Спосіб моделювання колітів у тварин з використанням сульфатвідновлювальних бактерій – індукторів виразок товстого кишечника

Реферат: Спосіб моделювання колітів у тварин з використанням бактерій - індукторів виразок товстого кишечника. Для створення виразок товстого кишечника використовують сульфатвідновлювальні бактерії, які продукують гідроген сульфід і спричиняють захворювання з подальшим утворенням виразок. UA 99480 U (54) СПОСІБ МОДЕЛЮВАННЯ КОЛІТІВ У ТВАРИН З ВИКОРИСТАННЯМ СУЛЬФАТВІДНОВЛЮВАЛЬНИХ БАКТЕРІЙ - ІНДУКТОРІВ ВИРАЗОК ТОВСТОГО КИШЕЧНИКА UA 99480 U UA 99480 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі мікробіології, біотехнології, експериментальної медицини, а саме до способів конструювання моделей колітів у тварин. Спосіб може використовуватися у наукових дослідженнях у біологічній науці, експериментальній медицині та ветеринарії. Запальні захворювання кишечника, зокрема виразкові коліти є комплексними багатофакторними хворобами невідомої етіології. Роль кишкових мікроорганізмів у розвитку виразкових колітів активно вивчаються (J.Н. Cummings, G.Т. Macfarlane, S. Macfarlane Intestinal Bacteria and Ulcerative Colitis // Curr. Issues Intest Microbiol. - 2003. - Vol. 4. - P. 9-20; M. Campieri, P. Gionchetti Bacteria as the cause of ulcerative colitis / // Gut. - 2001. - Vol. 48. - P. 132-135). Також характеризують хімічно індуковані тваринні моделі цих захворювань (М.М. Huycke, H.R. Gaskins Commensal bacteria, redox stress, and colorectal cancer: mechanisms and models // Exp. Biol. Med. - 2004. - Vol. 229. - P. 586-597; L. Zheng, Z. Q. Gao, S. X. Wang. A chronic ulcerative colitis model in rats // World J. Gastroenterology. - 2000. - Vol. 6, N 1. - P. 150-152; M. Perse, A. Cerar Dextran Sodium Sulphate Colitis Mouse Model: Traps and Tricks // J. Biomed and Biotech. - 2012. - Article ID 718617. - P. 1-13; D. Low, D. D. Nguyen, E. Mizoguchi Animal models of ulcerative colitis and their application in drug research // Drug Design, Development and Therapy. - 2013. - Vol. 7. - P. 13411357). Сульфатвідновлювальні бактерії продукують гідроген сульфід у процесі дисиміляційного відновлення сульфату (І. V. Kushkevych. Sulfate-reducing bacteria of the human intestine. I. Dissimilatory sulfate reduction // Studia Biologica. - 2012. - Vol. 6, N 1. - P. 149-180). За високих концентрацій у кишечнику, ця сполука може бути токсичною і мутагенною, спричиняючи захворювання людини і тварин (М. С Pitcher, J. H. Cummings Hydrogen sulphide: a bacterial toxin in ulcerative colitis? // Gut. - 1996. - Vol. 39. - P. 1-4). Кишкові сульфатредуктори і продукти їх метаболізму часто виявляють під час кривавої діареї, болях у животі. У розвитку захворювання основним чинником патогенезу є надмірна кількість гідроген сульфіду, яку організм не здатний знешкоджувати (I.V. Kushkevych Sulfate-reducing bacteria of the human intestine. II. The role in the diseases development // Studia Biologica. - 2012. - Vol. 6, N2. - P. 221-250). Відомі такі дослідження тваринних моделей колітів: - Huycke М. М, Gaskins H. R. Commensal bacteria, redox stress, and colorectal cancer: mechanisms and models // Exp. Biol. Med. - 2004. - Vol. 229. - P. 586-597; - Siddiqui A., Ancha H., Tedesco D. et al. Antioxidant therapy with N-acetylcysteine plus mesalamine accelerates mucosal healing in a rodent model of colitis // Dig. Dis. Sci. - 2006. - Vol. 51. - P. 698-705; - Zheng L., Gao Z. Q., Wang S. X. A chronic ulcerative colitis model in rats // World J. Gastroenterology. - 2000. - Vol. 6, N 1. - P. 150-152; - Barnett M., Fraser A. Animal Models of Colitis: Lessons Learned, and Their Relevance to the Clinic // Ulcerative Colitis. - 2011. - P. 161-178; - Perse M., Cerar A. Dextran Sodium Sulphate Colitis Mouse Model: Traps and Tricks // J. Biomed and Biotech. - 2012. - Article ID 718617. - P. 1-13; - Low D., Nguyen D., Mizoguchi E. Animal models of ulcerative colitis and their application in drug research // Drug Design, Development and Therapy. - 2013. - Vol. 7. - P. 1341-1357. Недоліком вказаних аналогів є: - Дослідження стосуються лише хімічно індукованих тваринних моделей колітів. - Остаточна етіологічні роль сульфатвідновлювальних бактерій у розвитку цих захворювань досі малодосліджена. - Способи вивчення ролі кишкових бактерій, описані у цих роботах стосуються лише деяких видів мікроорганізмів, а також хімічно індукованих колітів, що