Спосіб оцінювання фітонцидної активності деревних рослин в урбанізованому середовищі

Реферат: Спосіб оцінювання фітонцидної активності деревних рослин в урбанізованому середовищі включає збирання листків деревних рослин, їх очищування від пилу, подрібнення, визначення фітонцидної дії листків деревних рослин методом "повислої краплини" з використанням як тестоб'єкту інфузорії-туфельки (Paramecium caudatum Ehr.). При цьому наважку подрібненого рослинного матеріалу розміщують на годинниковому склі, накривають його зверху другим годинниковим склом з краплиною з інфузоріями, проводять розрахунок фітонцидної активності деревних рослин у зворотних одиницях (1/хв.) з урахуванням формальдегідної одиниці та оцінку за 7-бальною шкалою з наступним виділенням найбільш фітонцидноактивних видів деревних рослин в умовах урбанізованого середовища. UA 91158 U (12) UA 91158 U UA 91158 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до фітоекології, промислової ботаніки, фізіології рослин й може бути використана для добору асортименту рослин з високими фітонцидними властивостями при озелененні урбанізованих територій. Деревні рослини виконують важливі функції в оздоровленні середовища: збагачують повітря киснем, зменшують шум, затримують пил та підтримують баланс мікрофлори у повітрі. Останню функцію дерева та кущі виконують завдяки утворенню в процесі фотосинтезу біологічно активних, бактерицидних та протистоцидних речовин - фітонцидів. У очищенні повітря від мікроорганізмів провідну роль відіграє газоподібна форма фітонцидів - леткі органічні речовини [1]. Для їхнього визначення використовують кількісні та якісні методи. До якісних належить метод тест-культур. Як тестову культуру використовують певні штами мікроорганізмів, або певний вид найпростіших. Методи поділяють на ті, що використовують у польових умовах та в лабораторних, що проводять на інтактних (непошкоджених) рослинах та на подрібненій масі, тобто визначають фітонцидну активність (ФА) первинних або вторинних фітонцидів. Відомий спосіб оцінювання фітонцидної активності деревних рослин методом тест-культур з використанням як тест-об'єкту культур мікроорганізмів, з визначенням кількості загиблих їх колоній під дією летких речовин рослин та з визначенням концентрації летких речовин для нормалізації умов досліду [2]. Однак цей спосіб є складним у виконанні, оскільки для визначення концентрації летких речовин необхідні спеціальні пристрої для вловлювання газоподібних речовин та їх подальшої ідентифікації газовим хроматографом або хромато-масспектрометром. Відомий спосіб оцінювання фітонцидної активності інтактних рослин у камерах з використанням як тест-об'єкта культур мікроорганізмів [3]. Наведено параметри посіву колоній мікроорганізмів та відстань розташування чашок від інтактних рослин. Цей метод дає можливість визначити ΦА гілок деревних рослин. Недоліком цього методу є необхідність використання для отримання достовірного результату культур патогенних мікроорганізмів, а для цього необхідний дозвіл МОЗ України та спеціальні умови лабораторії. Крім цього цей метод не дає можливості одночасного визначення ΦА великої кількості об'єктів. Відомий спосіб оцінювання ФА, за якого на предметному склі розміщують краплину з інфузоріями над годинниковим склом та у хвилинах (хв.) визначають час загибелі Paramecium caudatum Ehr. від початку досліду, а потім розраховують за формулою Аа=100/Т, де Аа фітонцидна активність, Τ - час загибелі інфузорій., у зворотних одиницях (1/хв.). У зв'язку з тим, що чутливість інфузорій до дії летких фітонцидів змінюється протягом року, то вносять поправку за допомогою формальдегідної одиниці. Для цього разом з фітонцидною активністю рослин у різні періоди вегетації визначають чутливість інфузорій до 40 % розчину формальдегіду. Перерахунок справжньої фітонцидної активності рослин проводили за формулою: А=кАа/ФЕа (хв.), де к - середня фітонцидна активність формальдегіду, знайдена у різні періоди вегетації; к=(ФЕа1+ФЕа2)/2 Аа - фітонцидність рослин у момент визначення; ФЕа - фітонцидна активність формальдегіду у даний період вегетації [4]. Недоліком цього способу є відсутність розподілу за групами деревних рослин або оцінка ФА у балах. Найбільш близьким за технічною суттю і досягненням результату є спосіб оцінювання фітонцидної активності деревних рослин методом "повислої краплини" з