Вакцина проти pcv-2 у mda-позитивних поросят

1. Застосування білка ORF-2 цирковірусу свиней типу 2 (PCV-2) для виробництва вакцини, яка містить принаймні 20 мкг/дозу вказаного білка ORF-2 і призначена для захисту поросят, які є позитивними стосовно похідних від матері антитіл (MDA) проти PCV-2, від інфекції PCV-2. 2. Застосування за п. 1, де вказана вакцина містить принаймні 50 мкг/дозу вказаного білка ORF-2 PCV-2. 3. Застосування за п. 1 або п. 2, де вказаний білок ORF-2 одержують шляхом експресії з бакуловірусного вектору експресії у клітинах комах, при цьому згаданий бакуловірусний вектор експресії містить послідовність гена ORF-2 PCV-2 під контролем придатного промотора. 4. Застосування за п. 3, де вказаний промотор - це промотор р10. 5. Вакцина для захисту поросят, які є позитивними стосовно похідних від матері антитіл (MDA) проти цирковірусу свиней тапу 2 (PCV-2), від інфекції PCV-2, яка відрізняється тим, що містить принаймні 20 мкг/дозу білка ORF-2 цирковірусу свиней типу 2 (PCV-2) та фармацевтично прийнятий носій. 6. Вакцина за п. 5, яка відрізняється тим, що містить принаймні 50 мкг/дозу вказаного білка ORF-2 PCV-2. 7. Вакцина за п. 5 або п. 6, яка відрізняється тим, що містить придатний ад'ювант. 8. Вакцина за п. 7, яка відрізняється тим, що ад'ювант - це емульсія типу "масло у воді". 9. Вакцина за п. 7 або п. 8, яка відрізняється тим, що ад'ювант включає вітамін Е. UA (21) a200803112 (22) 08.09.2006 (24) 10.08.2011 (86) PCT/EP2006/066161, 08.09.2006 (31) 05108299.8 (32) 09.09.2005 (33) EP (46) 10.08.2011, Бюл.№ 15, 2011 р. (72) РУРІНК ФРАНК, NL, ВАН ВУНСЕЛ ПІТЕР, NL (73) ІНТЕРВЕТ ІНТЕРНЕШОНАЛ Б.В., NL (56) WO А 03049703 (19.06.2003). BLANCHARD P ET AL: "Protection of swine against post-weaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) by porcine circovirus type 2 (PCV2) proteins" VACCINE, BUTTERWORTH SCIENTIFIC. GUILDFORD, GB, vol. 21, no. 31, 7 November 2003 (2003-11-07), pages 4565-4575. KAMSTRUP S ET AL: "Immunisation against PCV2 structural protein by DNA vaccination of mice" VACCINE, BUTTERWORTH SCIENTIFIC. GUILDFORD, GB, vol. 22, no. 11-12, 29 March 2004 (2004-03-29), pages 1358-1361. SIEGRIST C-A: "Mechanisms by which maternal antibodies influence infant vaccine responses: review of hypotheses and definition of main determinants" VACCINE, BUTTERWORTH SCIENTIFIC. GUILDFORD, GB, vol. 21, no. 24, 28 July 2003 (2003-07-28), pages 3406-3412. CHAE C: "A review of porcine circovirus 2-associated syndromes and diseases" VETERINARY JOURNAL, BAILLIERE TINDALL, LONDON,, GB, vol. 169, no. 3, May 2005 (2005-05), pages 326-336. C2 2 (19) 1 3 природний мешканець клітин РК-15, може бути пов'язаним з PMWS. Пізніші публікації (Hamel et al., J. Virol., 72(6), 52-62-5267, 1998; Meehan et al., J. Gen. Virol., 79, 2171-2179,1998) підтвердили ці результати, та було запропоновано (Meehan et al., вище) назвати новий патогенний цирковірус свиней (PCV) як PCV-2, тоді як ізолят оригінальної клітинної культури РК-15 (Tischer et al., Nature 295, 64-66, 1982) слід називати PCV-1. PCV-1 та PCV-2 - це дрібні (17 нм) ікосаедричні віруси без оболонки, що містять геном циклічної одноланцюгової ДНК. Довжина геному PCV-2 становить приблизно 1768 пар нуклеотидів. Здається, що ізоляти PCV-2, що походять з різних регіонів світу, є тісно пов'язаними один з одним та демонструють від 95 до 99% ідентичність нуклеотидної послідовності (Fenaux et al., J. Clin. Microbiol., 38(7), 2494-2503,2000). ORF-2 PCV кодує припустимий капсидний білок вірусу. ORF-2 PCV-2 кодує білок з 233 амінокислот. ORF-2 усіх ізолятів PCV-2 демонструє 91-100% ідентичність нуклеотидних послідовностей та 90-100% встановлену ідентичність амінокислотних послідовностей. Між генами ORF-2 PCV-1 та PCV-2 існує лише 65-67% нуклеотидна ідентичність та 63-68% ідентичність амінокислотних послідовностей (Fenaux et al, вище). PDNS (синдром дерматиту та нефропатії