованому використанні протипухлинної вакциширокого спектру патогенних і умовно патогенних ни і бластолену, та зростанню середньої мікроорганізмів та антивірусною активністю. тривалості життя дослідних тварин. Але описаний Проведені всебічні випробування безпечності ( засіб, за допомогою якого підвищують протипухвключаючи гістологічне вивчення різних органів і линну ефективність вакцини, досить дорогий. тканин) препарату субаліну та культури, яка вхоВ основу винаходу, що заявляється, поставдить до його складу, на лабораторних та лено задачу удосконалення способу підвищення сільськогосподарських тваринах довели, що при ефективності протипухлинної вакцини шляхом різних способах введення (в тому числі і парентевключення в схему імунізації пробіотика ральному) в дозах, які значно перевищують бактеріального походження нового покоління, рекомендовані до застосування, ні культура, ні нешкідливого для організму з тим, щоб забезпечипрепарат не викликають у тварин ніяких ти значне підвищення ефективності патологічних змін [15]. протипухлинної вакцини при зменшенні додаткоПроведені клінічні випробування субаліну дових витрат на імунізацію. вели його безпечність і високу ефективність при Поставлена задача вирішується тим, що в лікуванні гепатитів А та В, менінгоенцефалітів період імунізації протипухлинною вакциною застовірусної, бактеріальної та змішаної етіології, госсовують препарат субалін [14]. трих кишкових інфекцій. Побічних ефектів, Суть способу підвищення ефективності пов'язаних із його застосуванням, не виявлено [16] протипухлинної вакцини полягає у тому, що пре. Протипоказань для застосування субаліну не парат субалін включають в схему вакцинотерапії зареєстровано. шляхом 5-15 - ти кратного перорального введення. Субалін здатний також підвищувати Удосконалення відомого способу вирішується ефективність терапевтичної дії циклофосфану за за рахунок комбінованого застосування рахунок стимулюючого впливу на цитотоксичну протипухлинної вакцини та субаліну, які проявляактивність перитонеальних макрофагів [ 16 ]. ють синергічну протипухлинну дію, що й дозволяє Синергічна дія протипухлинної вакцини та підвищити імуногенність вакцини, підсилити просубаліну обумовлена скоріше за все регулюючим типухлинну резистентність організму і таким чином ефектом а-інтерферону, який продукується досягти значно вищої лікувальної ефективності та бактеріями пробіотика в кишечнику. Інтерферон в 2 рази зменшити витрати на імунізацію за спосовзаємодіє з рецепторами слизової оболонки та бом, що заявляється, завдяки значно дешевшому чинить системний імуномодулюючий вплив на ад'юванту та пероральному його застосуванню. імунокомпетентні клітини слизової оболонки киПрепарат субалін відносять до пробіотиків ношечника. Пероральний спосіб доставки вого покоління. Його основою є рекомбінантний інтерферону в організм має ряд переваг, а отже штам бактерій B.subtillis 2335/105, який містить ген 5 76656 6 очевидною є і перспективність використання індекс гальмування росту пухлини за формулою: субаліну в якості ад'юванта[15-17]. ІГП=(Ак - Ад) : Ак х 100 %; Субалін допомагає модифікувати стан пухде Ак - середній об'єм первинного пухлинного линних клітин, обмежуючи їх генетичну вузла в контрольній групі (мм3); нестабільність, регулюючи реакції на ростові факАд - середній об'єм первинного пухлинного 3 тори, потенцюючи імуногенність, пригнічуючи вузла в дослідній групі (мм ). ангіогенез, а також здатний підвищувати Антиметастатичну дію препаратів оцінювали активність ефекторних клітин системи природної по середній кількості метастазів на 1 тварину і вирезистентності організму. раховували індекс гальмування метастазування за Сукупність експериментальних та клінічних формулою; ІГМ=(Вк - Вд) : Вк х 100 %; даних і дала основу для включення субаліну в де Вк - середня кількість метастазів на 1 твасхему імунізації для підвищення ефективності рину в контрольній групі; протипухлинної вакцини. Вд - середня кількість метастазів на 1 тварину Спосіб підвищення ефективності в дослідній групі. протипухлинної вакцини здійснювали за наступних Середню тривалість життя (СТЖ) розраховуумов. Протипухлинну терапевтичну активність вали на основі даних про тривалість життя всіх комбінованого застосування вакцини та субаліну тварин групи. досліджували на експериментальних тваринах, на Для висновку про характер взаємодії моделі солідної форми карциноми легені Льюіс, протипухлинної вакцини та субаліну оскільки саме ця модель пухлинного росту метапідраховували очікуваний ефект за формулою: стазуюча і вважається наближеною до клінічних А+(100 – А х В: 100), де А - ефект першого впливу. форм. У кожній експериментальній групі було по 8В - ефект другого впливу. Якщо реальний ефект 10 мишей-самців лінії С57ВІ (2-2,5-місячного віку з був рівний очікуваному або перевищував його, масою 18-20 г). Тваринам прищеплювали робили висновок про потенцюючу дію агентів [17]. внутрішньом'язево по 1х106 живих клітин карциноСуть способу, що заявляється, пояснюють ми Льюіс. Протипухлинну вакцину, одержану за приклади конкретного виконання: способом [патенту № 57869], вводили 3-кратно, Приклад 1 підшкірне в однакових дозах (0,3 мл) на 1, 4, 9 доПроведено терапевтичний дослід, де після бу після прищеплення пухлинних клітин. Розчин прищеплення пухлини субалін вводили щоденно субаліну готували кожного разу ех tempore та ввоперорально протягом 3-х діб в дозі 1х108 КУО на дили в об'ємі 0,5 мл ізотонічного розчину, щоденно мишу в об'ємі 0,5 мл ізотонічного розчину (група перорально протягом 5-15-ти діб в дозі (1х108) 1). Вакцину вводили підшкірне, 3-кратно (по 0,3 колонієутворюючих одиниць (КУО). Миші мл), на 1, 4, 9 добу (група П). Мишам дослідної дослідних груп одержували субалін (І група), вакгрупи Ш вводили комбіновано субалін та вакцину. цину (II група) та комбіновано субалін з вакциною Мишам контрольної IV групи вводили ізотонічний (III група). Мишам контрольної IV групи після прирозчин. щеплення пухлини вводили ізотонічний розчин. Протипухлинну резистентність мишей до карЕфективність лікування визначали по гальмуциноми легені Льюіс при комбінованованому ванню росту пухлини, яке оцінювали по об'єму лікуванні протипухлинною вакциною та субаліном первинного пухлинного вузла та вираховували представлено в табл.1. Таблиця 1 Вплив вакцини, субаліну та їх комбінації на показники перебігу пухлинного процесу в порівнянні з "контролем прищеплення" Група І II III IV Лікування Субалін Вакцина Вакцина+Субалін Контроль прищеплення ІГП, % (на 40 добу) 4,8 49,2 50,8 З даних табл.1 видно, що терапевтична ефективність комбінованого застосування протипухлинної вакцини при 3-кратному введенні субаліну, не підвищувалась. В даному прикладі потенцюючої дії агентів не одержали. Приклад 2 Проведено терапевтичний дослід, де субалін вводили щоденно перорально протягом 5-ти діб в ІГМ,% 17,0 68,5 69,0 СТЖ, діб 47,9±4,7 62,5±4,1 65,7±3,4 47,1±2,8 дозі 1х108 КУО на мишу в об'ємі 0,5 мл ізотонічного розчину. Інші умови досліду відповідали прикладу 1. Протипухлинну резистентність мишей до карциноми легені Льюіс при комбінованому лікуванні протипухлинною вакциною та субаліном представлено в табл.2. 