Спосіб оцінки генетичного різноманіття популяцій gentiana lutea l. за допомогою системи днк-праймерів

Реферат: Спосіб оцінки генетичного різноманіття популяцій Gentiana lutea L. за допомогою системи ДНКпраймерів включає молекулярно-генетичний аналіз на основі полімеразної ланцюгової реакції, при цьому для проведення полімеразної ланцюгової реакції використовують комбінацію із 12 ПЛР-праймерів (ISSR: 807, 811, 835, 840, 889; RAPD: А07, А18, А19, В01; CDDP: ERF-F, MYB; IRAP: 1962), специфічних до різних геномних послідовностей, та на основі порівняння утворених високополіморфних спектрів ампліфікованих фрагментів ДНК оцінюють генетичну різноманітність популяцій Gentiana lutea L. UA 99003 U (12) UA 99003 U UA 99003 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Корисна модель належить до галузі популяційної та природоохоронної генетики, а більш конкретно до способу оцінки генетичного різноманіття популяцій Gentiana lutea L. за допомогою системи ДНК-праймерів, і може бути використана для вирішення природоохоронних питань збереження рослинних ресурсів, зокрема для оцінки генофонду рідкісного лікарського виду Gentiana lutea L. (рід Gentiana, родина Gentianaceae). Тирлич жовтий - латинською Gentiana lutea L. (скорочена назва G. lutea) - гірський вид рослин, який відносять до рідкісних, зникаючих у більшості європейських країн, у тому числі і в Україні [1]. Нині в Українських Карпатах представлений ізольованими популяціями, чисельність яких поступово скорочується. Причинами порушення структури популяцій тирличу жовтого та їх зникнення є заготівля кореневищ для потреб офіційної і народної медицини, випас худоби та низька екологічна пластичність виду. Це зумовлює потребу проведення природоохоронних заходів, спрямованих на підтримання біорізноманіття виду, які ґрунтуватимуться на попередній оцінці генетичного різноманіття та генетичної структури його популяцій. З цією метою широко використовують метод полімеразної ланцюгової реакції (скорочена назва ПЛР) з різними молекулярно-генетичними маркерами (random amplification of polymorphic DNA - скорочена назва RAPD, inter simple sequence repeats - скорочена назва ISSR, conserved DNA-derived polymorphism - скорочена назва CDDP, resistance gene analog polymorphisms - скорочена назва RGAP, inter-retransposon amplified polymorphism - скорочена назва IRAP). Більш достовірні дані вдається отримати при одночасному використанні кількох типів генетичних маркерів, що дозволяє порівняти різні ділянки геному та виявити генетичну відмінність досліджуваних зразків за ними. Проте здійснення такого всебічного глибокого аналізу генофонду популяцій G. lutea потребує використання великої кількості дорогих реактивів, а також значних затрат часу. Відомі способи оцінки генетичної структури популяцій тирличу жовтого з використанням RAPD-, ISSR-, CDDP-, RGAP-, IRAP-маркерів. їх застосовували для вивчення стану генофонду популяцій G. lutea з Піренеїв, Українських та Румунських Карпат, а також для дослідження G. lutea var. aurantiaca з Кантабрійських гір та G. lutea L. subsp. vardjanii з Доломітових Альп [2-7]. Однак дані способи передбачають використання або лише одного типу праймерів, що дозволяє охарактеризувати генофонд за незначною кількістю однотипових маркерів або великої кількості різних праймерів (наприклад, 35), що зумовлює необхідність досліджувати велику вибірку ПЛРпродуктів і тому значно збільшує матеріальні та трудові витрати для проведення аналізу. В основу запропонованої корисної моделі поставлена задача створити такий спосіб оцінки генетичного різноманіття популяцій Gentiana lutea L. за допомогою системи ДНК-праймерів, який дозволив би зменшити кількість та підвищити інформативність