свиней) є іншою головною проблемою для свинарів, він виник приблизно у той самий час, що й PMWS. Ознаками PDNS є червоні/коричневі кільцеподібні ураження шкіри з кровотечею, що виникають звичайно на вухах, боках, ногах та стегнах. Огляд хвороб та синдромів, пов'язаних з PCV-2, наведено у Chae. C (2005) Vet. J. 169, 326-336. Отже, існує потреба у вакцині, що захищає поросят від пов'язаних з PCV-2 хвороб, таких як PMWS та PDNS. Проте, досі не існує комерційно доступної вакцини проти пов'язаних з PCV-2 хвороб. Традиційно можна б було розраховувати на звичайну вакцину для свиней на основі інактивованого суцільного вірусу PCV-2. Проте, у випадку з PCV-2 справа ускладнюється тим фактом, що PCV-2 не реплікується до високих титрів у клітинній культурі. Як альтернатива, вакцина могла б засновуватися на рекомбінантних антигенах, що походять з PCV-2. Білки PCV-2 вже експресували у різних експресійних системах. Наприклад, Liu зі співавторами (Protein Expression and Purification, 21,115120, 2001) експресували злитий білок суцільного білка, що кодується ORF-2 PCV-2, зв'язаним з МВР His tag, у Е. Соlі. Кіm зі співавторами (J. Vet. Sci., 3(1), 19-23, 2002) експресували ORF-1 та 2 PCV-2 в бакуловірусній експресійній системі. Blanchard зі співавторами (Vaccine, 21, 4565-4575, 2003) експресували ORF-1 та ORF-2 також у системі на основі бакуловірусу у клітинах комах. Клітини комах, які виробляли білки PCV-2, лізували та їх уводили до складу вакцини, яку використовували для вакцинації поросят без специфічного патогену (SPF). Поросята отримували або один з білків у режимі підсилення первинної імунізації, де після вакцинації ДНК застосовували субодиничну вакцину, або, в іншій групі поросят, поросята 95458 4 отримували білок ORF-1 та ORF-2 за дві ін'єкції. Проте, усі експерименти здійснювали зі свинями SPF, які не мають патогену та, як слідство, не мають будь-яких похідних від матері антитіл проти PCV-2. PMWS та PDNS, що спричиняються PCV-2, можна спостерігати з віку від 4 тижнів до приблизно 15 тижнів. Здається, що до відлучення поросята почувають себе досить безпечно стосовно пов'язаних з PCV-2 хвороб, і лише після відлучення вони мають ризик отримати клінічні симптоми. Як слідство, для того, щоб захистити поросят шляхом вакцинації, ідеальним було б захистити поросят від наслідків відлучення, оскільки не можна передбачити, коли пов'язані з PCV-2 хвороби виявляться. Для того, щоб досягти цього шляхом вакцинації двома уколами, поросятам слід отримати первинну вакцинацію вже у перший тиждень (перші тижні) після народження, так щоб вони змогли отримати повторну вакцинацію незадовго перед відлученням, тим самим отримавши повний захист від інфекції PCV-2 одразу після відлучення. Певно, що поросята мають похідні від матері антитіла (MDA) проти PCV-2. (Розподіл титрів MDA у поросят, яких використовували в експериментах з вакциною згідно з цим винаходом, наведено у Прикладах). Проте, добре відомо, що присутність похідних від матері антитіл буде втручатися у вакцинацію. Поросята можуть мати різні титри MDA. Дуже високі титри пасивних MDA можуть захищати поросят від інфекції PCV-2 (Merial: "PCV-2 Diseases: th From research back to the field strain", 18 IPVS, Hamburg, Germany, June 2004, page 99-101). Проте, поросята з більш низькими титрами MDA не будуть захищеними від інфекції PCV-2, коли вони досягнуть відповідного віку (тобто після відлучення). Для тих поросят, які, як здається, складають більшість від тих, що зустрічаються у польових умовах, титр MDA може бути занизьким, щоб надати захист від інфекції PCV-2, проте він може бути досить високим, щоб втручатися у вакцинацію, наприклад, традиційною вакциною з інактивованого PCV-2. Специфічним є те, що інактивована вакцина може містити недостатньо антигену через те, що цей вірус не може розмножатися до високих титрів у клітинній культурі (або у процес виробництва вакцини слід включити