7 76656 8 Таблиця 2 Вплив вакцини, субаліну та їх комбінації на показники перебігу пухлинного процесу в порівнянні з "контролем прищеплення" Група І П III IV Лікування Субалін Вакцина Вакцина+Субалін Контроль прищеплення ІГП, % (на 40 добу) 34,9 49,2 74,6 З даних табл.2 видно, що терапевтична ефективність комбінованого застосування протипухлинної вакцини при 5-кратному введенні субаліну, підвищувалась. В даному прикладі потенцюючу дію агентів було досягнуто. Приклад 3 Проведено терапевтичний дослід, де субалін вводили щоденно перорально протягом 10-ти діб в ІГМ, % 46,0 68,5 87,1 СТЖ, діб 49,3±3,2 62,5±4,1 81,0±3,4 47,1±2,8 дозі 1х108 КУО на мишу в об'ємі 0,5 мл ізотонічного розчину. Протипухлинну резистентність мишей до карциноми легені Льюіс при комбінованованому лікуванні протипухлинною вакциною та субаліном представлено в табл.3. Таблиця 3 Вплив вакцини, субаліну та їх комбінації на показники перебігу пухлинного процесу в порівнянні з "контролем прищеплення" Група І II III IV Лікування Субалін Вакцина Вакпина+Субалін Контроль прищеплення ІГП, % (на 40 добу) 36,5 49,2 76,2 З даних табл.3 видно, що терапевтична ефективність комбінованого застосування протипухлинної вакцини при 10-кратному введенні субаліну, підвищувалась. В даному прикладі потенцюючу дію агентів було досягнуто. Приклад 4 ІГМ, % 51,0 68,5 88,1 СТЖ, діб 50,1±3,7 62,5±4,1 81,9±3,4 47,1±2,8 Проведено терапевтичний дослід, де субалін вводили щоденно перорально протягом 15-ти діб в дозі ІхІО8 КУО на мишу в об'ємі 0,5мл ізотонічного розчину. Протипухлинну резистентність мишей до карциноми легені Льюіс при комбінованованому лікуванні протипухлинною вакциною та субаліном представлено в табл.4. Таблиця 4 Вплив вакцини, субаліну та їх комбінації на показники перебігу пухлинного процесу в порівнянні з "контролем прищеплення" Група І II III IV Лікування Субалін Вакцина Вакцина+Субалін Контроль прищеплення ІГП, % (на 40 добу) 38,1 49,2 77,8 З даних табл.4 видно, що терапевтична ефективність комбінованого застосування протипухлинної вакцини при 15-кратному введенні субаліну, підвищувалась. В даному прикладі потенцюючу дію агентів було досягнуто. Застосування спеціальної формули дозволяє говорити про потенцюючу дію субаліну на протипухлинну активність вакцини. При цьому у мишей, які одержували комбіноване лікування, зменшувався об'єм пухлин, гальмувалось метастазування та збільшувалась середня тривалість їх життя . Таким чином, виявлені властивості субаліну підвищувати протипухлинну і антиметастатичну дію вакцини, дозволяє вважати його перспективним для подальшої оцінки можливості застосування його в терапії злоякісних новоутворень. ІГМ, % 53,6 68,5 82,4 СТЖ, діб 51,5±4,7 62,5±4,1 82,4±3,4 47,1±2,8 Запропонований спосіб підвищення ефективності протипухлинної вакцини дозволяє одержати вищу терапевтичну ефективність та значно зменшити затрати на придбання нового імуномодулюючого препарату. Спосіб не вимагає додаткового спеціального обладнання і може широко застосовуватися для підвищення ефективності імунізації протипухлинною вакциною. Отже, висока ефективність і відсутність негативних побічних впливів способу, що заявляється, створює експериментальне обгрунтування впровадження його в клінічну практику для підвищення ефективності лікування оперованих хворих з метою профілактики рецидивів і метастазів, збільшення тривалості життя та покращення його якості. 