використаних праймерів, що забезпечило б можливість швидкого, ефективного та матеріально менш затратного вивчення генофонду цього виду. Зазначена задача вирішується запропонованим способом оцінки генетичного різноманіття популяцій Gentiana lutea L. за допомогою системи ДНК-праймерів, що включає молекулярногенетичний аналіз на основі полімеразної ланцюгової реакції, а відповідно до пропозиції, під час проведення полімеразної ланцюгової реакції використовують комбінацію із 12 ПЛР-праймерів (ISSR: 807, 811, 835, 840, 889; RAPD: А07, А18, А19, В01; CDDP: ERF-F, MYB; IRAP: 1962), специфічних до різних геномних послідовностей, та на основі порівняння утворених високополіморфних спектрів ампліфікованих фрагментів ДНК оцінюють генетичну різноманітність популяцій Gentiana lutea L. Суть корисної моделі пояснюється графічним зображенням, де схематично показано UPGMA-дендрограма генетичних зв'язків між дослідженими зразками G. Lutea L., побудована на основі Dj, розрахованих з використанням UBC#807; UBC#811; A18. Цифрами вказано величини достовірності кластеризації (індекс бутстрепа) для шести ключових вузлів. Бутстреп-тест включав 1000 повторів. Умовні позначення популяцій відображені у таблиці 1. Таблиця 1 Значення основних показників генетичного поліморфізму популяцій G. lutea L. з Українських Карпат Частка поліморфних ампліконів Популяція (Р), % 1* 3** 12*** Очікувана гетерозиготність (Не) 1* Кількість ПЛР-праймерів 3** 12*** 1* 1 Індекс Шеннона (S) 3** 12*** UA 99003 U Продовження таблиці 1 Lem НТ Sh Kr Tr Pozh Середнє 56,3 34,4 53,1 34,4 40,6 37,5 42,7 44,0 30,8 44,0 39,6 40,7 38,5 40,0 43,3 38,1 38,5 36,4 40,9 30,9 38,0 0,158±0,032 0,137±0,019 0,139±0,011 0,248±0,046 0,211±0,027 0,212±0,016 0,118±0,031 0,109±0,019 0,135±0,011 0,179±0,046 0,163±0,027 0,201±0,016 0,185±0,036 0,151±0,020 0,135±0,011 0,277±0,051 0,228±0,029 0,203±0,016 0,133±0,036 0,134±0,020 0,124±0,011 0,194±0,051 0,201±0,028 0,186±0,016 0,122±0,030 0,107±0,016 0,118±0,010 0,190±0,045 0,170±0,025 0,182±0,015 0,118±0,033 0,100±0,016 0,091±0,009 0,179±0,047 0,159±0,024 0,141±0,014 0,139±0,013 0,123±0,008 0,124±0,004 0,211±0,019 0,189±0,011 0,187±0,006 Примітки: * - ISSR-праймер UBC#807, ** - 3 ПЛР-праймери (ISSR: UBC#807, UBC#811) та RAPD-праймер (A18), *** - 12 ПЛР-праймерів (ISSR: UBC#807, UBC#811, UBC#835, UBC#840, UBC#889, RAPD: A07, A18, A19, B01, CDDP: ERF-F, MYB, IRAP: 1962); Lem - популяція з полонини Лемська, НТ - популяція з гори Гутин Томнатик, Sh - популяція, розташована між горами Шешул і Павлик, Kr - популяція з полонини Крачунєска, Tr - популяція, розташована між горами Трояска і Татарука, Pozh - агропопуляція з гори Пожижевська. 5 10 15 20 25 30 35 40 Авторами експериментально оцінено ефективність різних комбінацій ДНК-праймерів, відібраних раніше за найбільшим значенням показника розпізнавальної здатності (скорочена назва DL - показник інформативності праймерів, що пов'язаний із кількістю пар, які праймер здатний диференціювати у досліджуваній вибірці зразків; дає змогу відібрати праймери, що дозволяють ідентифікувати як окремі генотипи, так і виявляти відмінності між окремими популяціями). Використання праймера чи праймерів із запропонованої системи з 12 ДНКпраймерів дозволило, залежно від поставлених експериментатором цілей, оцінити між- чи внутрішньопопуляційний генетичний поліморфізм тирличу жовтого. Запропонований спосіб здійснюють наступним чином: Проводять молекулярно-генетичний аналіз на основі полімеразної ланцюгової реакції, з використанням системи з 12 ПЛР-праймерів (ISSR: 807, 811, 835, 840, 889; RAPD: A07, А18, А19, В01; CDDP: ERF-F, MYB; IRAP: 1962), специфічних до різних геномних послідовностей. Для цього попередньо