суттєво обмежує можливості досліджень перебігу процесу хвороби, застосовуючи сульфатвідновлювальні бактерії. Найближчим по суті до способу, що заявляється, є спосіб створення хімічно індукованих тваринних моделей колітів (М. Perse, A. Cerar Dextran Sodium Sulphate Colitis Mouse Model: Traps and Tricks // J. Biomed and Biotech. - 2012. - Article ID 718617. - P. 1-13.) Спільними ознаками найближчого аналога зі заявленим способом є створення моделей колітів у тварин. Досі не розроблено моделі виразкового коліту у тварин, застосовуючи сульфатвідновлювальні бактерії - як індуктори виразок товстої кишки, а також недостатньо вивчена етіологічна роль цих мікроорганізмів у процесі розвитку кишкових захворювань. Заявлений нами спосіб усуває недоліки найближчого аналога - створення тваринної моделі виразкових колітів, застосовуючи кишкові штами сульфатвідновлювальних бактерій, детального вивчення їхньої етіологічної ролі під час перебігу захворювання, а також може бути використаний для вивчення впливу лікарських препаратів або інших потенційних методів лікування патогенезу і перебігу патологічного процесу. 1 UA 99480 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 В основу корисної моделі поставлено задачу розробити метод створення експериментальної тваринної моделі виразкового коліту, застосовуючи кишкові штами сульфатвідновлювальних бактерій, з метою вивчення етіологічної ролі цих мікроорганізмів у розвитку захворювань кишечника, а також для подальшого використання цієї моделі під час вивчення впливу лікарських препаратів або інших потенційних методів лікування патогенезу і дослідження перебігу розвитку захворювання. Технічний результат досягається за допомогою мікробіологічних, фізіологічних та біохімічних маніпуляцій, використовуючи кишкові штами сульфатвідновлювальних бактерій. Під час проведення патентно-інформаційного пошуку виявлене технічне рішення, в якому є ряд суттєвих ознак, спільних із описаними у роботах (L. Zheng, Z. Q. Gao, S. X. Wang. A chronic ulcerative colitis model in rats // World J. Gastroenterology. - 2000. - Vol. 6, N 1. - P. 150-152; M. Barnett, A. Fraser. Animal Models of Colitis: Lessons Learned, and Their Relevance to the Clinic // Ulcerative Colitis. - 2011. - P. 161-178; M. Perse, A. Cerar Dextran Sodium Sulphate Colitis Mouse Model: Traps and Tricks // J. Biomed and Biotech. - 2012. - Article ID 718617. - P. 1-13; D. Low, D. D. Nguyen, E. Mizoguchi Animal models of ulcerative colitis and their application in drug research // Drug Design, Development and Therapy. - 2013. - Vol. 7. - P. 1341-1357), а саме: мікробіологічні, біотехнологічні та фізіологічні процедури. Однак, даних суттєвих ознак недостатньо для одержання технічного результату заявленого рішення. Технічних рішень, що би за сукупністю ознак співпадали із заявленим способом у достатній патентній і науково-технічній інформації не виявлено. У джерелах патентної і науково-технічної інформації не знайдено технічних рішень, в яких би були описані відомості про ознаки, що відрізняють заявлений спосіб від найближчого аналога і забезпечують досягнення технічного результату: створення тваринних моделей виразкових колітів, застосовуючи кишкові штами сульфатвідновлювальних бактерій. Отже, заявлене технічне рішення не випливає явним чином з рівня техніки. Корисна модель може бути використаний у науково-дослідницьких мікробіологічних, біотехнологічних та фізіологічних лабораторіях. Для реалізації заявленої корисної моделі необхідно: 1. Відібрати 45 лабораторних щурів (самців, віком сім місяців) і розділити на три групи (по 15 тварин у кожній групі). 2. Перша група тварин отримували стандартний сертифікований корм і були використані як контроль; друга і третя - експериментальні групи для створення моделі виразкового коліту. 3. Тварини другої групи отримували стандартний корм разом з дозою (1 мл кожної доби) модифіковане середовище Кравцова-Сорокіна (без солі Мора) для ініціювання росту СВБ їхньої власної мікрофлори. 4. Третя група тварин отримувала стандартний корм разом з дозою суспензії штамів сульфатвідновлювальних бактерій у аналогічному середовищі, що попередньо були ізольовані з товстого кишечника людини та ідентифіковані (Kushkevych I. V. Identification of sulfate-reducing bacteria strains of the human large intestine /1. V. Kushkevych // Studia Biologica. - 2013. - Vol. 7, N 3. - P. 115-124). Рідке середовище Кравцова-Сорокіна і суспензію з досліджуваних штамів у ньому вводили перорально упродовж 25 діб. 5. Визначити кількісний і якісний аналіз складу мікрофлори кишечника у тварин усіх груп після 5, 10, 15, 20, 25 діб від початку експерименту. 