Антитіла проти ангіопоетину-2 людини

Реферат: Винахід стосується антитіла, що специфічно зв'язується з ангіопоетином-2 (ANG-2) людини, фармацевтичної композиції, що містить зазначене антитіло, та його застосування. UA 103912 C2 (12) UA 103912 C2 UA 103912 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід відноситься до антитіл проти ангіопоетину-2 людини (анти-ANG-2 антитілам), способів їх одержання, фармацевтичних композицій зазначених антитіл та до їх застосування. Передумови створення винаходу Ангіогенез бере участь у патогенезі різних розладів, до яких відносяться солідні пухлини, синдроми внутрішньоочної реваскуляризації, наприклад, проліферативні ретинопатії або вікова дегенерація жовтої плями (ВДЖП), ревматоїдний артрит та псоріаз (Folkman J. та інш., J. Biol. Chem. 267, 1992, сс. 10931-10934; Klagsbrun M. та інш., Annu. Rev. Physiol. 53, 1991, сс. 217-239; Garner A. у кн.: «Pathobiology of ocular disease, A dynamic approach», 1994, під ред. Garner A. та Klintworth G. K., 2-е вид., вид-во Marcel Dekker, Нью-Йорк, сс. 1625-1710). У випадку солідних пухлин реваскуляризація створює перевагу росту та проліферації для пухлинних кліток, у порівнянні з нормальними клітками. Тому спостерігають кореляцію між щільністю мікросудин на зрізах пухлин та виживанням пацієнтів при раку грудей, а також при деяких інших формах пухлин (Weidner N. та інш., N. Engl. J. Med. 324, 1991, сс. 1-8; Horak E.R. та інш., Lancet 340, 1992, сс. 1120-1124; Macchiarini P. та інш., Lancet 340, 1992, сс. 145-146). ANG-2 та анти-ANG-2 антитіла Ангіопоетин-2 людини (Human angiopoietin-2, що позначається абревіатурами ANG-2, або ANGPT2, або ANG2) (SEQ ID No: 107) описаний Maisonpierre P.C. та інш., Science 277, 1997, сс. 55-60, Cheung A.H. та інш., Genomics 48, 1998, сс. 389-391. Ангіопоетин-1 та ангіопоетин-2 (ANG-1(SEQ ID No: 108) та ANG-2 (SEQ ID No: 107)) описані в якості лігандів для представників сімейства тирозинкіназ Tie, які селективно експресуються в ендотелії судин. Yancopoulos G.D., та інш., Nature 407, 2000, сс. 242-248. У цей час відомо чотири представника сімейства ангіопоетину. Ангіопоетин-3 та ангіопоетин-4 (ANG-3 та ANG-4) можуть представляти в значній мірі диверговані варіанти одного й того ж генного локусу в миші та в людини. Kim I. та інш., FEBS Let, 443, 1999, сс. 353-356; Kim I. та інш., J Biol Chem 274, 1999, сс. 26523-26528. Спочатку ANG-1 та ANG-2 були ідентифіковані в експериментах з культурами тканин у якості агоніста та антагоніста, відповідно (див. у відношенні ANG-1: Davies S. та інш., Cell, 87, 1996, сс. 1161-1169; та у відношенні ANG-2: Maisonpierre P.C. та інш., Science 277, 1997, сс. 55-60). Усі відомі ангіопоетини зв'язуються в основному з Tie2, та обидва, ANG-1 та -2, зв'язуються з Tie2 зі спорідненістю 3 нМ (Kd). Maisonpierre P.C., та інш., Science 277, 1997, сс. 55-60. Показано, що ANG-1 підтримує виживання клітин ендотелію та індукує цілісність ендотелію, Davis S. та інш., Cell, 87, 1996, сс. 1161-1169; Kwak H.J. та інш., FEBS Lett 448, 1999, сс. 249-253; Suri C. та інш., Science 282, 1998, сс. 468-471; Thurston G. та інш., Science 286, 1999, сс. 2511-2514; Thurston G. та інш., Nat. Med. 6, 2000, сс. 460-463, причому ANG-2 має протилежний ефект та індукує дестабілізацію кровоносних судин та їх регресію у відсутності факторів виживання VEGF або основного фактору росту фібробластів. Maisonpierre P.C. та інш., Science 277, 1997, сс. 55-60. Однак, у багатьох дослідженнях функції ANG-2 показано, що положення є більш складним. ANG-2 може бути складним регулятором ремоделювання судин, яке відіграє роль як в поширенні судин, так і в регресії судин. Підтверджуючи таку роль для ANG-2, дослідження експресії показало, що ANG-2 швидко індукується разом з VEGF у дорослих при поширенні судин при ангіогенезі, хоча ANG-2 індукується у відсутності VEGF при регресії судин. Holash J. та інш., Science 284, 1999, сс. 1994-1998; Holash J. та інш., Oncogene 18, 1999, сс. 5356-5362. Відповідаючи контекстно-залежній ролі, ANG-2 переважно зв'язує з тим же специфічним для ендотелію рецептором, Tie-2, який активується ANG-1, але виявляє контекстно-залежний вплив на його активування. Maisonpierre P.C. та інш., Science 277, 1997, сс. 55-60. Дослідження ангіогенезу рогівки показали, що як ANG-1, так і ANG-2 мають подібні ефекти, взаємодіючи синергічно з VEGF для індукції росту нових кровоносних судин. Asahara T. та інш., Circ. Res., 83, 1998, сс. 233-240. Імовірність наявності доза-залежної відповіді ендотелію підвищується у зв'язку зі спостереженням того, що in vitro у високій концентрації ANG-2 також може бути проангіогенним. Kim I. та інш., Oncogene 19, 2000, сс. 4549-4552. У високій концентрації ANG-2 діє в якості апоптозного фактору виживання для клітин ендотелію під час сироваткового деприваційного апоптозу через активування Tie2 через PI-3 кіназу та метаболічний шлях Akt. Kim I. та інш., Oncogene 19, 2000, сс. 4549-4552. Крім того, за результатами експериментів in vitro був зроблений висновок про те, що при тривалому впливі ефекти ANG-2 можуть поступово зсуватись від ефекту антагоніста до агоніста Tie2, та пізніше можуть безпосередньо брати участь у формуванні судинних трубок та стабілізації нових судин. Teichert-Kuliszewska K. та інш., Cardiovasc. Res. 49, 2001, сс. 659-670. Крім того, якщо клітини ендотелію культивують на фібриновому гелі, також спостерігають активування Tie2 за рахунок ANG-2, що припустимо