виділяють ДНК. Свіжу рослинну тканину (листкова пластинка без прожилок) гомогенізують в ступці товкачиком з 2 х СТАВ буфером (ОД М трис-НСl, рН8,0; 20 мМ ЕДТА; 1,4 М NaCl; 2 % СТАВ) у співвідношенні 1:1 до утворення однорідної маси. Переносять отриману суміш у пробірки типу "епендорф" об'ємом 1,5 мл. Лізат інкубують на водяній бані 40 хв. при +65 °C при періодичному перемішуванні. Депротеїнізацію проводять рівним об'ємом суміші хлороформ/ізоаміловий спирт (об'ємне співвідношення 24:1), перемішуючи 5-10 хвилин до утворення гомогенної суспензії. Отриману суміш центрифугують 8 хв. при 9000 об./хв. Переносять водну фазу в чистий "епендорф", додають 1/10 від її об'єму 10 % цетавлону (комерційна назва бромистого гексадецилтриметиламонію) (а) і 4 М NaCl (V=а×0,175). Повторюють обробку рівним об'ємом суміші хлороформ/ізоаміловий спирт (об'ємне співвідношення 24:1). Отриману суміш центрифугують 8 хв. при 9000 об./хв. Переносять водну фазу в чистий "епендорф". Повторюють обробку сумішшю хлороформом/ізоаміловий спирт з додаванням до водної фази 10 % цетавлону і 4 М NaCl до повного зникнення інтерфази. До водної фази додають рівний об'єм ізопропілового спирту, обережно перемішують і осаджують ДНК центрифугуванням при 9000 об./хв. протягом 10 хв. Проводять обережну декантацію супернатанта. Промивають осад 70 %-ним етанолом, підсушують на повітрі і розчинюють в 0,1×ТЕ буфері (10 мМ трис-НСl, рН 8,0; 1 мМ ЕДТА). Робочий розчин ДНК зберігають при температурі -20 °C. Проводять полімеразну ланцюгову реакцію з використанням одного чи кількох праймерів із запропонованої системи ДНК-праймерів в 0,5 мл "епендорфах" у програмованому термоциклері Терцик МС2 ("Биотехнология", Росія). Реакційна суміш для ПЛР об'ємом 20 мкл, містить: 1 х ПЛР-буфер (0,75 М трис-НСІ, рН 8,8 при 25 °C; 0,2 М (NH4)2SO4; 0,01 % Tween), 0,2 мМ dNTP (Termo Fisher Scientific, Fermentas, Литва), 1,25 U Taq-полімерази (Амплісенс, Росія), 2,5 мМ MgCb (Termo Fisher Scientific, Fermentas, Литва), 30 нг ДНК. До реакційної суміші додають один з праймерів до кінцевої концентрації 1 мМ для ISSR-праймерів та CDDP-праймерів, 0,6 мМ для RAPD-праймерів або 0,5 мМ для IRAP-праймерів (послідовності праймерів наведені у таблиці 2). 2 UA 99003 U Таблиця 2 Система ДНК-праймерів, розроблена для дослідження генофонду популяцій G. lutea L. Маркер ISSR RAPD CDDP IRAP Назва праймера UBC#807 UBC#811 UBC#835 UBC#840 UBC#889 А07 А18 А19 В01 ERF-F MYB 1962 DL* 0,967 0,964 0,951 0,953 0,953 0,953 0,956 0,942 0,944 0,949 0,949 0,949 Нуклеотидна послідовність (5'- 3') AGA GAG AGA GAG AGA GT GAG AGA GAG AGA GAG AC AGA GAG AGA GAG AGA GYC GAG AGA GAG AGA GAG AYT DBD АСА CAC АСА САС AC GAAACGGGTG AGGTGACCGT CAAACGTCGG GTTTCGCTCC CACTACCGCGGSCTSCG GGCAAGGGCTGCCGC AGGAAGAAGCACCCGGCCATGG Примітки: * - значення розпізнавальної здатності (DL), розраховане для сумарної вибірки рослин з двох популяцій (n=30); D=A/G/T, Y=С/Т, S=G/C. 5 10 15 20 25 30 35 40 Для запобігання випаровуванню на поверхню реакційної суміші нашаровують 15 мкл мінеральної олії. Для проведення ПЛР використовують наступні температурні режими: RAPDПЛР: початкова денатурація - 2 хв. при 94 °C, 5 циклів (94 °C-30 с, 37 °C-30 с, 72 °C-1 хв.), 35 циклів (94 °C-20 с, 37 °C-20 с, 72 °C-40 с), заключна елонгація - 2,5 хв. при 72 °C; ISSR-ПЛР: початкова денатурація - 2 хв. при 94 °C, 35 циклів (94 °C-30 с, 53 °C-30 с, 72 °C-1,5 хв.), заключна елонгація -2,5 хв. 72 °C; CDDP-ПЛР: початкова денатурація - 2 хв. при 94 °C, 35 циклів (94 °C-30 с, 50 °C-1 хв., 72 °C-1,5 хв.), заключна елонгація -2,5 хв. при 72 °C; IRAP-ПЛР: початкова денатурація 2 хв. при 94 °C; 35 циклів (94 °C-30 с; 58 °C-30 с; 72 °C-1,5 хв.), заключна елонгація - 2,5 хв. при 72 °C. Проводять електрофоретичне розділення продуктів ампліфікації методом горизонтального електрофорезу у 1,3 % агарозному гелі в 1×SB-буфері (5 мМ Nа2В4O7, рН 8,5) за напруженості електричного поля 4-6 В/см 4-6 годин. Для приготування агарозного гелю об'ємом 140 мл до 133 мл дистильованої води додають 1,83 г агарози і нагрівають на киплячій водяній бані до повного розчинення порошку, охолоджують до +50 °C, додають 7 мл 20×SB буфера та 9 мкл бромистого етидію (0,5 мкг/мл). Розчин перемішують, дають охолонути до 45-55 °C і заливають в горизонтально встановлену форму з поміщеною в неї за 1 см від краю та на висоті 0,5-1 мм від дна гребінкою. Після повного затвердіння гель переносять в електрофоретичну камеру, заповнену буфером 1×SB. Препарат ДНК в кількості 20 мкл змішують з буфером для нанесення ДНК, який містить 0,025 % бромфенолового синього, та вносять в лунку гелю під електрофорезний буфер. Розділення продуктів ампліфікації починають при напруженості електричного поля 1-2 В/см, через 30-40 хв. напругу збільшують до 4-6 В/см. Для визначення розміру фрагментів використовують ДНК-маркер "100 bр + 1,5 Kb" (СибЭнзим, Росія), який містить фрагменти ДНК наступних розмірів: 100; 200; 300; 400; 500; 600; 700; 800; 900; 1000; 1500; 3000 п.н. Гель фотографують в проникаючому УФ світлі цифровим фотоапаратом з використанням фільтру "0-2,8×". Для кількісної оцінки генетичного поліморфізму опрацьовують електрофоретичні спектри ПЛР-продуктів та записують їх у вигляді бінарних матриць. За цими матрицями розраховують показники генетичної різноманітності та оцінюють поліморфізм популяцій. Приклади конкретного використання запропонованого способу. Приклад 1 Для дослідження генетичного поліморфізму тирличу жовтого використали описаний вище спосіб оцінки генетичного різноманіття популяцій Gentiana lutea L. за допомогою системи ДНКпраймерів з одним праймером UBC#807, що мав найвище значення розпізнавальної здатності (DL, табл. 1) із системи з 12 праймерів. Застосування цього ISSR-праймера дозволило диференціювати всі 86 зразків рослин. Частка поліморфних ампліконів у середньому склала 42,7 %, очікувана гетерозиготність - 0,139, індекс Шеннона - 0,211. Показники генетичного поліморфізму подані у таблиці 2. Приклад 2 3 UA 99003 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Подібно до прикладу 1, здійснювали дослідження генетичного поліморфізму тирличу жовтого з використанням описаного вище способу оцінки генетичного різноманіття популяцій Gentiana lutea L. за допомогою системи ДНК-праймерів з трьома праймерами з найбільшими значеннями розпізнавальної здатності з системи із 12 праймерів. Для дослідження поліморфізму шести популяцій G. lutea L. (табл. 2) використовували два ISSR-(UBC#807, UBC#811) та один RAPD-праймер (А18), які дозволили встановити приналежність досліджених особин до тієї чи іншої популяції з вірогідністю 95 % (кресл.). Частка поліморфних ампліконів у середньому склала 40,7 %, очікувана гетерозиготність -0,123, індекс Шеннона - 0,189. Показники генетичного поліморфізму подані у таблиці 2. Приклад 3 Подібно до прикладу 1 і 2, здійснювали дослідження генетичного поліморфізму тирличу жовтого з використанням описаного вище способу оцінки генетичного різноманіття популяцій Gentiana lutea L. за допомогою системи ДНК-праймерів з усіма дванадцятьма праймерами із створеної системи: ISSR-UBC#807, UBC#811, UBC#835, UBC#840, UBC#889, RAPD-A07, A18, A19, B01, CDDP-ERF-F, MYB, IRAP-1962. Ці праймери забезпечували ампліфікацію різних типів маркерів, зокрема і таких, що можуть бути безпосередньо пов'язані із кодувальними ділянками функціонально важливих генів. Частка поліморфних ампліконів у середньому склала 40,9 %, очікувана