ускладнені процедури концентрації, що потребують багато часу). Для того, щоб забезпечити адекватним захистом від інфекції PCV-2, спеціально для цієї групи поросят розробили вакцину згідно з цим винаходом. Цим винаходом запропоновано вакцину, яку можна застосовувати у способі захисту поросят, навіть поросят, що є позитивними стосовно похідних від матері антитіл (MDA) проти PCV-2, від інфекції PCV-2 та, отже, від пов'язаних з PCV-2 хвороб, найбільш особливо від PMWS та PDNS. Цим винаходом пропонується вакцина проти PCV-2, яка містить принаймні 20 мікрограмів/дозу білка ORF-2 цирковірусу свиней типу 2 (PCV-2). Визначили, що вакцина, що містить принаймні 20 мікрограмів (мкг) білка ORF-2 PCV-2 на дозу, 5 спроможна розпочати захисну імунну реакцію проти інфекції PCV-2 (та, як слідство, проти пов'язаних з PCV-2 хвороб, таких як PMWS та PDNS) навіть всупереч MDA. Переважно вакцина містить принаймні 50 мкг на дозу та найбільш переважно 80 мкг на дозу. Можна навіть приготувати вакцини згідно з цим винаходом з антигенною масою аж до 275 мкг на дозу, і такі вакцини все ще не викликають місцевих реакцій на ділянці ін'єкції. Звичайно, навіть більше мікрограмів антигену можна увести у дозу вакцини згідно з винаходом, але якщо захист, отриманий завдяки вакцині, не підвищується при більш високій дозі, результатом збільшення антигенного навантаження буде лише вакцина, що є більш дорогою, ніж це необхідно. Крім того, збільшена доза антигену може зрештою стати причиною неприйнятних місцевих реакцій на ділянці ін'єкції, чого слід уникати. Спосіб вимірювання антигенної маси наведено в експериментальній частині цієї заявки. Вакцина згідно з цим винаходом може містити рекомбінантний білок ORF-2, де згаданий рекомбінантний білок переважно вироблений шляхом експресії з бакуловірусного вектора експресії у клітинах комах, при цьому згаданий бакуловірусний вектор експресії містить послідовність гена ORF-2 PCV-2 під контролем придатного промотору. Незважаючи на те, що відомі у галузі інші придатні експресійні системи можна також застосовувати у способі приготування вакцини згідно з винаходом, визначили, що застосування бакуловірусної системи експресії приводить до виробництва вірусного антигену з високим виходом, який, крім того, демонструє гарну антигенність. Застосування бакуловірусної системи експресії, таким чином, усуває необхідність в потребуючих багато часу ускладнених процедурах концентрації антигену до придатного рівня, коли його неможливо виробити з високою концентрацією, наприклад, у культурі інфікованих вірусом клітин. Найбільш поширено застосовується бакуловірусний вектор експресії Autographa californica, який часто застосовується з клітинною культурою комах SF-9, Sf-21 або з клітинами комах High five. Sf-9 та SF-21 - це яєчникові клітинні лінії від Spodoptera frugiperda, клітини High five походять від клітин яєць від Trichoplusia nі. Ген ORF-2 PCV слід розташовувати під контролем придатного промотору. Найбільш поширеними промоторами, що застосовуються у бакуловірусній системі експресії, є промотори для гена поліедрину та промотор для гена р10, що означає, що послідовність гена ORF-2 PCV-2 вставляється в інсерційний сайт у локусі поліедру або у локусі р10 у геномі бакуловірусу. Також можна застосовувати інші відомі у галузі придатні гомологічні або гетерологічні промотори. Докладний опис усіх аспектів бакуловірусної системи експресії надано у "Baculovirus Expression Vectors", автори D.R. O'Reilly, L. K. Miller та V. A. Lukow (1992, W. H. Freeman & Co, New York). Крім того, вектори експресії, що походять від бакуловірусу, та завершені системи експресії можна комерційно отримати від багатьох різних компаній. Вакцина згідно з винаходом може також містити придатний ад'ювант. У галузі відомо багато сис 95458 6 тем ад'ювантів, наприклад, системи ад'ювантів типу "масло у воді", які широко застосовуються. Можна застосовувати