Спосіб диференціації патотипів збудника раку картоплі synchytrium endobioticum (schilb) perc.

Спосіб диференціації патотипів збудника раку картоплі Synchytrium endobioticum (Schilb) Perc., що включає зараження паростків картоплі збудни 3 17050 їх аналіз проводять через 21 добу, виділяючи білки з уражених паростків картоплі, аналізують методом ізоелектрофокусування білків патотипів збудника хвороби у поліакриламідному гелі в інтервалі рН3-10. Таким чином, патотипи збудника раку картоплі диференціюються за їх білковим спектром. Результат, що досягається внаслідок цього, є більш точним, ніж при здійсненні інших способів та способу-прототипу. 1. Запропонований спосіб дозволяє визначити невідомий патотип збудника раку картоплі за значно коротший термін часу (21 добу). 2. Для його проведення застосовуються сполуки, які не є шкідливими для здоров'я людини. 3. Суттєвою відмінністю нового способу є те, що використовується всього лише один сорт картоплі - стандарт, який вражається всіма патотипами або ізолятами збудника раку і при їх біохімічному дослідженні дає різну кількість білкових компонентів при враженні патотипами. Приклади здійснення способу Приклад 1 Навесні, у квітні-місяці висаджують сортидиференціатори картоплі: Альма, Львівська біла, Перлина, Троянда, Gie-wont, Hilla, Ora (Mira), Zeisig, Темп у вогнищах виявлення хвороби. По проходженні 75 днів проводять облік уражених сортів картоплі, які вражаються зимовими зооспорангіями патотипів збудника раку картоплі по-різному: сорт картоплі Альма вражається всіма патотипами збудника раку картоплі. Отримані результати наведено у таблиці. Сорт картоплі Альма вражається всіма патотипами збудника раку картоплі, Львівська біла вражається всіма агресивними патотипами збудника хвороби, Перлина і Троянда вражаються (11) Міжгірським і (13) Рахівським агресивними патотипами, Zeisig і Giewont вражаються (13) Рахівським і (22) Бистрецьким агресивними патотипами, сорти Hilla і Оrа (Міга) (22) Бистрецьким агресивним патотипом, Темп не вражається жодним патотипом збудника раку картоплі. За реакцією тест-сортів картоплі на зараження патогеном визначають, який патотип існує в даному вогнищі [2]. Приклад 2 Сприйнятливий до всіх патотипів збудника раку картоплі сорт Вале (сорт картоплі стандарт) 4 вражають літніми зооспорангіями, які містяться у свіжих ракових наростах різних патотипів збудника хвороби: Д1 - звичайним патотипом, 11 - Міжгірським агресивним патотипом, 13 - Рахівським агресивним патотипом, 18 - Ясинським агресивним патотипом та 22 - Бистрецьким агресивним патотипом [2]. Після проходження 21 доби з уражених паростків картоплі виділяють білки шляхом розтирання на холоді у фарфоровій ступці, центрифугують протягом 10 хвилин при 8000об./хв. [3]. При цьому білки виділяються в супернатант (центрифугат), а суміші випадають в осад, який видаляють. Супернатант використовують для ізоелектрофокусування білків у поліакриламідному гелі (Т 5%, С - 3%) з амфолитом діапазону рН3-10. Ізоелектрофокусування проводять при напрузі 600В протягом 2-х годин [4]. Білкові спектри виявляють фарбуванням за допомогою Кумасі блю G-250. Для цього спочатку відмивають амфоліти сумішшю: трихлороцтова кислота:етанол:вода (10:25:65) і забарвлюють 0,05% Кумасі блю G-250 в суміші: оцтова кислота:етанол:вода (10:25:65). Відмивку від надлишку барвника проводять цією ж сумішшю. Розрахунок білкових компонентів проводять розробленою нами комп’ютерною програмою. В результаті проведених досліджень при враженні звичайним (Д1) далемським патотипом сорту-стандарту Вале отримують до 28 білкових компонентів (Фіг.1). При ураженні 11 - Міжгірським агресивним патотипом на денсограмі виявляються до 32 білкових компонентів (Фіг.2). При ураженні 13 - Рахівським агресивним патотипом - 42 білкових компоненти (Фіг.3), у 18 - Ясинського агресивного патотипу - до 50 компонентів (Фіг.4), у 22 Бистрецького агресивного патотипу - 53 (Фіг.5). Крім того, спостерігається збільшення кількості білкових компонентів в інтервалі рН6-9, а також наявність у них білка. (Фіг.1-5). Така закономірність спостерігається кожного разу при ураженні стандартного сорту картоплі патотипами збудника раку картоплі. Запропонований метод диференціації патотипів збудника раку картоплі підтверджує експериментальна перевірка, яка здійснювалась при ураженні стандартного сорту картоплі Вале відомими патотипами з різних регіонів України. Таблиця Реакція тест-сортів картоплі на зараження патотипами збудника раку Synchytrium endobioticum (Schilb) Perc. (дані 1999p.) № п/п 1 1. 2. 3. 4. 5. Тест-сорти картоплі 2 Альма Львівська біла Перлина Троянда Giewont Д1 – звичайний 3 + 11 – Міжгірський 4 + + + + Патотипи 13 – Рахівський 5 + + + + + 18 – Ясинський 6 + + + + 22 – Бистрецький 7 + + + 5 17050 6 Продовження таблиці 1 6. 7. 8. 9. 2 Hilla Ora (Mira) Zeisig Темп 3 4 5 + 6 + + 7 + + + "+" - враження сортів; "-" - невраження сортів. Літературні джерела: 1. Долягин А.Б., Воловик А.С., Колесников В.А., Зеленин А.В., Голик И.В. О различиях между патотипами возбудителя рака картофеля // Защита растений. - 1985. - №4. - С.32. 2. Салтыкова Л.П. Методика выявления очагов рака картофеля и дифференциации патотипов возбудителя: Методические рекомендации. - М., 1988. - 58с. 3. Ригетти Т. Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы, применение. - М.: Мир, 1986. - 360с. 4. Троицкий И.Г. Изоэлектрическое фокусирование белков в самоорганизующихся и искусственных рН градиентах. - К.: Наукова думка, 1984. 280с. 7 17050 8 9 17050 10 11 17050 12 13 Комп’ютерна верстка А. Рябко 17050 Підписне 14 Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601