означає, що дія ANG-2 може залежати від стану диференціації клітин ендотелію. Teichert-Kuliszewska K. та інш., Cardiovasc. Res. 49, 2001, сс. 659-670. У клітинах ендотелію мікросудин, що культивуються у тривимірному гелі, ANG-2 1 UA 103912 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 також може індукувати активування Tie2 та формування структур типу капілярів. Mochizuki Y. та інш., J. Cell. Sci. 115, 2002, сс. 175-183. Застосування тривимірного сферичного спільного культивування як моделі дозрівання судин in vitro, показує, що прямий контакт між клітинами ендотелію та клітинами мезенхіми анулює здатність до реагування на VEGF, хоча наявність VEGF та ANG-2 індукує поширення судин. Korff T. та інш., Faseb J. 15, 2001, сс. 447-457. Etoh T.H. та інш. показали, що в клітин ендотелію, які конститутивно експресують Tie2, регуляція експресії MMP-1, -9 та u-Pa сильно підвищується за рахунок ANG-2 у присутності VEGF. Etoh T. та інш., Cancer Res. 61, 2001, сс. 2145-2153. На моделі зіничної мембрани in vivo Lobov I.B. та інш. показали, що ANG-2 у присутності ендогенного VEGF індукує швидке підвищення діаметру капілярів, ремоделюючи базальну пластинку, проліферацію та міграцію клітин ендотелію, та стимулює поширення нових кровоносних судин. Lobov I.B. та інш., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 2002, сс. 11205-11210. Навпроти, ANG-2 індукує загибель клітин ендотелію та регресію судин без ендогенного VEGF. Lobov I.B. та інш., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 2002, сс. 11205-11210. Подібним образом на моделі пухлини in vivo Vajkoczy P. та інш. показали, що багатоклітинні агрегати ініціюють ріст судин за рахунок ангіогенного проростання за допомогою одночасної експресії VEGFR-2 та ANG-2 організмом хазяїна та ендотелієм пухлини. Vajkoczy P. та інш., J. Clin. Invest. 109, 2002, сс. 777-785. Ця модель показує, що сформована мікросудинна мережа пухлин, що ростуть, відрізняється постійним ремоделюванням, припустимо опосередкованим експресією VEGF та ANG-2. Vajkoczy M.A. та інш., J Clin. Invest. 09, 2002, сс. 777-785. Дослідження Tie-2 та ангіопоетину-1 на моделі нокаутних мишей показують подібні фенотипи та підтверджують, що фосфолювання Tie-2 після стимуляції ангіопоетином-1 опосередковує ремоделювання та стабілізацію судин, що формуються, стимулюючи повний розвиток кровоносних судин під час ангіогенезу та підтримку адгезії клітин, що підтримують клітини ендотелію (Dumont J. та інш., Genes & Development, 8, 1994, сс. 1897-1909; Sato T.N., Nature, 376, 1995, сс. 70-74; Thurston G. та інш., Nature Medicine, 6, 2000, сс. 460-463). Припустимо роль ангіопоетину-1 зберігається у дорослих, у яких він експресується в різних місцях та конститутивно (Hanahan D., Science, 277, 1997, сс. 48-50; Zagzag D. та інш., Exp Neurology, 159, 1999, сс. 391-400). Навпроти, експресія ангіопоетину-2 в основному обмежується сайтами судинного ремоделювання, у яких ангіопоетин-2 припустимо блокує конститутивну стабілізацію або функцію дозрівання ангіопоетину-1, дозволяючи судинам ревертувати та зберегтися, пластичний стан яких може бути більшою мірою таким, що відповідає на сигнали, що поширюються (Hanahan D., 1997; Holash J. та інш., Orzcogerze 18, 199, сс. 5356-5362; Maisonpierre P.C., 1997). При експресії ангіопоетину-2 при патологічному ангіогенезі встановлено, що багато типів пухлин експресують ангіопоетин-2 (Maisonpierre P.C. та інш., Science 277, 1997, сс. 55-60). Функціональні дослідження показали, що ангіопоетин-2 залучений у пухлинний ангіогенез, та встановили асоціацію надекспресії ангіопоетину-2 з підвищеним ростом пухлин на моделі ксенотрансплантата в мишей (Ahmad S.A. та інш., Cancer Res., 61, 2001, сс. 1255-1259). В інших дослідженнях пов'язують надекспресію ангіопоетину-2 з гіперваскуляризацією пухлини (Etoh T. та інш., Cancer Res. 61, 2001, сс. 2145-2153; Tanaka F. та інш., Cancer Res. 62, 2002, сс. 7124-7129). Останнім часом було запропоновано використовувати ангіопоетин-1, ангіопоетин-2 та/або Tie-2 у якості можливих мішеней у терапії пухлин. Наприклад, в US 6166185, US 5650490 та US 5814464 описані анти-Tie-2 ліганд та рецепторні антитіла. Дослідження із застосуванням розчинного Tie-2 були описані для зниження числа та розміру пухлин у гризунів (Lin, 1997; Lin, 1998). Siemeister G. та інш., Cancer Res. 59, 1999, сс. 3185-3191, одержали лінії клітин меланоми людини, експресуючих позаклітинний домен від Tie-2, ввели їх ін'єкцію голим мишам та описали розчинний Tie-2 для одержання істотного пригнічення росту пухлини та пухлинного ангіогенезу. Обидва розглянутих разом агента, ангіопоетин-1 та ангіопоетин-2, зв'язуються з Tie-2, та із цих досліджень не ясно, чи є ангіопоетин-1, ангіопоетин-2 або Tie-2 привабливою мішенню для протипухлинної терапії. Однак, ефективна терапія проти ангіопоетину-2 припустимо корисна в лікуванні захворювань, наприклад, раку, при якому прогресування залежить від аберрантного ангіогенезу, при якому процес, що блокується, може привести до попередження прогресування захворювання (Follunan J., Nature Medicine. 