будь-яку придатну оливу або олію, наприклад, мінеральну оливу, відому у галузі для застосування як ад'ювант. Масляна фаза може також містити придатну суміш різних олив (олій), як мінеральних, так і немінеральних. Придатні ад'юванти можуть також включати вітамін Е, що необов'язково змішаний з однією або більше оливами (оліями). Водна фаза вакцини з ад'ювантом типу "масло у воді" буде містити антигенний матеріал. Придатні фармацевтичні склади будуть звичайно включати приблизно 25-60% масляної фази (40-75% водної фази). Приклади придатних фармацевтичних складів можуть включати 30% водної фази та 75% масляної фази або по 50% кожної фази. Вакцину згідно з цим винаходом можна вводити будь-яким придатним відомим у галузі способом, таким як внутрішньом'язовий, внутрішньошкірний або підшкірний, при цьому переважним способом є внутрішньом'язовий. Цим винаходом далі пропонується спосіб виробництва вакцини, призначеної для захисту молодих поросят, які є позитивними стосовно похідних від матері антитіл (MDA) проти PCV-2, від інфекції PCV-2, де згадану вакцину забезпечують принаймні 20 мкг/дозу білка ORF-2 цирковірусу свиней типу 2 (PCV-2). Вакцину (приготовлену за способом) згідно з винаходом можна застосовувати у способі захисту молодих поросят від інфекції PCV-2. Вакцину згідно з винаходом можна навіть застосовувати у способі захисту молодих поросят, що є позитивними стосовно похідних від матері антитіл (MDA) проти PCV-2, від інфекції PCV-2. Було визначено, що вакцина згідно з винаходом може захищати поросят, навіть коли вони мають відносно високий титр MDA проти PCV-2. Розподіл титрів MDA у молодих поросят, з якими зустрічаються у польових умовах на різних фермах Європи, відображено в Таблиці 1, а захист внаслідок вакцини згідно з винаходом відображено в Таблиці 2. Продемонстровано, що вакцина згідно з винаходом може навіть надавати адекватного захисту від інфекції PCV-2 поросятам, які мають титри MDA, що відповідають "підгрупі 2", як визначено у Прикладах (Таблиця 2). Поросята, що відповідають цій підгрупі, мають титри MDA від 8 до 12 Iog2, що відповідає високому титру MDA. Вакцину згідно з винаходом можна, отже, застосовувати навіть у способі захисту молодих поросят, які мають титр MDA проти PCV-2 аж до 10 Iog2 або навіть 12 Iog2 (що визначається за способом, вказаним у Прикладах). З Таблиці 1 можна побачити, що приблизно 55% поросят, зібраних з різних ферм з усієї Європи, знаходяться у межах підгрупи 2 (при цьому звичайно поросята, що знаходяться у межах підгрупи 1, які мають більш низькі титри MDA та які включають 32% популяції, є також захищеними вакциною згідно з винаходом). Отже, можна зробити висновок, що вакцина згідно з винаходом надає захист значній більшості поросят, що зустрі 7 чаються у польових умовах, включаючи поросят з високими титрами MDA. Для забезпечення належним захистом вакцину переважно вводять шляхом вакцинації двічі, при цьому перша ін'єкція (первинна вакцинація) вводиться поросятам у віці від 1 до 4 тижнів, переважно до відлучення, наприклад, у віці 1 тижня. Другу ін'єкцію (повторна вакцинація) можна робити приблизно трьома тижнями пізніше. Таким чином, поросята отримують повний захист від інфекції PCV-2 одразу після відлучення, тобто тоді, коли поросята є найбільш вразливими інфекцією PCV2, та, отже, стають сприйнятливими до PMWS та PDNS. Приклади Приклад 1. Визначення титрів похідних від матері PCV-2-специфічних антитіл Титри антитіл проти PCV-2 можна визначити наступним способом. Моношар клітин РК15 утворили у планшеті тканинної культури з 96 лунками. При 80% злитті 95458 8 клітини інфікували польовим ізолятом PCV-2, а потім інкубували протягом 2 днів при 37°С в інкубаторі з СО2. Після цього періоду клітини зафіксували етанолом та зберігали при 2-8°С до застосування. Для тестів використовували планшети, коли приблизно 20% клітин були інфікованими. Для того, щоб визначити титр