Застосування нанокомпозиту високодисперсного кремнезему та кластерів срібла як протимікробного лікарського засобу

Реферат: Застосування нанокомпозиту протимікробного препарату. високодисперсного кремнезему та кластерів срібла як UA 68913 U (54) ЗАСТОСУВАННЯ НАНОКОМПОЗИТУ ВИСОКОДИСПЕРСНОГО КРЕМНЕЗЕМУ ТА КЛАСТЕРІВ СРІБЛА ЯК ПРОТИМІКРОБНОГО ЛІКАРСЬКОГО ЗАСОБУ UA 68913 U UA 68913 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель, що заявляється, належить до визначення нових властивостей нанокомпозиту "високодисперсний кремнезем-кластери срібла", а саме, мінімальної інгібуючої концентрації та мінімальної бактерицидної концентрації по відношенню до Staphylococcus aureus УКМ В-904 (АТСС 25923), Escherichia coli УКМ В-906 (АТСС 25922), Candida albicans УКМ Y-1918 (АТСС 885-653), Pseudomonas aeruginosa УКМ В-900 (АТСС 9027). Відомо, що більшість інфекційних захворювань, зокрема травного каналу, шкіри та слизових оболонок, супроводжується та ускладнюється інтоксикаційним синдромом, який призводить до значних порушень функцій органів та систем (зрив адаптаційних можливостей організму, пригнічення метаболізму, імунних процесів тощо). Розвиток значної кількості антибіотикорезистентних мікроорганізмів потребує пошуку протимікробних малотоксичних лікарських засобів, які зменшують прояви інтоксикаційного синдрому [1, 2]. Відомо, що препарати з наночастинками срібла мають протимікробні властивості, а препарати на основі нанодисперсного кремнезему мають значні сорбційно-детоксикаційні властивості. В Україні зареєстровано препарат Силікс (субсидил, Україна) - похідне діоксиду кремнію, що застосовується при гострих кишкових захворюваннях, що супроводжуються діарейним синдромом (сальмонельоз, харчові токсикоінфекції), та шляхом адсорбції зв'язує і виводить з організму токсини екзогенного та ендогенного походження, харчові і бактеріальні алергени, мікробні ендотоксини, токсичні продукти, що утворюються в процесі розпаду білків у кишечнику [3]. Перспективним є створення вітчизняного препарату "Аргосил", що являє собою комплекс нанокластерів срібла та частинок високодисперсного кремнезему, синтезованого в Інституті хімії поверхні ім. О.О. Чуйка НАН України і частково вивченого в експерименті як протимікробного препарату [4, 5]. Задачею корисної моделі, що заявляється, є визначення протимікробних властивостей високодисперсного композиту кремнезему - кластерів срібла, а саме мінімальної інгібуючої концентрації та мінімальної бактерицидної концентрації по відношенню до Staphylococcus aureus УКМ В-904 (АТСС 25923), Escherichia coli УКМ В-906 (АТСС 25922), Candida albicans УКМ Y-1918 (АТСС 885-653), Pseudomonas aeruginosa УКМ В-900 (АТСС 9027), що є тестовими штамами мікроорганізмів для визначення антимікробної дії лікарських засобів. Дослідження проводили у відповідності до вимог Належної лабораторної практики (GLP). Отримання добових культур мікроорганізмів, приготування вихідних і робочих суспензій мікроорганізмів та препарату, визначення мінімальної інгібуючої концентрації (МІС) досліджуваної речовини проводили у рідкому середовищі LB (Luria-Bertani broth, Merck, Germany). Висів аліквот дослідних і контрольних суспензій для встановлення мінімальної бактерицидної/фунгіцидної концентрації (MBC/MFC) препарату проводили на щільне поживне середовище LB (Luria-Bertani medium, Merck, Germany) в чашки Петрі. Вихідний розчин нанокомпозиту "високодисперсного кремнезему-кластерів срібла" одержували шляхом розчинення 672,8 мг в 2 мл середовища LB. Отриману таким чином суспензію сполуки із концентрацією 336,4 мг/мл застосовували для визначення антимікробних властивостей щодо S. aureus. Для С. albicans концентрацію композиту у вихідному розчині знижували вдвічі (168,2 мг/мл). З цією метою 1 мл вихідного розчину змішували із аналогічними об'ємом вихідного середовища. Таким же чином досягали двократного