1, 1995, сс. 27-31). Крім того, деякі групи дослідників повідомляють про застосування антитіл та пептидів, які зв'язуються з ангіопоетином-2. Див., наприклад, US 6166185 та US 2003/10124129. WO 03/030833, WO 2006/068953, WO 03/057134 або US 2006/0122370. Дослідження впливу осередкової експресії ангіопоетину-2 показало, що протидіючий ангіопоетин 1/Tie-2 сигнал послабляє щільну судинну структуру, тим самим, піддаючи впливу клітини ендотелію для активації сигналів від індукторів ангіогенезу, наприклад, VEGF (Hanahan, 2 UA 103912 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 1997). Такий проангіогенний ефект, що виникає із пригнічення ангіопоетину-1, показує, що терапія проти ангіопоетину-1 може бути ефективним протираковим лікуванням. ANG-2 експресується в ході розвитку в тих місцях, де відбувається ремоделювання кровоносних судин. Maisonpierre P.C. та інш., Science 277, 1997, сс. 55-60. У дорослих індивідуумів експресія ANG-2 обмежена місцями ремоделювання судин, а також пухлинами з високим ступенем васкуляризації пухлин, включаючи гліому, Osada H. та інш., Int. J. Oncol. 18, 2001, сс. 305-309; Koga K. та інш., Cancer Res. 61, 2001, сс. 6248-6254, гепатоклітинну карциному, Tanaka S. та інш., J. Clin. Invest. 103, 1999, сс. 341-345, рак шлунку, Etoh T. та інш., Cancer Res. 61, 2001, сс. 2145-2153; Lee J.H. та ін, Int. J. Oncol. 18, 2001, сс. 355-361, пухлину щитовидки, Bunone G. та інш., Am J Pathol 155, 1999, сс. 1967-1976, недрібноклітинний рак легенів, Wong M.P. та інш., Lung Cancer 29, 2000, сс. 11-22, рак товстої кишки, Ahmad S.A. та інш., Cancer 92, 2001, сс. 1138-43, та рак простати Wurmbach J.H. та інш., Anticancer Res. 20, 2000, сс. 5217-5220. Встановлено, що деякі ракові клітини експресують ANG-2. Наприклад, Tanaka S. та інш., J. Clin. Invest. 103, 1999, сс. 341-345 виявили іРНК ANG-2 в 10 з 12 зразків гепатоклітинної карциноми людини (ГКЛ). Група Ellis повідомляє, що ANG-2 експресується повсюдно в пухлинному епітелії. Ahmad S.A. та інш., Cancer 92, 2001, сс. 1138-1143. Інші дослідники повідомляють про подібні результати. Chen L. та інш., J. Tongji Med. Univ. 21, 2001, сс. 228-235. Шляхом виявлення рівнів іРНК ANG-2 у зібраних зразках раку грудей людини, Sfilogoi C. та інш., Int. J. Cancer 103, 2003, сс. 466-474 встановили, що іРНК ANG-2 у значній мірі асоційована з інвазією допоміжних лімфовузлів, коротким періодом відсутності захворювання та у цілому поганим виживанням. Tanaka F. та інш., Cancer Res. 62, 2002, сс. 7124-7129, проаналізували в цілому 236 пацієнтів з недрібноклітинним раком легенів (НДКРЛ) на стадіях розвитку захворювання з I по IIIA, відповідно. За допомогою імуногістохімії вони встановили, що 16,9 % пацієнтів із НДКРЛ є ANG-2-позитивними. Щільність мікросудин в ANG-2-позитивній пухлині є суттєво вищою, чим в ANG-2-негативній пухлині. Такий ангіогенний ефект ANG-2 спостерігають тільки якщо присутня висока експресія VEGF. Крім того, позитивна експресія ANG-2 є істотним чинником для прогнозу поганого післяопераційного виживання. Tanaka F. та інш., Cancer Res. 62, 2002, сс. 7124-7129. Однак ними було встановлено, що немає істотної кореляції між експресією ANG-1 та щільністю мікросудин. Tanaka F. та інш., Cancer Res. 62, 2002, сс. 7124-7129. Ці результати підтверджують, що ANG-2 є індикатором поганого прогнозу в пацієнтів з деякими типами раку. Раніше, використовуючи модель нокаутних мишей ANG-2, група дослідників під керівництвом Yancopoulos встановила, що ANG-2 необхідний для постнатального ангіогенезу. Gale N.W. та інш., Dev. Cell 3, 2002, сс. 411-423. Вони показали, що запрограмована в ході розвитку регресія судинної мережі в склоподібному тілі ока не відбувається в нокаутних ANG-2 мишей та їх кровоносні судини в сітківці не можуть поширюватись від центральної артерії сітківки. Gale N.W. та інш., Dev. Cell 3, 2002, сс. 411-423. Ними також було показано, що делеція ANG-2 приводить до виражених дефектів у розташуванні та функціонуванні системи лімфатичних судин. Gale N.W. та інш., Dev. Cell 3, 2002, сс. 411-423. Генетичний ризик з ANG-1 коректує лімфатичні, але не ангіогенні дефекти. Gale N.W. та інш., Dev. Cell 3, 2002, сс. 411-423. Peters та співавтори повідомляють, що розчинний Tie2, при доставці або в якості рекомбінантного білка, або у вірусному векторі експресії, пригнічує ріст in vivo карциноми раку грудей та меланоми гризунів у модельних мишей. Lin P. та інш., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 1998, сс. 8829-8834; Lin P. та інш., J. Clin. Invest. 100, 1997, сс. 2072-2078. Щільність судин у тканинах пухлин, оброблених таким чином, суттєво знижена. Крім того, розчинний Tie2 блокує ангіогенез в рогівці пацюка після стимуляції відповідними середовищами для пухлинних клітин. Lin P. та інш., J. Clin. Invest. 100, 1997, 2072-2078. Крім того, Isner зі співробітниками показали, що додавання ANG-2 до VEGF індукує суттєво більш довгу та більш сферичну мережу судин, що знову утворюються, ніж тільки один VEGF. Asahara T. та інш., Circ. Res., 83, 1998, сс. 233240. Надлишок розчинного рецептору Tie2 запобігає модулюванню під дією ANG-2 реваскуляризації, індукованої VEGF. Asahara T. та інш., Circ. Res. 83, 1998, сс. 233-240. Siemeister G. та інш., Cancer Res. 59,1999, сс. 3185-3191, показали на голих мишах із ксенотрансплантатами, що надекспресія позаклітинних з’єднуючих ліганди доменів, або Flt-1, або Tie2, у ксенотрансплантатів, що приводить до істотного пригнічення метаболічного шляху, не може бути компенсована надекспресією іншого зазначеного домену, отже, метаболічний шлях рецептора VEGF та метаболічний шлях Tie2 не слід розглядати в якості двох незалежних медіаторів, що мають істотне значення для процесу ангіогенезу in vivo. Siemeister G. та інш., Cancer Res. 59, 1999, сс. 3185-3191. Це було доведено