6. Підраховувати кількість колоній і рівень популяції кожної групи мікроорганізмів у десяткові логарифмічні шкалі (log10) колоній утворюючих одиниць (КУО) на грам сирої маси зразка. 7. Оцінити мікрофлору просвіту товстого кишечника за індексом сталості (Sustainability Index, %) і частотою виявлення (Pi). 8. Визначити вивільнення сульфіду з фекалій, відібраних різних частин товстого кишечника визначено на 5, 10, 15, 20, 25 добу від початку введення у травний тракт тваринам середовища чи суспензії бактерій. Швидкість вивільнення H2S на грам сирої маси фекалій розрахувати за концентрацією H2S, об'ємом утвореного газу і масою фекалій (Ohge Н., Fume J. К., Springfield J. The effect of antibiotics and bismuth on fecal hydrogen sulfide and sulfate-reducing bacteria in the rat // FEMS Microbiol. Lett. - 2003. - Vol. 228. - P. 137-142; Levitt M. D., Springfield J., Furne J. et al. Physiology of sulfide in the rat colon: use of bismuth to assess colonic sulfide production // J. Appl. Physiol. - 2002. - Vol. 92. - P. 1655-1660). 9. Визначити концентрації ацетату у фекаліях, відібраних з різних частин товстого кишечника після 5, 10, 15, 20, 25 доби, за допомогою колориметричного аналізу, використовуючи комерційні Acetate Colorimetric Assay Kit (Sigma-Aldrich, Catalog Number MAK086). 2 UA 99480 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 10. Оцінити рівень утворення виразок у різних частинах товстого кишечника в усіх експериментальних групах тварин на 25 добу виявлення. Описаний вище алгоритм дає можливість з високим рівнем інформативності та достовірності створювати експериментальні моделі колітів у тварин, застосовуючи сульфатвідновлювальні бактерії - як індукторів виразок товстого кишечника. Приклад конкретного виконання Ефективність заявленого способу і його переваги в порівнянні з найближчим аналогом підтверджено науковими дослідженнями, результати яких наведені нижче. Усі маніпуляції з тваринами проводились відповідно до принципів "Європейської конвенція про захист хребетних тварин, що використовуються в експериментальних та інших наукових цілях" (Страсбург, 1986), Постанови першого національного конгресу з біоетики (Київ, 2001) і Закону України "Про захист тварин від жорстокого поводження" (Київ, 2006). Виконано мікробіологічний аналіз мікрофлори кишечника щурів упродовж двадцяти п'яти діб (креслення). На основі результатів досліджень встановлено, що мікрофлора першої (контрольної) групи тварин упродовж двадцяти п'яти діб достовірно не змінювалася. Введення у стандартний раціон тварин (другої групи) рідке модифіковане середовище Кравцова-Сорокіна, що містило сульфат, а також додавання тваринам третьої групи дози суспензії сульфатвідновлювальних бактерій у середовищі культивування, спричиняло значні зміни мікрофлори уже на п'яту добу експерименту. За цих умов, введення суспензії штамів у шлунковокишковий тракт щурів призводило до зниження кількості бактерій роду Lactobacillus (30 %), Peptococcus (22 %), Candida (25 %) та збільшення кількості - Clostridium (40 %), Е. соlі (лактозонегативні) (78 %), Proteus (26 %), Klebsiella (36 %), Staphylococcus (30 %), і сульфатвідновлювальних бактерій (92 %), порівняно з контролем на п'яту добу у третій групі тварин. Для детальної характеристики умов кишечника і його мікрофлори, здійснено аналіз індексу сталості та частоти виявлення штамів кишкової мікрофлори різних груп тварин на двадцять п'яту добу. Результати цього дослідження дали змогу підтвердити, що дані SI та Pi значно відрізнялися у трьох груп тварин. Визначено концентрації сульфіду і ацетату у зразках фекалій з різних відділів товстого кишечника щурів, зокрема сліпа кишка, висхідна ободова кишка, поперечно-ободова кишка, низхідна ободова кишка, пряма кишка. Встановлено, що рівень сульфіду і ацетату у фекаліях першої (контрольної) групи тварин майже не змінювався упродовж 25 діб. Акумуляція сульфіду і ацетату у зразках фекалій різних ділянок товстої кишки дещо відрізнялися. Встановлено, що найвищий рівень сульфіду і ацетату акумульований у фекаліях відібраних з низхідної ободової кишки другої та третьої групи тварин упродовж 25 діб. У цьому випадку, концентрація сульфіду і