зниження концентрації вихідного розчину (84,1 мг/мл) при дослідженні активності щодо Е. соli та P. aeruginosa. В подальшому, для кожного виду мікроорганізмів готували ряд із 12 пробірок, в які вносили по 0,5мл середовища LB. Із вихідного розчину нанокомпозиту відбирали 0,5 мл і вносили у перші пробірки кожного ряду, після чого готували подвійні серійні розведення. Добові культури мікроорганізмів отримували шляхом їх культивування у рідкому середовищі LB протягом 18-24 год. при 37 °C. Із добових культур готували вихідні бактеріальні суспензії за 8 стандартом мутності 0,5 Од по МакФарланду (титр близько 1,510 КУО/мл). Останні розводили у співвідношенні 1:5 (по об'єму) і отримували робочі суспензії мікроорганізмів. В подальшому у пробірки із приготовленими подвійними розведеннями досліджуваного препарату вносили по 0,5 мл робочих суспензій. Таким чином, кінцевий об'єм розчину в досліджуваних пробірках сягав 7 61 мл. При цьому титр S. aureus, E. соlі і P. aeruginosa становив 10 КУО/мл, а С. albicans-10 КУО/мл. В дослідних зразках робочі концентрації, з яких розпочинали досліджувати вплив нанокомпозиту "високодисперсного кремнезему-кластерів срібла" на мікроорганізми, становили: для S. Aureus-84,1 мг/мл, для С. albicans-42,05 мг/мл, а для E. соlі і P. aeruginosa-21,03 мг/мл. Кінцевими досліджуваними концентраціями нанокомпозиту "високодисперсного кремнеземукластерів срібла" були: для S. Aureus-0,04 мг/мл, для С. albicans-0,02 мг/мл, а для E. соlі і P. aeruginosa-0,01 мг/мл. Вміст чистого срібла у новосинтезованому нанокомпозиті срібла 1 UA 68913 U 5 10 15 20 25 30 35 40 "Аргосил" становив 7,61 %. Виходячи із цього, діапазон концентрацій чистого срібла у дослідних пробірках із вказаним препаратом для S. aureus знаходився в межах від 6400 до 3,13 мкг/мл, для С. albicans - від 3200 до 1,56 мкг/мл, а для E. соlі і P. aeruginosa - від 1600 до 0,78 мкг/мл. Одночасно із дослідними варіантами в дослідженнях були також використані контрольні зразки. Для отримання позитивних контролів росту мікроорганізмів у пробірки із 0,5 мл LB вносили аналогічні об'єми кожної із досліджуваних культур без додавання препаратів. Як негативні контролі росту мікроорганізмів використовували пробірки із 0,5 мл LB та 0,5 мл робочих суспензій досліджуваних культур (без внесення препаратів), які витримували протягом 24 год. при 4 °C. Як негативні контролі чистоти середовища слугували пробірки із 1 мл середовища LB без додавання бактеріальних суспензій і препаратів. Як негативні контролі чистоти препаратів використовували їх подвійні серійні розведення в концентраціях, аналогічних створюваним у дослідних зразках, до яких замість бактеріальних суспензій добавляли 0,5 мл вихідного LB. Всі описані контролі готували у двох зразках. Інкубування дослідних і контрольних суспензій, за виключенням негативних контролів росту мікроорганізмів, здійснювали на качалці при 37 °C та інтенсивному перемішуванні (240 об./хв.) протягом 24 год. Перед врахуванням результатів перевіряли негативні контролі середовища і препаратів на відсутність росту мікроорганізмів, а позитивні контролі - на наявність росту. Після цього дослідні зразки порівнювали із негативними контролями росту мікроорганізмів, вносячи корективи на наявність мутності у суспензіях відповідно до негативних контролів чистоти препаратів. Для кожного ряду дослідних пробірок визначали першу концентрацію, при якій спостерігалась відсутність видимого росту мікроорганізмів. Дану концентрацію позначали як мінімальну інгібуючу (пригнічуючу, бактеріостатичну) концентрацію (МІС) відповідного препарату по відношенню до досліджуваного виду мікроорганізмів. Наступним етапом досліджень було визначення мінімальних бактерицидних концентрацій препаратів. Для цього із усіх дослідних зразків з відсутністю видимого росту, а також із усіх контрольних пробірок здійснювали висів 