в попередній публікації White R.R. та інш., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 2003, сс. 5028-5033. У цьому дослідженні показано, що стійкий до нуклеази аптамер РНК, який специфічно зв'язується та пригнічує ANG-2, суттєво 3 UA 103912 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 пригнічує реваскуляризацію, індуковану bFGF, на моделі ангіогенезу в мікрокишені рогівки пацюка. Короткий опис винаходу Даний винахід представляє специфічне зв'язування з ангіопоетином-2 людини (ANG-2) антитіла, що відрізняється включенням у якості області CDR3 варіабельного домену важкого ланцюга послідовностей SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 41 або SEQ ID NO: 49. Переважно антитіло відрізняється тим, що a) варіабельний домен важкого ланцюга включає область CDR3 послідовності SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 41 або SEQ ID NO: 49, область CDR2 послідовності SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 42 або SEQ ID NO: 50, та область CDR1 послідовності SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 43 або SEQ ID NO: 51, і б) варіабельний домен легкого ланцюга включає область CDR3 послідовності SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 44 або SEQ ID NO: 52, область CDR2 послідовності SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 45 або SEQ ID NO: 53, та область CDR1 послідовності SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 46 або SEQ ID NO: 54. Переважно антитіло відрізняється тим, що включає a) варіабельний домен важкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 47 або SEQ ID NO: 55; та б) варіабельний домен легкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 48 або SEQ ID NO: 56. Переважно антитіло відрізняється тим, що не зв'язується специфічно з ангіопоетином-1 (ANG-1). Іншим варіантом здійснення цього винаходу є фармацевтична композиція, що включає антитіло за цим винаходом. Іншим варіантом здійснення цього винаходу є застосування антитіла за цим винаходом для одержання фармацевтичної композиції. Іншим варіантом здійснення цього винаходу є застосування антитіла за цим винаходом для попередження метастазування. Іншим варіантом здійснення цього винаходу є застосування антитіла за цим винаходом для лікування раку. Іншим варіантом здійснення цього винаходу є застосування антитіла за цим винаходом для лікування судинних захворювань. Іншим варіантом здійснення цього винаходу є застосування антитіла за цим винаходом для лікування ретинопатії. Іншим варіантом здійснення цього винаходу є нуклеїнова кислота, що кодує варіабельний домен важкого ланцюга та/або варіабельний домен легкого ланцюга антитіла за цим винаходом. Даний винахід додатково передбачає вектори експресії, що містять нуклеїнову кислоту за цим винаходом, здатні експресувати зазначену нуклеїнову кислоту в прокаріотичних або еукаріотичних клітинах-хазяїнах, що містять такі вектори, для рекомбінантного одержання такого антитіла. Даний винахід додатково передбачає прокаріотичні або еукаріотичні клітини-хазяї за цим винаходом. Даний винахід додатково передбачає спосіб вироблення рекомбінантного антитіла людини або гуманізованого антитіла за цим винаходом, що відрізняється експресією нуклеїнової кислоти за цим винаходом в прокаріотичних або еукаріотичних клітинах-хазяїнах та виділенням зазначеного антитіла із зазначених клітин або супернатанту культури клітин. Даний винахід також включає антитіло, що одержують таким рекомбінантним способом. Антитіла за цим винаходом є особливо застосовними для попередження вторинних пухлин/метастаз або для лікування судинних захворювань, наприклад, ретинопатії. Докладний опис винаходу Даний винахід представляє антитіло, що специфічно зв'язується з ангіопоетином-2 (ANG-2) людини, що відрізняється тим, що включає в якості варіабельного домену важкого ланцюга область CDR3 послідовності SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 41 або SEQ ID NO: 49. 4 UA 103912 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В одному з варіантів здійснення цього винаходу антитіло відрізняється тим, що а) варіабельний домен важкого ланцюга включає область CDR3 послідовності SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 41 або SEQ ID NO: 49, область CDR2 послідовності SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 42 або SEQ ID NO: 50, та область CDR1 послідовності SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 43 або SEQ ID NO: 51, і б) варіабельний домен легкого ланцюга включає область CDR3 послідовності SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 44 або SEQ ID NO: 52, область CDR2 послідовності SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 45 або SEQ ID NO: 53, та область CDR1 послідовності SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 46 або SEQ ID NO: 54. Переважно антитіло відрізняється включенням a) послідовностей варіабельного домену важкого ланцюга SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 47 або SEQ ID NO: 55; та б) послідовностей варіабельного домену легкого ланцюга SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 48 або SEQ ID NO: 56. Іншим варіантом здійснення цього винаходу є антитіло, що специфічно зв'язується з ANG-2 людини, яке відрізняється тим, що антитіло не зв'язується специфічно з ангіопоетином-1 людини (ANG-1). Типовими антитілами, що специфічно зв'язуються з ANG-2 людини, але не зв'язуються з ANG-1 