Спосіб молекулярно-генетичного конструювання cysk мутантів сульфатвідновлювальних бактерій – синтетиків цистеїну

Реферат: Спосіб молекулярно-генетичного конструювання CysK мутантів сульфатвідновлювальних бактерій - синтетиків цистеїну включає клонування гена CysK бактерій Escherichia coli, його трансфер у геном сульфатвідновлювальних бактерій, аналіз властивостей отриманих CysK мутантів. Додатково відображає алгоритм використання сульфатвідновлювальних бактерій для знешкодження гідроген сульфіду у кишечнику людини і тварин, а також у водному середовищі. UA 99211 U (54) СПОСІБ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧНОГО КОНСТРУЮВАННЯ СУЛЬФАТВІДНОВЛЮВАЛЬНИХ БАКТЕРІЙ - СИНТЕТИКІВ ЦИСТЕЇНУ UA 99211 U UA 99211 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі мікробіології, біотехнології, генетики, зокрема до способів молекулярно-генетичного конструювання штамів мікроорганізмів. Спосіб може використовуватися у наукових дослідженнях у біологічній науці, експериментальній медицині та ветеринарії. Властивості cysK мутантів вивчені у бактерій Escherichia coli і Salmonella typhimurium (A. Wiater, D. Hulanicka Properties ої суsК mutants of Escherichia coli K12 // Acta Biochim. Pol. - 1979Vol. 26, - P. 21-28; A. Boronat, P. Britton, M. C. Jones-Mortimer Location on the Escherichia coli genome of a gene specifying O-acetylserine(thiol)lyase // J. Gen. Microb. - 1984. - Vol. 130. - P. 673685; M.A. Becker, N.M. Kredich, G.M. Tomkins The purification and characterization of O-acetylserine sulfhydrylase-A from Salmonella typhimurium II J. Biol. Chem. - 1969. - Vol. 244. - P. 2418-2427). Наявність cysK гена у мікроорганізмів забезпечує експресію ензиму О-ацетилсерин(тіол)ліази, що каталізує: синтез цистеїну, використовуючи гідроген сульфід як субстрат. Сульфатвідновлювальні бактерії здійснюють дисиміляційне відновлення сульфату до гідроген сульфіду. Останній є токсичною і мутагенною сполукою, що може спричиняти різноманітні захворювання людини і тварин. Ці бактерії та продукти їх метаболізму (гідроген сульфід) часто виявляють під час кривавої діареї, болях у животі. Припускають, що вони, інтенсивно продукуючи гідроген сульфід, можуть спричиняти втрату ваги, часту дефекацію, артрити, ревматичні захворювання, загальне нездужання, підвищення проникності кишечника, виразкові коліти (Kushkevych I. V. Sulfate-reducing bacteria of the human intestine. II. The role in the diseases development / I. V. Kushkevych // Studia Biologica. - 2012. - Vol. 6, № 2. - P. 221-250). Сульфатвідновлювальні бактерії не містять cysK ген, відповідно, не здатні експересувати ензим О-ацетилсерин(тіол)ліазу, утилізуючи токсичний гедроген сульфід до цистеїну. Відомі лише такі дослідження cysK мутантів бактерій: - Wiater Α., Hulanicka D. Properties of cysK mutants of Escherichia coli K12 // Acta Biochim. Pol. 1979-Vol. 26, - P. 21-28; - Boronat Α., Britton P., Jones-Mortimer M.С Location on the Escherichia coli genome of a gene specifying O-acetylserine(thiol)lyase // J. Gen. Microb. - 1984. - Vol. 130. - P. 673-685; - Becker M.A., Kredich N.M., Tomkins G.M. The purification and characterization of O-acetylserine sulfhydrylase-A from Salmonella typhimurium II J. Biol. Chem. - 1969. - Vol. 244. - P. 2418-2427. Недоліком вказаних аналогів є: - Дослідження стосуються лише бактерій Escherichia coli та Salmonella typhimurium. - Молекулярно-генетичне клонування CysK гена, його трансформація у клітини сульфатвідновлювальних бактерій, а також вивчення експресії ензиму Оацетилсерин(тіол)ліази досі не проводились. - Способи вивчення CysK мутантів бактерій, описані у цих роботах, стосуються лише локалізації CysK гена у геномі та експресії його продукту, що суттєво обмежує можливості методів клонування цього гена, його трансформацію і вивчення у сульфатвідновлювальних бактерій. Найближчим по суті до способу, що заявляється, є вивчення гена CysK у геномі Е.coli, а також аналіз властивостей мутантів (A. Wiater, D. Hulanicka Properties of cysK mutants of Escherichia coli K12 // Acta Biochim. Pol. - 1979-Vol. 26. - P. 21-28.). Спільними ознаками прототипу із заявленим способом є аналіз властивостей мутантів бактерій. Заявлений нами спосіб усуває