гетерозиготність - 0,124, індекс Шеннона - 0,187. Показники генетичного поліморфізму подані у таблиці 2. Таким чином, запропонований спосіб оцінки генетичного різноманіття популяцій Gentiana lutea L. за допомогою системи ДНК-праймерів дозволив: 1) скоротити, порівняно із відомим способом, який передбачає використання 35 праймерів, матеріальні витрати завдяки зменшенню кількості необхідних реактивів: у випадку оцінки з використанням системи із 12 праймерів - у 3 рази, експрес-оцінки з використанням 3 праймерів у 12 разів, для диференціації усіх досліджених зразків з використанням одного праймера - у 35 разів; 2) визначати генетичний поліморфізм на між- та внутрішньопопуляційному рівнях завдяки використанню праймерів, що дозволяють ідентифікувати як окремі генотипи, так і виявляти відмінності між популяціями; 3) оцінити генетичну різноманітність популяцій за різними ділянками ДНК (міжмікросателітними та міжретротранспозонними послідовностями, ділянками ДНК, що безпосередньо асоційовані із кодувальними послідовностями функціонально важливих генів відповіді на стрес та довільними послідовностями ДНК); 4) знизити трудомісткість процесу та зменшити затрати часу для виконання поставленого завдання у 3-35 разу; 5) зменшити кількість необхідного для дослідження рідкісного рослинного матеріалу. Джерела інформації: 1. Червона книга України. Рослинний світ /[відп. за ред. Я.П. Дідух]. - К.: Глобалконсалтинг, 2009. - 900 с. 2. Determination of genetic variability and polymorphism for some families to Gentiana lutea L. species by RAPD /M.R. Pop, С Sand, C.H. Barbu //Bulletin UASVM, Agriculture. - 2008. - Vol. 65(1). P. 383. 3. Genetic variation of the endangered Gentiana lutea L. var. aurantiaca (Gentianaceae) in populations from the Northwest Iberian Peninsula /O. Gonzalez-Lopez, C. Polanco, Z. Gyorgy [et al.] //Int. J. Мої. Sci. - 2014. - Vol. 15. - P. 10052-10066. 4. RGAP-анализ генетической гетерогенности популяций вида Gentiana lutea L. (Gentianaceae) с Украинских Карпат /М.З. Мосула, Н.Г. Каспрук, М.І. Гриневич [та ін.] //Фундаментальные исследования. - 2014. - Т. 5, час. 4. - С. 760-764. 5. Аналіз генетичної різноманітності популяцій Gentiana lutea L. методом маркування міжретротранспозонних послідовностей (IRAP-ПЛР) /М.З. Мосула, І.І. Конвалюк, В.М. Мельник [та ін.] //Физиология растений и генетика. - 2014. - Т. 46, № 1. - С. 45-55. 6. Оцінка генетичного поліморфізму чорногірських популяцій Gentiana lutea L. (Gentianaceae) з Українських Карпат: RAPD-аналіз /М.З. Мосула, І.І. Конвалюк, В.М. Мельник [та ін.] //Фактори експериментальної еволюції організмів: 36. наук. пр. Т. 13: присвяч. 95-річчю від часу заснування НАН України /Редкол.: В.А. Кунах (голов, ред.) [та ін.]. - К.: Логос, 2013. - С 80-83. 7. Генетичне різноманіття популяцій Gentiana lutea L. з хребта Свидівець Українських Карпат /М.З. Мосула, І.І. Конвалюк, В.М. Мельник [та ін.] //Вісн. Укр. тов-ва генетиків і селекціонерів. 2013. - Т. 11, № 2. - С. 250-259. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 60 Спосіб оцінки генетичного різноманіття популяцій Gentiana lutea L. за допомогою системи ДНКпраймерів, що включає молекулярно-генетичний аналіз на основі полімеразної ланцюгової 4 UA 99003 U 5 реакції, який відрізняється тим, що для проведення полімеразної ланцюгової реакції використовують комбінацію із 12 ПЛР-праймерів (ISSR: 807, 811, 835, 840, 889; RAPD: А07, А18, А19, В01; CDDP: ERF-F, MYB; IRAP: 1962), специфічних до різних геномних послідовностей, та на основі порівняння утворених високополіморфних спектрів ампліфікованих фрагментів ДНК оцінюють генетичну різноманітність популяцій Gentiana lutea L. Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5