людини, є, наприклад, Ang2s_R3_LC03, Ang2s_LC09, Ang2i_LC06, Ang2i_LC07 або антитіла, що зв'язуються з тим же епітопом, що і Ang2s_R3_LC03, Ang2s_LC09, Ang2i_LC06, Ang2i_LC07, Ang2i_LC10, переважно, що зв'язуються з тим же епітопом, що і Ang2i_LC06. Тому в одному з варіантів здійснення цього винаходу антитіло, що специфічно зв'язується з ангіопоетином-2 людини (ANG-2), але не з ANG-1 людини, зв'язується з тим же епітопом, що і Ang2s_R3_LC03, Ang2s_LC09, Ang2i_LC06, Ang2i_LC07, Ang2i_LC10, переважно з тим же епітопом, що і Ang2i_LC06. Такі антитіла, що специфічно зв'язуються з ANG-2, але не з ANG-1, можуть мати покращені властивості, наприклад, покращену ефективність, знижену токсичність, покращені фармакокінетичні властивості, у порівнянні з антитілами, специфічними у відношенні ANG-2 та ANG-1. Таким чином, в одному з варіантів здійснення цього винаходу антитіло, що специфічно зв'язуються з ангіопоетином-2 (ANG-2) людини, але не з ANG-1 людини, відрізняється тим, що a) варіабельний домен важкого ланцюга включає область CDR3 послідовності SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 33 або SEQ ID NO: 49, область CDR2 послідовності SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 34 або SEQ ID NO: 50, та область CDR1 послідовності SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 35 або SEQ ID NO: 51, і б) варіабельний домен легкого ланцюга включає область CDR3 послідовності SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 36 або SEQ ID NO: 52, область CDR2 послідовності SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 37 або SEQ ID NO: 53, та область CDR1 послідовності SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 38 або SEQ ID NO: 54. Переважно таке антитіло, що специфічно зв'язується з ангіопоетином-2 людини (ANG-2), але не з ANG-1 людини, відрізняється тим, що включає a) варіабельний домен важкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 39 або SEQ ID NO: 55; та б) варіабельний домен легкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 40 або SEQ ID NO: 56. В одному з варіантів здійснення цього винаходу зазначене антитіло за цим винаходом відрізняється тим, що a) варіабельний домен важкого ланцюга включає область CDR3 послідовності SEQ ID NO: 1 або SEQ ID NO: 9, область CDR2 послідовності SEQ ID NO: 2 або SEQ ID NO: 10, та область CDR1 послідовності SEQ ID NO: 3 або SEQ ID NO: 11, і б) варіабельний домен легкого ланцюга включає область CDR3 послідовності SEQ ID NO: 4 або SEQ ID NO: 12, область CDR2 послідовності SEQ ID NO: 5, або SEQ ID NO: 13, та область CDR1 послідовності SEQ ID NO: 6 або SEQ ID NO: 14. В одному з варіантів здійснення цього винаходу зазначене антитіло за цим винаходом відрізняється тим, що включає a) варіабельний домен важкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 7 або SEQ ID NO: 15; та 5 UA 103912 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 б) варіабельний домен легкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 8 або SEQ ID NO: 16. В одному з варіантів здійснення цього винаходу зазначене антитіло за цим винаходом відрізняється тим, що a) варіабельний домен важкого ланцюга включає область CDR3 послідовності SEQ ID NO: 1, область CDR2 послідовності SEQ ID NO: 2 та область CDR1 послідовності SEQ ID NO: 3, і б) варіабельний домен легкого ланцюга включає область CDR3 послідовності SEQ ID NO: 4, область CDR2 послідовності SEQ ID NO: 5 та область CDR1 послідовності SEQ ID NO: 6. В одному з варіантів здійснення цього винаходу зазначене антитіло за цим винаходом відрізняється тим, що включає a) варіабельний домен важкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 7; та б) варіабельний домен легкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 8. В одному з варіантів здійснення цього винаходу зазначене антитіло за цим винаходом відрізняється тим, що a) варіабельний домен важкого ланцюга включає область CDR3 послідовності SEQ ID NO: 17, область CDR2 послідовності SEQ ID NO: 18, та область CDR1 послідовності SEQ ID NO: 19, і б) варіабельний домен легкого ланцюга включає область CDR3 послідовності SEQ ID NO: 20, область CDR2 послідовності SEQ ID NO: 21 та область CDR1 послідовності SEQ ID NO: 22. В одному з варіантів здійснення цього винаходу зазначене антитіло за цим винаходом відрізняється тим, що включає a) варіабельний домен важкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 23; та б) варіабельний домен легкого ланцюга SEQ ID NO: 24. Переважно антитіло за цим винаходом відрізняється тим, що зазначене антитіло є антитілом підкласу IgG1 людини або антитілом підкласу IgG4 людини. Поняття «антитіло» охоплює різні форми структур антитіл, включаючи, але не обмежуючись ними, цілі антитіла та фрагменти антитіл, антитіло за цим винаходом переважно є гуманізованим антитілом, химерним антитілом або додатково генетично сконструйованим антитілом, змінюваним доти, поки воно зберігає відмітні властивості за цим винаходом. Поняття «фрагменти антитіл» включає частину антитіла повної довжини, переважно його варіабельного домену, або, щонайменше, його сайт зв'язування антигену. Прикладами фрагментів антитіла є димерні антитіла, молекули одноланцюгових антитіл (single-chain antibody molecules – scFv або scFab), та поліспецифічні антитіла (наприклад, біспецифічні), сформовані із фрагментів антитіл. Антитілами scFv є, наприклад, антитіла, описані Houston J.S., Methods in Enzymol. 