недоліки прототипу. Уперше автором розроблено алгоритм, що дає можливість з високим рівнем інформативності та достовірності проводити молекулярногенетичне конструювання cysK мутантів сульфатвідновлювальних бактерій. Як результат: усунення проблеми нагромадження кінцевого продукту метаболізму сульфатвідновлювальних бактерій - гідроген сульфіду у кишечнику людини і тварин, використовуючи CysK мутантні штами цих мікроорганізмів. В основу корисної моделі поставлена задача розробити спосіб детоксикації та нейтралізації гідроген сульфіду. Для цього використовують генетично сконструйований СysK мутантний штам сульфатвідновлювальні бактерій, що здатен використовувати власний та екзогенний гідроген сульфід і синтезувати з нього цистеїн. Технічний результат досягають за допомогою мікробіологічних, молекулярно-генетичних та біохімічних маніпуляцій, клонуюють ген CysK з геному Е.coli та його трансформують у клітини сульфатвідновлювальних бактерій. Наявність гена CysK у клітинах-мутантів перевіряють за допомогою алгоритму програми BLAST у базі даних GenBank. Під час проведення патентно-інформаційного пошуку виявлене технічне рішення, в якому є ряд суттєвих ознак, спільних із описаними у роботах (А. Wiater, D. Hulanicka Properties of cysK mutants of Escherichia coli K12 // Acta Biochim. Pol. - 1979-Vol. 26. - P. 21-28; A. Boronat, P. Britton, 1 UA 99211 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 M. C. Jones-Mortimer Location on the Escherichia coli genome of a gene specifying Oacetylserine(thiol)lyase // J. Gen. Microb. - 1984. - Vol. 130. - P. 673-685), a саме: молекулярногенетичні процедури клонування гена CysK з E.coli, його трансформація у клітини, виділення CysK мутантів, визначення активності О-ацетилсерин(тіол)ліази, а також визначення продукування цистеїну мутантним штамом. Однак, даних суттєвих ознак недостатньо для одержання технічного результату заявленого рішення. Технічних рішень, що би за сукупністю ознак співпадали із заявленим способом, у достатній патентній і науково-технічній інформації не виявлено. Це дало можливість зробити висновок про відповідність заявленого технічного рішення критерію винаходу (корисної моделі) "новизна". У джерелах патентної і науково-технічної інформації не знайдено технічних рішень, в яких би були описані відомості про ознаки, що відрізняють заявлений спосіб від прототипу і забезпечують досягнення технічного результату: молекулярно-генетичного конструювання штамів сульфатвідновлювальних бактерій - синтетиків цистеїну, клонуючи ген CysK з Е.соlі, трансформуючи його і виділяючи CysK мутанти сульфатвідновлювальних бактерій. Корисна модель може бути використана у науково-дослідницьких мікробіологічних та біотехнологічних лабораторіях. Спосіб відповідає критерію "промислова придатність". Для реалізації заявленої корисної моделі: 1. Нагромаджують культуру Е. соlі та сульфатвідновлювальних бактерій. 2. Використовують набір комерційних реактивів HotStar Master Mix Taq polymerase (QIAGEN), UDG-glycosylase (New England Biolabs) і праймери CysK-R і CysK-F (Generi-Biotech), клонувати ген CysK з геному Е. соlі. Трансформують ген CysK у клітини сульфатвідновлювальних бактерій. 3. Виділяють CysK мутанти сульфатвідновлювальних бактерій, засіваючи однодобову культуру на агаризоване середовище Кравцова-Сорокіна, що містить IPTG і X-Gal, аналогічне середовище з триазолом чи на агаризоване середовище, що містить азасерин і L-цистеїну. 4. Виділяють плазмідну ДНК відібраних трансформантів (pSTVib-7-CysK) з використанням QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN). Наявність вбудованого гена CysK у плазміді підтверджують полімеразною ланцюговою реакцією використовуючи комерційний набір Maxima™ Probe qPCR Master Mix 2X, "FERMENTAS" і універсальні праймери M13R і M13F20. 5. У супернатанті зруйнованих клітин-трансформантів, визначають активніть Оацетилсерин(тіол)ліази за методом A.L. Fimmel і R.E. Loughlin (Fimmel A.L., Loughlin R. E. Isolation and characterization of cysK mutants of Escherichia соlі K12 // J. Gen. Microbiol. - 1977. Vol. 103. - № 1. - P. 37-43). 