PCV-2-специфічного антитіла даної сироватки, виконали серію розведень та інкубували на фіксованих етанолом клітинах. Після 1 години інкубації при 37°С планшети промили водопровідною водою та зв'язані антитіла виявили шляхом інкубації з FITC-міченим кролячим анти-свинячим IgG. Титр даної сироватки виражається як зворотна величина найвищого розведення, при якому все ще можна спостерігати реакцію PCV-2-специфічного антитіла. Типовий розподіл титрів похідних від матері антитіл проти PCV-2 у поросят до відлучення наведено у Таблиці 1. Сироватку узяли у 232 поросят з різних країн усієї Європи. Таблиця 1 Розподіл титрів похідних від матері антитіл у групі з 232 молодих поросят Категорії поросят з титрами похідних від матері PCV-2-специфічних антитіл (Iog2) у популяції 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 У Таблиці 1 можна розрізнити 3 підгрупи: підгрупа 1 - поросята з титрами, меншими ніж 8; підгрупа 2 - поросята з титрами від 8 до 12; та підгрупа 3 - поросята з титрами від 13 та більше. У підгрупі 3 титри похідних від матері антитіл є такими високими, що очікується, що поросята будуть захищеними протягом критичного періоду віку (Меrіаl: "PCV-2 Diseases:From research back th to the field strain", 18 IPVS, Hamburg, Germany, June 2004, page 99-101). У підгрупі 1, однак, титри похідних від матері антитіл є такими низькими, що більшість цих поросят можна легко вакцинувати. Однак, у підгрупі 2 титри антитіл мають такі значення, що традиційним способом вакцинації ймовірно не можна буде імунізувати більшість цієї групи. Оскільки видно, що більш ніж половина поросят входить до цієї підгрупи, найбільш важливою буде спроможність захистити поросят цієї підгрупи, якщо бажаним є усунути PMWS з ферми. Відсоток поросят у категорії Відсоток поросят у підгрупі 1,3 9,9 9,1 12,1 9,5 19,4 11,2 9,9 4,7 5,2 3,0 2,6 1,3 0,8 32 55 13 У цій галузі добре відомо, що дії вакцини усупереч титрів похідних від матері антитіл може сприяти ад'ювант та/або високий вміст антитіла. Відомо, вміст якого ад'юванту або антигену буде спроможним подолати титри похідних від матері антитіл, спрямованих проти даного патогену. Отже, в описаних експериментах ми намагалися визначити мінімальну кількість антигену, необхідну для захисту поросят у підгрупі 2 від інфекції PCV-2. Приклад 2. Побудова рекомбінантного бакуловірусу. що експресує ORF-2 PCV-2. Вірус PCV-2 виділили з тканини легенів свинігодувальниці, яка демонструвала клінічні та гістопатологічні ознаки PMWS, застосовуючи клітини сім'яника свиней (ST) вільні від PCV. Вірус розмножували шляхом 5 пасажів на клітинах РК15 вільних від РСV. ДНК виділили з препарату вірусу PCV-2, очищеного від надосадової рідини інфікованих клітин РК-15. Для підсилення гена ORF-2 здійс 9 нювали полімеразно-ланцюгову реакцію (ГШР) на основі опублікованих послідовностей, застосовуючи праймери, що містять рестрикційні сайти ВаmH1 (передній праймер: CGG GAT CCG ТТТ ТСА GCT ATG ACG ТАТ, зворотній праймер: CGG GAT ССТ ТТА ТСА СТТ CGT ААТ GGT Т). Отриманий амплікон включає у себе повний ген ORF-2 плюс фланкуючі сайти рестрикції ВаmН1. Після гель-електрофорезу амплікон вирізали та очистили. Очищений фрагмент ORF 2 PCV-2 потім перетравлювали ВаmH1 та вшили у pAcAS3, перетравлений ВаmH1 (Vlak et аl, (1990) Virology 179, 312-320). Ця плазміда містить промотор р10 перед сайтом інсерціі що дозволяє здійснювати експресію сторонніх генів під контролем промотору р10. Бактерії TOP 10F’ (Invitrogen, Корлсбад, США) перетворили сумішшю зшивання, а клони, що містили правильну конструкцію, селектували на основі їх послідовності. Позитивний клон розширили та плазмідну ДНК переносу знов протестували, застосовуючи секвенування. Перед трансфекцією вірус поліедрозу ядер Autographa californica (AcNPV, описаний у Martens et al. (1995) J. Virol. Methods 52 15-19) перетравили Bsu36I. Сайт Bsu36I у цьому вірусі; це єдиний сайт рестрикції у