203, 1991, сс. 46-88. Крім того, фрагменти антитіл включають одноланцюгові поліпептиди, що мають властивості домену VH, а саме здатність об’єднуватись разом з доменом VL, або доменом VL, що зв'язуються з ANG-2, а саме об’єднуватись разом з доменом VH до функціонального сайту зв'язування антигену, та тим самим забезпечувати певну властивість. Антитіла scFv можуть бути стабілізовані, використовуючи, наприклад, a) дисульфідну стабілізацію (див., наприклад, WO 94/029350; Rajagopal V. та інш., Prot. Engin. 1997, сс. 1453-1459; Kobayashi H. та інш., Nuclear Medicine & Biology, 25, 1998, сс. 387-393; або Schmidt M. та інш., Oncogene 18, 1999, сс. 1711-1721) або б) стабілізовані каркасні ділянки (наприклад, за рахунок специфічних мутацій, див., наприклад, WO 2007/109254, про специфічні стабілізовані каркасні ділянки див., наприклад, US 7258985, Furrer F. та інш., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 2009, сс. 771–778, або Ottiger M. та інш., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 2009, сс. 779–786). Поняття «моноклональне антитіло» або «композиція моноклонального антитіла», що застосовуються в даному винаході, відносяться до препарату молекул антитіл однієї амінокислотної композиції. Поняття «химерне антитіло» відноситься до антитіла, що включає варіабельну область, тобто зв’язуючу область з одного джерела або від одного виду та, щонайменше, частину константної області, похідної від іншого джерела або виду, звичайно одержаного методами рекомбінації ДНК. Химерні антитіла, що включають варіабельну область гризуна та константну область людини, є переважними. До інших переважних форм «химерних антитіл», що відносяться до цього винаходу, відносяться ті, у яких константна область була модифікована або змінена, в порівнянні з вихідним антитілом, для одержання властивостей за цим винаходом, особливо у зв'язку зі зв'язуванням C1q та/або зв'язуванням рецептора Fc (FcR). Такі химерні антитіла також відносять до «класу антитіл-перемикачів». Химерні антитіла є продуктом експресії генів імуноглобуліну, що включають сегменти ДНК, які кодують варіабельні області імуноглобуліну, та сегменти ДНК, які кодують константні області імуноглобуліну. Способи одержання химерних антитіл включають звичайну рекомбінацію ДНК та методи генної 6 UA 103912 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 трансфекції, відомі в даній області. Див., наприклад, Morrison S.L. та інш., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1984, сс. 6851-6855; US 5202238 та US 5204244. Поняття «гуманізоване антитіло» відноситься до антитіл, у яких каркасна ділянка або «області, що комплементарно детермінуються (complementarity determining regions – CDR)» модифіковані для включення CDR імуноглобуліну іншої специфічності, в порівнянні з вихідним імуноглобуліном. У переважному варіанті здійснення цього винаходу CDR гризуна пересаджена в область каркасної ділянки антитіла людини для одержання «гуманізованого антитіла». Див., наприклад, Riechmann L. та інш., Nature 332, 1988, сс. 323-327; Neuberger M.S. та інш., Nature 314, 1985, сс. 268-270. Особливо переважні області CDR відповідають областям, що представляють послідовності, які розпізнають антигени, зазначені вище, для химерних антитіл. До інших форм «гуманізованого антитіла» у даному винаході відносяться ті форми, у яких константна область додатково модифікована або змінена в порівнянні з вихідним антитілом для одержання властивостей за цим винаходом, особливо у зв'язку зі зв'язуванням C1q та/або зі зв'язуванням з рецептором Fc (FcR). Поняття «антитіла людини» у контексті цього винаходу означає антитіла з варіабельними та константними областями, отриманими із послідовностей імуноглобулінів зародкових ліній людини. Антитіла людини відомі в даній області (van Dijk M.A., van de Winkel J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5, 2001, сс. 368-374). Антитіла людини також можуть бути одержані у трансгенних тварин (наприклад, мишей), які можуть при імунізації виробляти повний спектр або вибіркові антитіла людини під час відсутності вироблення ендогенного імуноглобуліну. Перенос генних послідовностей імуноглобуліну зародкової лінії людини в зародкові лінії таких мутантних мишей може привести до вироблення антитіл людини при наявності антигенного стимулу (див., наприклад, Jakobovits A. та інш., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1993, сс. 2551-2555; Jakobovits A. та інш., Nature 362, 1993, сс. 255-258; Brueggemann M. та інш., Year Immunol. 7, 1993, сс. 33-40). Антитіла людини також можуть бути одержані за допомогою бібліотек фагового дисплею (Hoogenboom H.R. та Winter G., J. Mol. Biol. 227, 1992, сс. 381-388; Marks J.D. та інш., J. Mol. Biol. 222, 1991, сс. 581-597). Методи Cole S.P.C. та інш. та Boerner та інш. також можуть застосовуватись для одержання моноклональних антитіл людини (Cole S.P.C. та інш., Monoclonal Antibodies та Cancer Therapy, Liss, A.R., 1985, сс. 77-96; та Boerner P. та інш., J. Immunol. 