використанням як тестоб'єкта інфузорії-туфельки (Paramecium caudatum Ehr.), з розташуванням краплини з інфузоріями на предметному склі над чашкою Пeтрі з подрібненою наважкою листків масою 2 г. Проведено ранжування середньої фітонцидноїдії деревних рослин м. Воронежа за шістьма групами залежно від летальної експозиції інфузорій: з дуже високою протистоцидною дією від 1 до 7,5 хв., високою - від 7,6 до 15,1 хв., середньою - від 15,2 до 22,7 хв., низькою - від 22,8 до 30,3 хв. та дуже низькою - більше 30,4 хв. [5]. Але запропонований у цій роботі розподіл за групами деревних рослин є не дуже вдалим, оскільки він дає уявлення про протистоцидну дію летких виділень листків, а не їхню фітонцидну активність. Чим менше час загибелі інфузорій, тим активність фітонцидів буде вищою, тому врахування ФА при розподілі робить його наочним. Розподіл на групи не дає змогу об'єктивно оцінити ФА, оскільки протягом вегетаційного сезону один вид може проявляти як високі, так середні та низькі властивості ФА. В урбаносередовищі на ділянках з різним ступенем забруднення один вид за проявом ΦА може відноситись до різних груп. В основу даної корисної моделі поставлена задача розробки способу оцінювання фітонцидної активності деревних рослин в урбанізованому середовищі, який дозволяє більш точно оцінити ФА деревних рослин, що зростають на різних ділянках та у різні фази їхньої вегетації. 1 UA 91158 U 5 10 15 20 25 30 35 40 Поставлена задача вирішується тим, що в запропонованому способі оцінювання ФА деревних рослин в урбанізованому середовищі, що включає збирання листків деревних рослин, їх очищування від пилу, подрібнення, визначення фітонцидної дії листків деревних рослин методом "повислої краплини" з використанням як тест-об'єкта інфузорії-туфельки (Paramecium caudatum Ehr.), згідно з корисною моделлю, наважку подрібненого рослинного матеріалу розміщують на годинниковому склі, накривають його зверху другим годинниковим склом з краплиною з інфузоріями, проводять розрахунок фітонцидної активності деревних рослин у зворотних одиницях (1/хв.) з урахуванням формальдегідної одиниці та оцінку за 7-бальною шкалою з наступним виділенням найбільш фітонцидноактивних видів деревних рослин в умовах урбанізованого середовища для подальшого використання в озелененні територій. Розроблений спосіб оснований на тому, що оцінювання фітонцидної активності деревних рослин в урбанізованому середовищі здійснюють за 7-бальною шкалою, яка враховує час загибелі інфузорій, зміну форми тіла інфузорій та показники ФА у зворотних одиницях, що дає змогу оцінити фітонцидну дію деревних рослин в умовах урбанізованого середовища. Приклад конкретного виконання. Моніторинговими ділянками були вибрані санітарно-захисна зона Донецького металургійного заводу (ДМЗ), автомагістраль міста та парк відпочинку, контроль - Донецький ботанічний сад НАН України (ДБС). Об'єктом дослідження були 8 видів деревних рослин біля ДМЗ та 28 видів, що зростають на інших ділянках. Протистоцидну активність листків визначали згідно методики "повислої краплини" Б.П. Токіна [6]. Як тест-об'єкт використовували культуру інфузорії - Paramecium caudatum Ehr. Цей вид було використано при дослідженні фітонцидної активності багатьма авторами [5, 7, 8, 9, 10]. Матеріали збирали у сонячну, безвітряну погоду щомісячно. Для досліджень брали здорові, непошкоджені листки, без ознак хлорозу по всьому периметру крони (з південної, північної, східної та західної частин), з нижнього ярусу. Листки збирали з 7-8 дерев для отримання середньої проби. У зв'язку з тим, що фітонциди дуже леткі, фітонцидну активність визначали через одну - дві години після збору листків, не пізніше. Спочатку зібрані листки обережно відмивали від пилу, що знаходився на їхній поверхні. Потім для середньої проби в лабораторних умовах подрібнювали листки ножицями. Отриманий матеріал розтирали у ступці до однорідної кашоподібної маси, з якої відбирали наважки по 1 г. Дослід проводили у п'ятикратній повторності. На внутрішню поверхню годинникового скла за допомогою піпетки Пастера наносили краплю з не менш ніж 30 інфузоріями. Наважку розміщували на другому годинниковому склі та швидко його накривали склом з краплиною інфузорій. Об'єм повітряного проміжку між скельцями був однаковим. Слідкували за тим, щоб краплина з тест-об'єктом не торкалась наважки. Усю систему розміщували під мікроскопом, де спостерігали та за секундоміром відмічали час загибелі у хвилинах 50 % інфузорій, що знаходились у центрі повислої краплини. При повному припиненні руху та функцій війчастого апарату констатували загибель інфузорій, в подальшому відбувався зернистий розпад їхнього тіла. У зв'язку з тим, що чутливість інфузорій до дії летких фітонцидів змінюється протягом року, то була внесена поправка за допомогою формальдегідної одиниці. Для цього разом з фітонцидною активністю рослин у різні періоди вегетації визначали чутливість інфузорій до 40 % розчину формальдегіду [4]. 