локусі р10. Клітини Spodoptera frugiperda (Sf9) потім трансфектували плазмідою переносу та ДНК бакуловірусу AcNPV, перетравленою Bsu36I, застосовуючи CellFectine (Life Technologies. Ґейтсбурґ, США). Надосадову рідину трансфекції зібрали на 3 день після трансфекції та виконували очищення бляшок на клітинах Sf9. Бляшки розширили та отриманий вірус піддали скринінгу стосовно інсерції гена ORF-2 PCV2 шляхом секвенування виділеної вірусної ДНК та імунофлюоресценції на клітинах Sf9, застосовуючи кролячу та свинячу сироватки анти-РСV-2. Посів рекомбінантного бакуловірусу BacPCV2-ORF-2 приготували та назвали "Masterseed". Masterseed та п'ятий пасаж Masterseed на клітинах Sf9 протестували на стійку інсерцію гена ORF-2 PCV-2 шляхом секвенування виділеної ДНК та імунофлюоресценції на клітинах Sf9. Для вимірювання кількості інфекційного вірусу у вірусних препаратах виконували титрування. Титрування виконували на клітинах Sf9 та зчитували дані шляхом спостереження специфічної до бакуловірусу СРЕ та/або специфічної до ORF-2 PCV-2 імунофлюоресценції, застосовуючи поліклональну кролячу анти-PCV-2 імунну сироватку. Було продемонстровано, що отримали очищений на бляшках Masterseed рекомбінантний AcNPV бакуловірус BacPCV-2-ORF-2. Ця конструкція стабільно експресувала білок ORF-2 PCV під контролем промотору р10 на клітинах Sf9, що підтвердили шляхом секвенування та імунофлюоресценції Masterseed та п'ятого пасажу від Masterseed на клітини Sf9. Приклад 3. Виробництво антигену PCV-2 Для отримання максимальної кількості експресійного продукту здійснювали пілотні експерименти для того, щоб оптимізувати умови отримання рекомбінантного білка ORF-2 PCV-2. Усі 95458 10 експерименти виконували, застосовуючи клітини Spodoptera frugiperda 21 (Sf21) у суспензійній культурі при 28°С. Для інфікування застосовували вірус BacPCV-2-QRF-2 на четвертому рівні пасажу від Masterseed. Для оптимізованого виробництва густота клітин під час інфікування стано6 вила 1,4x10 клітин/мл, множинність інфікування (МОI) становила 0,01, та культивування тривало протягом 6 днів після інфікування. Отриману суміш назвали врожаєм продукту експресії. Експресію при оптимізованих умовах здійснювали 5 разів в окремих експериментах під час курсу, що становив один рік. Оскільки антиген був розташований у клітинах, то загальних врожай, що містив як клітини, так і надосадову рідину, піддали обробці ультразвуком до такого показника, коли принаймні 90% клітин зруйнувалось. Після цього живий рекомбінантний вірус у групах обробленого ультразвуком врожаю інактивували 33 мМ бінарним етиленіміном (ВЕІ) при 37°С протягом 72 годин при безперервному перемішуванні, при рН 7,5. Після інактивації бінарний етиленімін нейтралізували шляхом додавання тіосульфату натрію з молярним перебільшенням у 1,6. Після нейтралізації клітинні уламки та поліедри видалили шляхом низькошвидкісного центрифугування при 600 g протягом 10 хвилин. Отриману надосадову рідину назвали інактивованою вірусною суспензією. Врожаї перевірили на стерильність та на закінчення інактивації. Закінчення інактивації протестували шляхом пасажу інактивованої вірусної суспензії на клітини Sf9 протягом 2 тижнів та виконали візуальне обстеження на відсутність специфічного до бакуловірусу СРЕ. Продемонстрували, що титри бакуловірусу становили 8,5 log10. Отримали TCID50/мл, що були повністю інактивовані після обробки ВЕІ. Приклад 4. Демонстрація кількості антигену PCV-2 Зразки інактивованої суспензії перед та після низькошвидкісного центрифугування та зразок надосадової рідини клітинної культури батьківського вірусу переносу піддали денатурації шляхом електрофорезу на поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію згідно зі способом Laemmli (Laemmli, U. K. (1970). Nature 227, 680685). Застосовували гель з градієнтом 4-12%, який забарвили Coomassie Brilliant Blue. Коли виконали вестерн-блотинг, тоді білки з гелю перенесли