9 76656 10 Література: 11. Моисеенко В.М., Блинов Н.Н., Хансон К.П. 1. Hoover НС Jr, Brandh6rst JS, Peters LC, et al. Биотерапия при злокачественных новообразоваAdjuvant active specific immunotherapy for human ниях. Рос. онкол. журнал 1997; 5: 67-9. colorectal cancer: 6.5-year median follow-up of a 12. Потебня Г.П., Лісовенко Г.С., Мосієнко phase III prospectively randomized trial. J Clin Oncol В.С., Лісовенко В.Г. Ефективність комплексного 1993; 11(3): 390-9. застосування протипухлинної вакцини та імуномо2. Berd D, Kairys J, Dunton C, et al. Autologous, дулюючого препарату бластолен. Укр. Хіміотер. hapten-modified vaccine as a treatment for human журнал 2002; 2(14): 60-4. cancers. Semin Oncol 1998; 25(6): 646-53. 13. Патент А61К35/12, 35/74 № 57869 Україна 3. Mulders P, Tso CL, Gitlitz B, et al. Presentation "Спосіб одержання протипухлинної аутовакцини" / of renal tumor antigens by human dendritic cells actiПотебня ГП, Лісовенко ГС, Черемшенко НЛ, Танаvates tumor-infiltrating lymphocytes against autologсієнко ОА, Чехун ВФ. (Україна); № 2001064158; ous tumor: implications for live kidney cancer vacЗаявл. 15.06.2001; Опубл.15.07.2003, Бюл. № 7. cines. Clin Cancer Res 1999; 5(2): 445-54. 14. Патент А61К35/74, C12N1/21 № 26068 4. Затула Д.Г. Микроорганизмы, рак и протиУкраїна „Профілактичний біопрепарат субалін" воопухолевый иммунитет. Киев: Наук думка, 1985. /Смирнов В.В., Резник С.Р., Сорокулова І.Б., 247 с. Сахдахчієв Л.С. (RU), Петренко ВА (RU), Ільічов 5. Колесник Е.А., Потебня Г.П., Кикоть В.А. и А.А. (RU), Белявская В.А. (RU), Тимофеев І.В. (RU) др. Противоопухолевая вакцина в лечении боль- № 93006450; Заявл. 07.07.1993; Опубл. 30.04.99, ных распространенным колоректальным раком. Бюл. № 2. Онкол 1999; 2: 192-5. 15. Белявская В.А. Конструирование лечебно6. Потебня Г.П., Смоланка Н.И., Лисовенко профилактических препаратов на основе живых Г.С. и др. Еффективность иммунотерапии аутогенетически модифицированных микроорганизвакциной в лечении больных раком легкого. Онкол мов. [Автореф дис ... докт биол наук]. Кольцове, 2000:2:191-4. 2002. 46с. 7. Tompkins W.A. Immunomodulation and tera16. Сорокулова И.Б. Изучение безопасности и peutic effects of the oral use of mterferonреактогенности нового пробиотика субалина для ccmechanizm of action. J Interferon Cytokine Res. добровольцев. Мікробиол. журн. 1998; 60(1):43-6. 1999; 19: 817-28. 17. Чердынцева Н.В., Литвяков Н.В., Смолья8. Tovey M.G., Maury С. Oral mucosal interferon нинов Е.С. и др. Модуляция противоопухолевой therapy: Marked antiviral and antitumor activity. Ibid: активности циклофосфана рекомбинантным про145-55. биотиком субалином. Вопр онкологии 1997; 43(3): 9. Иммунология в 3-х томах (перев. С англ. 313-6. под ред.У.Пола). - М.:Мир,1987; 89.Т.З:360с. 18. Jackson R, Harrap A. Computer model af an10. Рахмилевич АП. Бактериальные иммуноticancer drug interaction. Pharmacol Ther 1979; 4: модуляторы в экспериментальной иммунологии. 245-50. Успехи совр. биологии 1990; 109(3): 379-92. Комп’ютерна верстка М. Клюкін Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601