2 UA 91158 U Шкала оцінки фітонцидної активності деревних рослин Фітонцидна активність (А), 1/хв. Час загибелі інфузорій, хв. лізис інфузорій настає через 1-2 хв. від початку досліду лізис інфузорій настає з 2 до 4 хв. досліду інфузорії зупиняються через 2-3 хв. від початку досліду, роздуваються, а потім настає їхній лізис до 5 хв. у інфузорій відбувається трансформація форми тіла, вони зупиняються на 4-5 хв., роздуваються, деякий час знаходяться в роздутому стані та лізують. Лізис відмічається від 5,1 хв. до 6,7 хв. Інфузорії роздуваються кульками від 6,8 хв. і до 10 хв., крутяться на одному місці та застигають інфузорії зупиняються через проміжок часу від 10 до 20 хв. від початку досліду летальна експозиція інфузорій складає більше 20 хв. 5 10 15 20 25 Бал 100-50 7 49,9-25 6 24,9-20 5 19,9-15 4 14,9-10 3 9,9-5 2 4,9-1 1 7-бальна шкала оцінки фітонцидної активності деревних рослин враховує три параметри: - картину загибелі інфузорій під дією летких фітонцидів: утворення пухиря, зморщування, припинення руху; - час загибелі інфузорій у хвилинах, під цим поняттям розуміють час від початку досліду до припинення руху інфузорій та зміни форми її тіла. З сьомого по п'ятий бал це поняття включає час від початку досліду до повної загибелі інфузорій, їхнього лізису - розпадання на окремі пухирці; - фітонцидну активність розраховану у зворотних одиницях (1/хв.), з урахуванням формальдегідної поправки. Середня ФА за вегетаційний період досліджених видів на усіх ділянках змінювалась від 5 балів (21,0±1,94 (1/хв.)) у Acer negundo L. біля ДМЗ до 1 балу (1,7±0,11 (1/хв.)) у Ulmus laevis Pall, на ділянках ДБС. У зв'язку з мінливістю фітонцидної дії деревних рослин протягом вегетаційного періоду у деяких видів була виявлена вища ΦА, наприклад у Juniperus virginiana L. в липні при піці ФА вона склала 6 балів (28,5 1/хв.). В умовах урбанізованого середовища вивчені види не проявили ФА у 7 балів. Однак, за літературними даними, відомі і такі випадки. Наприклад, М.В. Γригорьєвою в зеленій зоні м. Воронежа виявлена ФА у 50 1/хв. для J. virginiana у липні [6]. Слід зауважити, що умови досліду у нас та у М.В. Γригорьєвої були однакові. Для зручності оцінювання ΦΑ досліджених деревних рослин можна розділити на п'ять груп залежно від кількості балів: дуже висока від 7 до 5 балів, висока 4 бали, середня - 3 бали, низька - 2 бали та дуже низька - 1 бал. На різних ділянках один вид може проявляти різний ступінь фітонцидної активності. В таблиці наведена середня фітонцидна активність за вегетаційний період розрахована у зворотних одиницях (1/хв.) для деяких видів деревних рослин, що зростають на ділянках з різним ступенем забруднення. Таблиця Вид Acer negundo L. Populus simonii Carrière P. × canadensis Moench Robinia pseudoacacia L. 30 Фітонцидна активність, 1/хв. Парк Автомагістраль відпочинку 16,2±0,74 14,1±1,81 14,1±4,43 12,1±2,51 13,9±1,92 8,7±0,64 12,0±0,81 8,7±1,02 ДМЗ 21,0±1,94 18,7±1,92 19,1±2,18 15,0±0,81 ДБС 9,7±0,83 9,8±1,69 6,4±0,51 6,5±0,70 ФА у 5 балів, тобто дуже високу, виявив Acer negundo L. на ділянці біля ДМЗ - 21,0 (1/хв.) протягом вегетаційного періоду. Високу фітонцидну дію, оцінену в 4 бали, виявили 3 види: Populus х canadensis Moench, P. simonii, що зростають біля ДМЗ та Acer negundo - вздовж автомагістралі. 