6. Визначають продукування цистеїну у середовище мутантними штамами за методом, описаним у роботі М.K. Gaitonde (Gaitonde М.K. A spectrophotometric method for the direct determination of cysteine in the presence of other naturally occurring amino acids // Biochem. J. 1967. - Vol. 104. - P. 627-633). 7. Визначають використання сульфату і лактату, акумуляцію сульфіду/цистеїну і ацетату у середовищі культивування диким і мутантним штамом сульфатвідновлювальних бактерій, відповідно. 8. Порівнюють фізіолого-біохімічні характеристики (ріст у середовищі, процесом дисиміляційного відновлення сульфату) у мутантного штаму і дикого типу. Описаний вище алгоритм дає можливість з високим рівнем інформативності та достовірності проводити молекулярно-генетичне конструювання cysK мутантів сульфатвідновлювальних бактерій - синтетиків цистеїну з подальшим їх застосуванням для детоксикації гідроген сульфіду у кишечнику людини і тварин. Ефективність заявленого способу і його переваги в порівнянні з прототипом підтверджено науковими дослідженнями, результати яких наведені нижче. Встановлено, що мутантний штам сульфатвідновлювальних бактерій) нагромаджував біомасу на 36 % вищу, порівняно з диким штамом (Фіг. 1-6, Фізіолого-біохімічні властивості дикого і мутантного штамів (Мm, n=5): Фіг. 1 - бактеріальний ріст, Фіг. 2 - акумуляція цистеїну і використання сульфіту/сульфіду; Фіг. 3 - використання сульфату як акцептора електронів і акумуляція сульфіду/цистеїну; Фіг. 4 - ензиматична активність О-ацетилсерин (тіол)ліази за впливу сульфату, сульфіту і сульфіду; Фіг. 5 - використання лактату як донора електронів і акумуляція ацетату; Фіг. 6 - інгібування активності О-ацетилсерин(тіол)ліази і накопичення сульфіду за впливу цистеїну. 2 UA 99211 U 5 10 15 20 Результати накопичення біомаси узгоджуються з дослідженнями динаміки використання сульфату і лактату, а також акумуляцією сульфіду/цистеїну і ацетату, відповідно у дикого і мутантного штаму. У цьому випадку рівень сульфату і лактату у середовищі на 60 годину культивування досягав мінімальних значень, що вказує на повне використання цих субстратів. Крім цього мутант консумував ці субстрати набагато швидше, ніж дикий штам бактерій. Мутантний штам сконсумував сульфат повністю вже на 48 годину культивування. Досліджено здатність мутантного штаму споживати сульфіт і сульфід із середовища культивування для синтезу цистеїну. Бактерії мутантного штаму споживав ці сполуки, використовуючи як субстрат, і акумулював цистеїн у середовище культивування. У результаті проведеної роботи можна зробити наступний висновок: уперше клоновано ген cysK E.coli і здійснено його перенесення у геном дикого штаму кишкових сульфатвідновлювальних бактерій. Уперше досліджена експресія гена cysK у мутантного штаму з утворенням кінцевого продукту реакції (цистеїну), а також визначено активність ензиму Оацетилсерин(тіол)ліази. Схема відновлення сульфатів до цистеїну мутантним штамом наведена на Фіг.7. АТФ-сульфурилаза каталізує утворення аденозин-5'-фосфосульфат (АФС), після чого з АФС формується сульфіт за участю АФС-редуктази; утворення сульфіду відбувається із сульфіту за участю ферредоксин залежної сульфітредуктази; ензим (9-ацетилсерин(тіол)ліаза каталізує останню реакцію, під час якої використовується утворений сульфід і О-ацетил-L-серин, та синтезується цистеїн. Дослідження виконані за автором Кушкевич І.В. на базі лабораторії біотехнології, лабораторії біохімії Фармацевтичного факультету Університету ветеринарних і фармацевтичних наук Брно (Чеська Республіка), а також у лабораторії молекулярної біології та клінічної біохімії Інституту біології тварин НААН України. 25 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 30 Спосіб молекулярно-генетичного конструювання CysK мутантів сульфатвідновлювальних бактерій - синтетиків цистеїну, який включає клонування гена CysK бактерій Escherichia coli, його трансфер у геном сульфатвідновлювальних бактерій, аналіз властивостей отриманих CysK мутантів, який відрізняється тим, що додатково відображає алгоритм використання сульфатвідновлювальних бактерій для знешкодження гідроген сульфіду у кишечнику людини і тварин, а також у водному середовищі. 3 UA 99211 U 4 UA 99211 U 5 UA 99211 U Комп’ютерна верстка Л. Литвиненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6