Спосіб ідентифікації патотипів збудника раку картоплі synchytrium endobiotikum (schilb) perc.

Реферат: Спосіб ідентифікації патотипів збудника раку картоплі Synchytrium endobioticum (Schilb) Perc. включає зараження паростків картоплі відомими патотипами збудника раку. З літніх зооспорангіїв патотипів, що містяться у свіжих ракових наростах, виділяють білки, ідентифікують патотипи за специфічними білковими спектрами, отриманими ізоелектрофокусуванням у поліакриламідному гелі в інтервалі рН 3,5-10,0. UA 97671 U (12) UA 97671 U UA 97671 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі сільського господарства, зокрема до виявлення структурних елементів мікроорганізмів з ґрунту, а також для їх ідентифікації. Відомий спосіб гістохімічної ідентифікації патотипів збудника раку картоплі, який заснований на забарвленні різних патотипів збудника хвороби флуоресціючими барвниками [1]. Найближчим аналогом є спосіб диференціації патотипів збудника раку картоплі польовим методом за допомогою тест-сортів картоплі, які по-різному уражаються патотипами або ізолятами збудника хвороби у вогнищах, що аналізуються [2]. У вогнищах раку картоплі навесні висаджують сорти-диференціатори картоплі: Поліська рожева, Вале, Слов'янка, Серпанок, Калинівська, Малинська біла, Щедрик, Червона рута, Божедар, Санітарка. Через 75 днів проводять облік уражених сортів картоплі, які вражаються зимовими зооспорангіями патотипів збудника раку картоплі по-різному: 1 група - сорти картоплі, які уражуються всіма патотипами збудника раку: Поліська рожева, Вале; 2 група - сорти картоплі, які уражуються лише агресивними патотипами збудника раку: Слов'янка, Серпанок; 3 група сорти картоплі, які диференційовано уражуються патотипами збудника раку: Калинівська - лише 11 (Міжгірським агресивним патотипом); Малинська біла - 13 (Рахівським агресивним патотипом); Щедрик - уражується 18 (Ясінівським агресивним патотипом) та Червона рута уражується 22 (Бистрецьким агресивним патотипом збудника раку); 4 група - сорти картоплі, які не уражуються жодним патотипом збудника хвороби в Україні: Божедар, Санітарка. За реакцією тест-сортів картоплі на зараження патогеном визначають, який патотип існує в даному вогнищі [2]. Згадані способи мають такі недоліки: 1. Вони є трудомісткими і їх використання пов'язане з затратою часу, які займають цілий вегетаційний період розвитку патогену та рослин картоплі. 2. Для їх проведення застосовуються барвники, які є високотоксичними сполуками. 3. Використовуються багато сортів-диференціаторів картоплі. В основу корисної моделі поставлена задача розробити спосіб біохімічної ідентифікації патотипів та ізолятів збудника раку картоплі, який може бути використаний фітосанітарною службою для диференціації патотипу у новому вогнищі хвороби. Поставлена задача вирішується тим, що у запропонованому способі ідентифікацію патотипів проводять лабораторним способом шляхом зараження паростків стандартного сорту картоплі Поліська рожева, який уражується всіма відомими патотипами збудника раку картоплі, згідно з корисною моделлю, використовують літні зооспорангії, що містяться у свіжих ракових наростах, виділяють білки з уражених паростків картоплі, ідентифікують патотипи за специфічними білковими спектрами, отриманими ізоелектрофокусуванням у поліакриламідному гелі в інтервалі рН 3,5-10,0. Таким чином, патотипи збудника раку картоплі ідентифікують за їх білковим спектром. Результат, що досягається внаслідок цього, є більш точним, ніж при здійсненні інших способів та способу-найближчого аналога. 1. Запропонований спосіб дозволяє визначити невідомий патотип збудника раку картоплі за значно коротший термін часу (21 добу). 2. Для його проведення застосовують сполуки, які не є шкідливими для здоров'я людини. 3. Суттєвою відмінністю нового способу є те, що використовують всього лише один сорт картоплі - стандарт, який уражується всіма патотипами або ізолятами збудника раку і при їх біохімічному дослідженні дає різну кількість білкових компонентів при ураженні патотипами. Приклади здійснення способу. Приклад 1 Навесні, у квітні місяці, у вогнищах раку картоплі висаджують сорти-диференціатори картоплі: Поліська рожева, Вале, Слов'янка, Серпанок, Калинівська, Малинська біла, Щедрик, Червона рута, Божедар та Сантарка у виявлених вогнищах хвороби. Через 75 днів проводять облік уражених сортів картоплі, які уражаються зимовими зооспорангіями патотипів збудника раку картоплі по-різному. Отримані результати наведено у таблиці. 1 група - сорти картоплі, які уражались всіма патотипами збудника раку: Поліська рожева, Вале; 2 група - сорти картоплі, які уражались лише агресивними патотипами збудника раку: Слов'янка, Серпанок; 3 група - сорти картоплі, які диференційовано уражались патотипами збудника раку: Калинівська - лише 11 (Міжгірським агресивним патотипом); Малинська біла - 13 (Рахівським агресивним патотипом); Щедрик -18 (Ясінівським агресивним патотипом) та Червона рута - 22 (Бистрецьким агресивним патотипом збудника раку); 4 група - сорти картоплі, які не уражуються жодним патотипом збудника хвороби в Україні: Божедар, Сантарка. 