3 UA 91158 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Середні протистоцидні властивості проявили 4 види, що зростають біля ДМЗ, 11 видів - на дослідній ділянці вздовж автомагістралі, 4 види - у парку та 9 видів - у ДБС. ФА цих видів було оцінено у 3 бали. Фітонцидну активність у 2 бали було відмічено у 9 видів, що зростають вздовж автомагістралі. У парку низьку протистоцидність виявили 13 видів. Летальна експозиція більше 20 хв. була характерна для Aesculus hippocastanum, Morus alba, Sorbus intermedia, Ulmus laevis на усіх ділянках. ΦΑ Ulmus pumila та Acer saccharinum була дуже низькою у парку та у ботанічному саду, тоді як на інших ділянках вона була середньою. Дуже низьку протистоцидну дію було оцінено в 1 бал за семибальною шкалою. Було встановлено, що фітонцидна активність змінюється залежно від періоду вегетації та місця зростання. На відносно чистих ділянках спостерігалось зниження фітонцидності у більшості видів. Picea pungens виявила середню фітонцидну дію по відношенню до Paramecium caudatum на більш чистих ділянках у парку та ботанічному саду, тоді як на інших ділянках її ФА була низькою. Серед листяних видів вищі показники ФА на відносно чистих ділянках було виявлено у Armeniaca vulgaris, Aesculus hippocastanum, Forsythia ovata, Sorbus intermedia, Tilia cordata. У більшості видів максимальна ФА значно перевищувала середню за вегетаційний період. Наприклад, ФА Padus avium у травні, коли було відмічено її пік, склала 26,3 (1/хв.), тобто може бути оцінена у 5 балів. Середня за вегетаційний період фітонцидність становить 14,4 (1/хв.), тобто оцінюється у 3 бали. Протягом вегетації ФА деревних рослин значно змінюється, що пояснюється змінами фенологічних фаз та погодними умовами. Позитивний ефект проявляється в тому, що на відміну від відомого запропонований спосіб дозволяє точніше оцінити фітонцидну активність розраховану в 1/хв., з урахуванням сезонних змін чутливості P. caudatum до фітонцидів рослин та виділити найбільш фітонцидноактивні деревні рослини в умовах урбанізованого середовища. Застосування шкали на практиці дає змогу оцінити ΦА досліджених видів та порівняти з літературними даними. Джерела інформації: 1. Колесниченко М.В. Биохимические взаимовлияния древесных растений / М.В. Колесниченко. - М.: Лесн. пром-сть, 1976. - 184 с. 2. Акимов Ю.А. Методические рекомендации по изучению летучих веществ растений / Юрий Александрович Акимов. - Ялта: ГНБС, 1983. - 40 с. 3. Цыбуля Н.В. Методика определения фитонцидной активности интактных растений / Н.В. Цыбуля // Растительные ресурсы. - 2001. - Вып. 2. - С. 106-115. 4. Фитонциды в эргономике / [A.M. Гродзинский, Н.М. Макарчук, Я.С. Лещинская и др.] - К.: Наук, думка. 1986. - 185 с. 5. Григорьева М.В. Фитонцидные свойства насаждений лесопарковой части зеленой зоны города Воронежа: автореф. дис. на соискание уч. степени канд. биол. наук: спец. 03.00.16 "Экология" / Марина Владимирова Григорьева. - Воронеж, 2000. - 24 с. (найближчий аналог). 6. Токин Б.П. Целебные яды растений. Повесть о фитонцидах / Борис Петрович Токин. – Л.: Изд-во Ленинград. ун-та, 1980. - 280 с. 7. Верейкина Н.Н. Аллеопатические свойства растений-интродуцентов в искусственнных фитоценозах Белгородской области: автореферат дис. на соискание уч. степени канд. биол. наук: 03.00.16 "Экология" - Воронеж, 2005. - 24 с. 8. Кондратюк Е.Н. Фитонцидная активность интродуцированных в Донбассе черемух / Е.Н. Кондратюк, И.Е. Малюгин, Г.А. Кудина // Фитонциды. Бактериальные болезни растений. - К.: Наук, думка, 1985. - Ч. 1. - С. 46-47. 9. Матвеев Н.М. Фитонцидность некоторых древесно-кустарниковых пород Днепропетровского ботанического сада // Тез. докл. VI совещ. по проблеме фитонцидов - К.: Наук. думка, 1972. - С. 132-134. 10. Мохова Н.И. Суточная и сезонная динамика фитонцидности листьев орехов // Фитонциды в народном хозяйстве. - К.: Наук. думка, 1964. - С. 112-115. 4 UA 91158 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 Спосіб оцінювання фітонцидної активності деревних рослин в урбанізованому середовищі, що включає збирання листків деревних рослин, їх очищування від пилу, подрібнення, визначення фітонцидної дії листків деревних рослин методом "повислої краплини" з використанням як тестоб'єкту інфузорії-туфельки (Paramecium caudatum Ehr.), який відрізняється тим, що наважку подрібненого рослинного матеріалу розміщують на годинниковому склі, накривають його зверху другим годинниковим склом з краплиною з інфузоріями, проводять розрахунок фітонцидної активності деревних рослин у зворотних одиницях (1/хв.) з урахуванням формальдегідної одиниці та оцінку за 7-бальною шкалою з наступним виділенням найбільш фітонцидноактивних видів деревних рослин в умовах урбанізованого середовища для подальшого використання в озелененні територій. Комп’ютерна верстка С. Чулій Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5