ацетату збільшувалася прямо пропорційно до тривалості введення дози середовища чи суспензії зі сульфатвідновлювальними бактеріями. Достовірно значні кількісні зміни концентрації цих сполук та їх суттєве збільшення спостерігали на двадцять п'яту добу. За цих умов, рівень сульфіду і ацетату у низхідній ободовій кишці збільшився відповідно на 88 і 95 % у фекаліях другої групи, а також 93 і 97 % - третьої групи тварин. Досліджено рівень утворення виразок у різних ділянках товстої кишки щурів першої та другої дослідних груп за впливу специфічних умов упродовж 25 діб. На п'яту добу експерименту формування виразок не виявлено. Проте починаючи з 10 доби почали спостерігати утворення незначних кількостей виразок. Найвищий рівень ульцеризації встановлено на двадцять п'яту добу в обох експериментальних груп тварин. У цьому випадку виявлено велику кількість виразок у низхідній ободовій кишці, порівняно з іншими частинами товстого кишечника щурів. Дані про рівень формування виразок у низхідній ободовій кишці узгоджуються з результатами акумуляції сульфіду і ацетат, яка була також найвищою у цьому відділі кишечника. Порівнюючи рівень утворення виразок в обох групах тварин, найвищий рівень ульцеризації виявлено у третьої групи, порівняно з другою групою дослідних тварин. На основі отриманих результатів, можна зробити висновок, що введення сульфатвмісного середовища чи суспензії зі сульфатвідновлювальними бактеріями у шлунково-кишковий тракт, спричиняє значні зміни у піддослідних тварин. За цих умов, значно змінювалась структура мікробіоценозу, кількість мікроорганізмів, їхнє співвідношення, індекс сталості та частота виявлення в обох експериментальних групах тварин. Відповідно до результатів акумуляції сульфіду і ацетату, найвищий рівень цих метаболітів бактерій виявлено у низхідній ободовій кишці. Концентрації цих сполук зростали прямо пропорційно до тривалості введення дози сульфатвмісного середовища чи суспензії сульфатвідновлювальних бактерій. Ці дані узгоджуються з отриманими результатами ульцеризації кишечника тварин третьої групи, де рівень утворення виразок був також значно 3 UA 99480 U 5 10 15 20 вищий, ніж у другій групі (Ivan V. Kushkevych. Etiological Role of Sulfate-Reducing Bacteria in the Development of Inflammatory Bowel Diseases and Ulcerative Colitis. American Journal of Infectious Diseases and Microbiology. 2014; 2(3):63-73). Змінений якісний і кількісних склад нормальної кишкової мікрофлори (дисбіоз) може бути також залучений у розвиток запальних захворювань кишечника, виразкових колітів та різних патологічних процесів. Ці дослідження можуть бути корисні для попередження розвитку захворювань, оскільки уперше отримано більш докладну інформацію про етіологічну роль сульфатвідновлювальних бактерій у виникненні захворювань кишечника, яка є важливою для клінічної діагностики цих видів захворювань. Розуміючи роль сульфатвідновлювальних бактерій та їх внесок у розвиток захворювань можна регулювати їх кількість й співвідношення у товстому кишечнику і, відповідно, зменшення продукування сульфіду і ацетату. Ці результати є корисними для прояснення чинників, що впливають на продукування сульфіду і ацетату у товстій кишці людини. Описані експериментальні результати можуть бути особливо корисні для більш детального вивчення запального захворювання кишечника і виразкового коліту зі застосуванням терапевтичної стратегії. Ці дані також важливі для дослідження виразкових колітів на тваринних моделях, зокрема для вивчення механізмів дії антимікробних препаратів з профілактичною метою чи терапії конкретних компонентів, залучених в патогенез захворювання. Дослідження виконані за автором Кушкевич І.В. на базі лабораторії біотехнології, лабораторії біохімії Фармацевтичного факультету Університету ветеринарних і фармацевтичних наук Брно (Чеська Республіка), а також у лабораторії молекулярної біології та клінічної біохімії Інституту біології тварин НААН України. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 25 Спосіб моделювання колітів у тварин з використанням бактерій - індукторів виразок товстого кишечника, який відрізняється тим, що для створення виразок товстого кишечника використовують сульфатвідновлювальні бактерії, які продукують гідроген сульфід і спричиняють захворювання з подальшим утворенням виразок. 4 UA 99480 U Комп’ютерна верстка А. Крулевський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5