шляхом електрофорезу на мембрани Nylon, блокували знятим молоком у фізіологічному розчині з фосфатним буфером та здійснили реакцію з розведеною поліклональною свинячою сироваткою, виведеною проти польового ізоляту PCV-2. Як міру вмісту антигену в отриманій інактивованій вірусній суспензії, 1 мкл цієї суспензії запустили на гель подібним способом, при цьому для еталону також здійснювали паралельне серійне розведення альбуміну бичачої сироватки (Sigma, St. Louis, USA. Cat.no A-2153) на такому ж самому гелі. Визначення кількості генного продукту ORF-2 у інактивованій вірусній суспензії викону 11 вали шляхом порівняння щільності еталонного альбуміну бичачої сироватки з щільністю зразків, що містили PCV-2, шляхом застосування одержаного за допомогою камери зображення та комп'ютерного аналізу із застосуванням Gene Tools (SynGene, Cambridge, UK. V.3.06.02). Коли інактивовані врожаї перед та після низькошвидкісного центрифугування порівняли шляхом електрофорезного розділення на поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію з маркерами Precision Plus (Bio-Rad, Hercules, USA), тоді матеріал перед центрифугуванням дав 2 головні смуги приблизно рівної щільності очевидної молекулярної маси (MW) 30 та 26,8 кДа, а матеріал після центрифугування містив лише більш низьку смугу. Коли батьківський вірус переносу запускали паралельно з рекомбінантним вірусом, тоді батьківський вірус переносу містив лише більш високу з двох смуг, демонструючи тим самим, що більш низька смуга була ORF-2 PCV, а більш висока смуга - поліедрином, який було видалено після центрифугування. Ідентичність більш низької смуги у 26,8 кДа далі підтвердили шляхом вестерн-блотингу, під час якого було продемонстровано, що ця смуга, але не смуга в 30 кДа, реагувала з поліклональною свинячою сироваткою, виведеною проти польового вірусу PCV-2. Рівні експресії ORF-2 PCV-2 визначили під час 5 окремих експериментів, та у кожному випадку кількість була суттєво вищою за рівень детектування у цьому тесті, при цьому специфічний діапазон становив від 40 до 550 мкг/мл інактивованої вірусної суспензії. Приклад 5. Вплив кількості ORF-2 PCV-2 на результат вакцинації у молодих поросят, які є позитивними стосовно похідних від матері антитіл (MDA). Виготовили вакцини з різним вмістом антигену ORF-2 PCV-2 та їх застосовували для вакцинації молодих поросят з різними рівнями похідних від матері антитіл (MDA) проти PCV-2. Здійснили 2 вакцинації з проміжком у 3 тижні. Сироваткову реакцію на антиген вимірили на 5-6 тижні після першої вакцинації. На підставі цих даних розра 95458 12 хували вплив вмісту антигену на результати вакцинації при наявності MDA. Виконали різні розведення антигену та змішали 1:1 (об'єм/об'єм) з ад'ювантом типу "масло у воді", як це зазвичай робиться у цій галузі. Потім, у віці від 1 до 4 тижнів виводок розділили на групи та вводили їм внутрішньом'язово вакцини, які містили різні кількості білка ORP-2 PCV-2, або не вакцинували їх. Вакцинацію повторили через 3 тижні. Отримали наступні групи: 114 поросят вакцинували 1-14 мкг білка ORF-2 PCV-2 на дозу (група 1), 85 поросят вакцинували 20 та 80 мкг на дозу (група 2). Кров узяли під час першої вакцинації та через 5-6 тижнів після неї. Сироватки приготували та обстежили їх на присутність антитіл проти PCV-2 шляхом імунофлюоресценції. Для цього моношар клітин РК-15 у планшеті тканинної культури з 96 лунками інфікували польовим ізолятом PCV-2. Після 2 днів культивування, коли приблизно 20-30% клітин було інфіковано, моношари фіксували етанолом та зберігали при 2-8°С до застосування. Для визначення титру серійні розведення тестових сироваток інкубували на клітинах протягом 1 години при 37°С, а після промивання планшетів зв'язані антитіла виявляли шляхом інкубування протягом 1 години при 37°С з міченим FITC кролячим анти-свинячим IgG (Nordic, Tilburg, Нідерланди). Титри визначили як зворотні величини