200 мл відповідних суспензій на чашки із щільним середовищем LB. Після рівномірного розподілення кожної із суспензій по поверхні агару і його підсихання чашки інкубували при 37 °C протягом 24 год. в термостаті. В подальшому на щільному середовищі підраховували утворені колонії, які вказували на кількість життєздатних мікроорганізмів у відповідних бактеріальних суспензіях. Даний показник виражали у колонієутворюючих одиницях (КУО). Мінімальну бактерицидну (фунгіцидну) концентрацію відповідного препарату по відношенню до досліджуваних видів мікроорганізмів визначали за першою концентрацією, при якій із внесених на щільне середовище аліквот бактеріальних суспензій виявлявся ріст менше 200 КУО. Вказані показники для S. aureus, Е. соlі та P. aeruginosa позначали як МВС (мінімальна бактерицидна концентрація), а для С. albicans - як MFC (мінімальна фунгіцидна концентрація). У висівах із позитивних і негативних контролів росту оцінювали наявність газонів зливного росту, а з негативних контролів середовища і чистоти препаратів (із зразків з максимальними концентраціями препарату) - відсутність росту мікроорганізмів. При дотриманні зазначених умов для контрольних зразків проведений експеримент розглядали як поставлений коректно. Описані дослідження повторювали двократно, отримані результати піддавали статистичній обробці (див. таблицю). Таблиця Результати експериментальної перевірки активності нанокомпозиту "високодисперсного кремнезему-кластерів срібла" по відношенню до досліджуваних мікроорганізмів Видова належність досліджуваних мікроорганізмів Staphylococcus aureus УКМ В-904 Escherichia coli УКМ В-906 Candida albicans УКМ Y-1918 Мінімальна інгібуюча концентрація МІС (мкг/мл) Мінімальна бактерицидна/фунгіцидна концентрація MBC/MFC (мкг/мл) перерахунок на препарату чисте срібло препарату перерахунок на чисте срібло 330 25 2630 200 330 25 660 50 660 50 2630 200 2 UA 68913 U Продовження таблиці Видова належність досліджуваних мікроорганізмів Pseudomonas aeruginosa УКМ В-900 5 10 15 20 Мінімальна інгібуюча концентрація МІС (мкг/мл) препарату перерахунок на чисте срібло 2630 Мінімальна бактерицидна/фунгіцидна концентрація MBC/MFC (мкг/мл) перерахунок на препарату чисте срібло 200 5260 400 Отримані дані про вплив нанокампозиту "високодисперсний кремнезем-кластери срібла" на тестові штамами мікроорганізмів для визначення антимікробної дії лікарських засобів (Staphylococcus aureus УКМ В-904 (АТСС 25923), Escherichia coli УКМ В-906 (АТСС 25922), Candida albicans УКМ Y-1918 (АТСС 885-653), Pseudomonas aeruginosa УКМ В-900 (АТСС 9027)), стверджувати наявність протимікробних властивостей препарату. Таким чином, можна стверджувати, що нанокампозит високодисперсного кремнезему кластерів срібла має протимікробні властивості. Джерела інформації: 1. Prins, J.M. Clinical relevance of antibiotic induced endotoxin release / J. M. Prins, S.J. van Deventer, E.J. Kuijper et al. // Antimicrob Agents Chemother.-1994-38-P. 1211-1218. 2. Березняков И.Г. Инфекции и антибиотики / Березняков И.Г. // Харьков: Константа, 2004.447 с. 3. Фещенко Ю.І. Антибіотикорезистентність мікроорганізмів. Стан проблеми та шляхи її вирішення / Фещенко Ю.І., Гуменюк М.І., Денисов О. С. // Український хіміотерапевтичний журнал.-2010. - №1-2 (23). – С. 4-10. 4. Носач Л.В., Савченко Д.С., Власенко О.М. Одержання і характеризація кластерів срібла на поверхні нанодисперсного кремнезему // Український науковий-медичний молодіжний журн. Київ, 2011. - №4. – С. 178. 5. Савченко Д.С. Розробка матриці-носія для наночастинок срібла // Український науковиймедичний молодіжний журн. - Київ, 2011. - №2. – С. 289-290. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 25 Застосування нанокомпозиту високодисперсного протимікробного лікарського засобу. кремнезему та кластерів срібла Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3 як