1 UA 97671 U 5 10 15 20 25 30 35 40 За реакцією тест-сортів картоплі на зараження патогеном визначають, який патотип існує в даному вогнищі [2]. Приклад 2 Сприйнятливий до всіх патотипів збудника раку картоплі сорт Вале (сорт картоплі стандарт) заражають літніми зооспорангіями, які містяться у свіжих ракових наростах різних патотипів збудника хвороби: Д1 - звичайним патотипом, 11 - Міжгірським агресивним патотипом, 13 Рахівським агресивним патотипом, 18 - Ясінівським агресивним патотипом та 22 - Бистрецьким агресивним патотипом [2]. Через 21 добу з уражених паростків картоплі, в яких вміщаються літні зооспорангії збудника раку виділяють білки шляхом розтирання на холоді у фарфоровій ступці, центрифугують протягом 10 хвилин при 8000 об/хв. [3]. При цьому білки виділяються в супернатант (центрифугат), а суміші випадають в осад, який видаляють. Супернатант використовують для ізоелектрофокусування білків у поліакриламідному гелі (Т - 5 %, С - 3 %) з амфолитом діапазону рН 3,5-10,0. Ізоелектрофокусування проводять при напрузі 600 В протягом 2-х годин [4]. Білкові спектри виявляють фарбуванням за допомогою Кумассі блакитним G-250. Для цього спочатку відмивають амфоліти сумішшю: трихлороцтова кислота: етанол: вода (10:25:65) і забарвлюють 0,05 % Кумассі блакитним G-250 в суміші: оцтова кислота: етанол: вода (10:25:65). Відмивку від надлишку барвника проводять цією ж сумішшю. Розрахунок білкових компонентів проводять розробленою нами комп'ютерною программою [5]. В результаті проведених досліджень при ураженні звичайним (Д 1) далемським патотипом отримують до 51 білкового компонента (рис. 1, 2). При ураженні 11 - Міжгірським агресивним патотипом на ізоелектрофореграмі виявляються до 55 білкових компонентів (рис. 1, 3). При ураженні 13 - Рахівським агресивним патотипом - 56 білкових компонентів (рис.1, рис. 4), у 18 Ясінівського агресивного патотипу - до 59 компонентів (рис. 1, 5), у 22 - Бистрецького агресивного патотипу - 60 (рис. 1, 6). Крім того, спостерігається збільшення кількості білкових компонентів в інтервалі рН 6-9, а також наявність у них білка (рис. 1-6). Така закономірність спостерігається кожного разу при ураженні стандартного сорту картоплі патотипами збудника раку картоплі. Запропонований метод ідентифікаації патотипів збудника раку картоплі підтверджує експериментальна перевірка, яка здійснювалась при ураженні стандартного сорту картоплі Вале відомими патотипами з різних регіонів України. Джерела інформації: 1. Долягин А.Б. О различиях между патотипами возбудителя рака картофеля / А.Б. Долягин, А.С. Воловик, В.А. Колесников, А.В. Зеленин // Защита растений. - 1985. - № 4. - С. 32. 2. Zelya A. Selection of new potato test-assortment for identification of potato wart Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. / A. Zelya // European Phytosanitary Conference on potato and other arable crops. Chernivtsy, 2008, 06-10.1 O.P. 12-13. 3. Остерман Н.А. Исследование биологических макромолекул электрофорезом, ультрацентрифугированием. / Н.А. Остерман // М.: Наука, 1983. - 304 с. 4. Ригетти Т. Изоэлектрическое фокусирование белков. Теория, методы, применение/ Т. Ригетти // М.: Мир. - 1986. - 294с. 5. Авт. Свід. № 26245 від 29.10.2008 р. Комп'ютерна програма "Розрахунок ізоелектричних білкових спектрів" /Мельник П.О., Куц В.Є., Сологуб О.С. Таблиця Реакція тест-сортів картоплі на зараження патотипами збудника раку Synchytrium endobioticum (Schilb) Perc. (2014 p.). № п/п 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Назва сорту-диференціатора Поліська рожева Вале Слов'янка Серпанок Калинівська Малинська біла Щедрик Червона рута Патотипи Д1 11 13 18 22 звичайний Міжгірський Рахівський Ясінівський Бистрецький + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 45 2 UA 97671 U Продовження таблиці № п/п 9. 10. Назва сорту-диференціатора Божедар Сантарка Патотипи Д1 11 13 18 22 звичайний Міжгірський Рахівський Ясінівський Бистрецький "+" - ураження сортів; "-" - відсутність ураження сортів. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 Спосіб ідентифікації патотипів збудника раку картоплі Synchytrium endobioticum (Schilb) Perc., що включає зараження паростків картоплі відомими патотипами збудника раку, який відрізняється тим, що з літніх зооспорангіїв патотипів, що містяться у свіжих ракових наростах, виділяють білки, ідентифікують патотипи за специфічними білковими спектрами, отриманими ізоелектрофокусуванням у поліакриламідному гелі в інтервалі рН 3,5-10,0. 3 UA 97671 U 4 UA 97671 U Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5