найбільш високого розведення, при яких все ще можна було спостерігати PCV-2-специфічну флюоресценцію. Для усіх тварин визначили відхилення титру антитіл між першим та другим аналізом крові. Якщо у цей період титр антитіл не відхилився або збільшився, вважали, що у тварини, яку обстежили, вакцина сприйнялася. Проте, коли титр PCV-2специфічного антитіла знижувався, вважали, що вакцинація не відбулася та вакцина не сприйнялася. На підставі визначання співвідношення сприйняття різних доз вакцини до титру похідних від матері антитіл під час вакцинації, змогли визначити мінімальну антигенну масу, необхідну для вакцинації достатньої кількості поросят. Результати цих аналізів наведено у Таблиці 2. Таблиця 2 Відсоток сприйняття вакцини при різних титрах MDA та концентраціях антигену Група 1:1-14мкг/дозу Група 2:20-80 мкг/дозу Категорії поросят з PCV-2-специфічними Кількість поросят на Кількість поросят на титрами похідних від категорію / кількість Відсоток сприйняття категорію / кількість Відсоток сприйняття матері антитіл (Iog2) при поросят, що сприй- вакцини на підгрупу поросят, що сприй- вакцини на підгрупу вакцинації няли вакцину няли вакцину 3/3 1/1 4 5 0/0 3/3 90% 100% 6 15/13 5/5 7 2/2 3/3 13 95458 14 Продовження таблиці 2 1 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Усього Усього захищених* 2 12/8 12/5 6/0 21/0 26/0 15/0 2/0 0/0 0/0 0/0 114/31 114/48 3 17% 0% 27% 42% 4 4/4 11/10 13/10 15/10 7/4 6/1 11/0 4/0 1/0 1/0 85/51 85/73 5 76% 4% 60% 86% * Загальна кількість захищених поросят - це кількість поросят, у яких вакцина сприйнялася поросятами з титром, меншим 13, плюс кількість поросят, що вже мають титр 13 або більше. У цій таблиці вираз "сприйняття вакцини" означає, що внаслідок вакцинації поросят утворився титр PCV-2-специфічного антитіла через тиждень після повторної вакцинації, який дорівнює або перебільшує PCV-2-специфічний титр при першій вакцинації. Усі ці випадки демонструють, що вакцина збільшила активну сироваткову реакцію проти PCV-2, та у такому випадку можна вважати, що поросята є захищеними від інфекції PCV-2. Проте, у поросят, у яких через один тиждень після повторної вакцинації титр був меншим ніж при первинній вакцинації, вакцина була неспроможна індукувати імунну реакцію, та спостерігали природне зменшення похідних від матері антитіл, яке згодом робить цих тварин сприйнятливими до інфекції PCV-2. Таблиця демонструє, що, коли застосовуються дози вакцини, які дорівнюють або перебільшують 14 мкг, у підгрупі 1 (титри MDA 7) у 90% тварин сироватка перетворюється внаслідок вакцинації, отже, їх можна вважати захищеними. Проте, у підгрупі 2 (титри MDA > 7 та < 13) тільки у 17% тварин, вакцинованих дозою, що є меншою або дорівнює 14 мікрограмам, сироватка була перетвореною, та вони були захищеними. У цій Комп’ютерна верстка Мацело В. групі 17 тварин мали титри 13 або більше та, отже, були вже захищеними їх природно набутими PCV-2-специфічними похідними від матерів антитілами. Отже, можна зробити висновок, що у цій групі з загальної кількості у 114 поросят тільки 48 (42%) були захищеними: 17 поросят вже з високими титрами похідних від матері антитіл плюс 31 порося з перетвореною сироваткою у підгрупах 1 та 2. У групі, вакцинованій 20 мікрограмами на дозу або більше, суттєво більше тварин отримали захист: усі тварини у підгрупі 1 та 76% тварин у підгрупі 2 мали перетворену сироватку щодо PCV-2, і, отже, вони були захищені, а, додаючи до цього поросят з титрами MDA 13 або більше, визначили, що 88% поросят у цій групі були захищені. Оскільки захист стада досягається, коли приблизно 80% або більше тварин є захищеними, можна зробити висновок, що антигенна маса вакцини, спрямованої проти PCV-2, повинна містити принаймні 20 або більше мікрограмів антигену, щоб бути здатною ефективно захистити стадо від наслідків інфекції PCV-2. Підписне Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601