147, 1991, сс. 86-95). Для химерних та гуманізованих антитіл за цим винаходом уже згадувалось, що поняття «антитіло людини», що використовується в даному винаході, також включає антитіла, які модифіковані в константній області для вироблення властивостей за цим винаходом, особливо у зв'язку зі зв'язуванням з C1q та/або зі зв'язуванням з FcR, наприклад, шляхом «перемикання класу», тобто зміну або мутацію частин Fc (наприклад, із IgG1 на IgG4 та/або мутація IgG1/IgG4.) Поняття «рекомбінантне антитіло людини» у контексті цього винаходу означає всі антитіла людини, які одержані, експресовані, створені або виділені методами рекомбінації, наприклад, антитіла, виділені із клітин-хазяїв, наприклад, клітин NS0 або CHO, або із тварин (наприклад, мишей), які трансгенні за генами імуноглобулінів людини, або експресовані антитіла, одержані із застосуванням рекомбінантного вектора експресії, трансфіковані в клітину-хазяїна. Такі рекомбінантні антитіла людини містять варіабельні та константні області в знову зібраній формі. Рекомбінантні антитіла людини за цим винаходом піддають in vivo соматичній гіпермутації. Таким чином, амінокислотними послідовностями областей VH та VL рекомбінантних антитіл є послідовності, які походять із послідовностей VH та VL зародкової лінії людини або зв'язані з ними, та можуть у нормі не існувати в природі в складі зародкової лінії антитіла людини in vivo. Поняття «варіабельний домен (варіабельний домен легкого ланцюга (V L), варіабельний домен важкого ланцюга (VH))» у контексті цього винаходу означає кожну пару доменів важкого та легкого ланцюга, які безпосередньо беруть участь у зв'язуванні антитіла з антигеном. Варіабельні домени легкого та важкого ланцюгів мають однакову загальну структуру, та кожний домен включає чотири каркасні ділянки (framework – FR), послідовності яких у високому ступені є консервативними, що стикаються трьома «гіперваріабельними областями» (або областями, що комплементарно детермінуються (complementary determining region – CDR). Каркасні ділянки приймають конформацію -шару та області CDR можуть формувати петлі, що зв'язують структуру -шару. Області CDR у кожному ланцюзі підтримують властиву їм тривимірну структуру за рахунок каркасних ділянок та формують разом з областями CDR з іншого ланцюга сайт зв'язування антигену. Області CDR3 важкого та легкого ланцюга антитіла відіграють особливо важливу роль у зв’язуючій специфічності/спорідненості антитіла за цим винаходом та тому є додатковим об'єктом у даному винаході. Поняття «антигензв’язуюча частина антитіла» у даному винаході відноситься до амінокислотних залишків антитіла, відповідальних за зв'язування антигену. Антигензв’язуюча 7 UA 103912 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 частина антитіла включає амінокислотні залишки з «областей, що комплементарно детермінуються» або з «CDR». До поняття «каркасні ділянки (Framework – FR)» відносяться ті області варіабельного домену, які відрізняються від залишків гіперваріабельної області, відповідно описаному в даному винаході. Таким чином, варіабельні домени легкого та важкого ланцюга антитіла включають із N- до C-кінця домени FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 та FR4. Особливо область CDR3 важкого ланцюга представляє ту область, яка вносить основний вклад у зв'язування антигену та визначає властивості антитіла. Області CDR та FR визначають, виходячи зі стандартного визначення Kabat E.A. та інш. у кн.: «Sequences of Proteins of Immunological Interest», 1991, 5-е вид., вид-во Public Health Service, Національний інститут здоров'я, Bethesda, Меріленд, та/або відповідні залишки з «гіперваріабельної петлі». Поняття «нуклеїнова кислота» або «молекула нуклеїнової кислоти» у контексті цього винаходу відносяться до молекул ДНК та молекулам РНК. Молекули нуклеїнової кислоти можуть бути одноланцюговими або дволанцюговими, але переважно дволанцюговою ДНК. Поняття «амінокислота» у даному винаході означає групу природних карбокси-альфаамінокислот, включаючи аланін (трибуквений код: ala, однобуквений код: A), аргінін (arg, R), аспарагін (asn, N), аспарагінова кислота (asp, D), цистеїн (cys, C), глутамін (gln, Q), глутамінова кислота (glu, E), гліцин (gly, G), гістидин (his, H), ізолейцин (ile, I), лейцин (leu, L), лізин (lys, K), метіонін (met, M), фенілаланін (phe, F), пролін (pro, P), серин (ser, S), треонін (thr, T), триптофан (trp, W), тирозин (tyr, Y) та валін (val, V). Нуклеїнова кислота є «оперативно зв'язаною», якщо вона перебуває у функціональному зв'язку з іншою нуклеїнової кислотою. Наприклад, ДНК передпослідовності або секреторного лідеру оперативно пов'язана із ДНК поліпептиду, якщо вона експресується в якості білкапопередника, який бере участь у секреції поліпептиду; промотор або енхансер оперативно пов'язані з кодуючою послідовністю, якщо вони впливають на транскрипцію послідовності; або сайт зв'язування рибосоми оперативно пов'язаний з кодуючою послідовністю, якщо він розташований таким чином, що полегшує трансляцію. Звичайно поняття «оперативно зв'язаний» означає, що послідовності ДНК, будучи зв'язаними, є суміжними, і, у випадку секреторного лідеру, стикаються та перебувають у рамці зчитування. Однак енхансери необов'язково повинні бути суміжними. Зв'язування супроводжується лігуванням по відповідним сайтам рестрикції. Якщо таких сайтів нема, то синтетичні олігонуклеотидні праймери або лінкери використовують відповідно до звичайної практики. Звичайно поняття «оперативно зв'язана» означає, що послідовності ДНК, будучи зв'язаними, є колінеарними та, у випадку секреторного лідеру, суміжними та у рамці зчитування. Однак енхансери не повинні стикатися. Зв'язування доповнюється лігуванням у відповідних сайтах рестрикції. Якщо таких сайтів нема, то застосовують синтетичні олігонуклеотидні адаптери або лінкери, що відповідає звичайній практиці. У контексті цього винаходу поняття «клітина», «лінія клітин» та «культура клітин» застосовують взаємозамінно, та всі вони включають наступні покоління клітин. Наприклад, поняття «трансформанти» та «трансформовані клітини» включають первинні клітини суб'єкта та одержані з них культури, незалежно від числа пересівань. Також слід враховувати, що всі наступні генерації клітин можуть бути повністю неідентичними за ДНК через ретельно сплановані або випадкові мутації. До цих понять також відносяться варіанти клітин наступної генерації, які мають ту ж біологічну дію або функцію, що виявляються при скринінзі первісно трансформованих клітин. У контексті цього винаходу поняття «зв'язування» або «специфічне зв'язування» відноситься до зв'язування антитіла з епітопом антигену (ANG-2) в аналізі in vitro, переважно методом плазмонного резонансу на установці BIAcore (фірма GE Healthcare, Упсала, Швеція) (приклад 3), з очищеним антигеном ANG-2 дикого типу. Спорідненість при зв'язуванні виражають у термінах ka (константа швидкості реакції для асоціації антитіла з комплексу антитіло/антиген), kD (константа дисоціації) та KD (kd/ka). Зв'язування або специфічне -8 зв'язування означає зв’язуючу спорідненість (K D), що становить 10 молей/л або менше, -9 -13 переважно від 10 M дo 10 молей/л. Зв'язування антитіла з FcγRIII може бути досліджене методом BIAcore (фірма Ge-Healthcare, Упсала, Швеція). Спорідненість зв'язування виражають за допомогою ka (константи асоціації антитіла з комплексу антитіло/антиген), kd (константи дисоціації), та KD (kd/ka). У контексті цього винаходу поняття «що не зв’язується з ANG-1» або «що не зв’язується специфічно з ANG-1» означає, що антитіло має величину EC50, що перевищує 8000 нг/мл в дослідженні зв’язування ANG-1 in vitro методом ELISA (за прикладом 2). Поняття «епітоп» включає будь-який поліпептидний детермінант, здатний специфічно зв'язуватись з антитілом. У деяких варіантах здійснення цього винаходу епітопний детермінант 8 UA 103912 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 включає поверхневі угруповання молекул хімічної дії, наприклад, амінокислоти, ланцюжки цукрів, фосфорильну або сульфонільну групу, та, у деяких варіантах здійснення цього винаходу можуть мати специфічні тривимірні структурні властивості та або властивості специфічного заряду. Епітоп є областю антигену, яка зв'язана з антитілом. «Частина Fc» антитіла безпосередньо не бере участь у зв'язуванні антитіла з антигеном, але проявляє різні ефекторні функції. Поняття «частина Fc антитіла» відома фахівцям та визначається на основі розщеплення антитіл папаїном. Залежно від амінокислотної послідовності константної області їх важких ланцюгів антитіла та імуноглобуліни ділять на класи: IgA, IgD, IgE, IgG та IgM, а деякі з них можуть додатково бути поділені на підкласи (ізотипи), наприклад, IgG1, IgG2, IgG3 та IgG4, IgA1 та IgA2. За константними областями важкого ланцюга різні класи імуноглобулінів називаються , , ,  та , відповідно. Частина Fc антитіла безпосередньо бере участь в антитілозалежній кітинно опосередкованій цитотоксичності (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity – ADCC) та комплементзалежній цитотоксичності (complement-dependent cytotoxicity – CDC), що засновані на активації комплементу, зв'язуванні C1q та зв'язуванні рецептора Fc. Активація комплементу (CDC) ініціюється зв'язуванням фактору C1q комплементу із частиною Fc антитіл IgG більшості підкласів. Хоча вплив антитіла на систему комплементу залежить від певних обставин, зв'язування з C1q викликається певними сайтами зв'язування в частині Fc. Такі сайти зв'язування відомі в даній області та описані, наприклад, Boakle R.J. та інш., Nature 282, 1975, сс. 742-743, Lukas T.J. та інш., J. Immunol. 127, 1981, сс. 2555-2560, Brunhouse R. та Cebra J.J., Mol. Immunol. 16, 1979, сс. 907-917, Burton D.R. та інш., Nature 288, 1980, сс. 338-344, Thommesen J.E. та інш., Mol. Immunol. 37, 2000, сс. 995-1004, Idusogie E.E. та інш., J. Immunol. 164, 2000, сс. 4178-4184, Hezareh M. та інш., J. Virology 75, 2001, сс. 12161-12168, Morgan A. та інш., Immunology 86, 1995, сс. 319-324, EP 0307434. Такими сайтами зв'язування є, наприклад, L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 та P329 (нумерацію по індексу EU по Kabat див. нижче). Антитіла підкласів IgG1, IgG2 та IgG3 звичайно проявляють активацію комплементу та зв'язування C1q та C3, причому IgG4 не активує систему комплементу та не зв'язує C1q та C3. Антитіло за цим винаходом переважно включає частину Fc, що походить від людини, а саме частину Fc антитіла людини підкласу IgG1. Антитіла за цим винаходом відрізняються тим, що містять константні ланцюги, що походять від людини. Такі константні ланцюги відомі в даній області та описані, наприклад, Kabat, E.A. (див., наприклад, Johnson G. та Wu T.T., Nucleic Acids Res. 28, 2000, сс. 214-218). Наприклад, застосовна константна область важкого ланцюга людини включає амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 57 або SEQ ID NO: 58. Наприклад, застосовна константна область легкого ланцюга людини включає амінокислотну послідовність константної області каппа легкого ланцюга SEQ ID NO: 59 або послідовність константної області лямбда легкого ланцюга SEQ ID NO: 60. Поняття «константна область» у контексті цього винаходу означає суму доменів антитіла, відмінних від варіабельної області. Константна область безпосередньо не бере участь у зв'язуванні антигену, але проявляє різні ефекторні функції. Залежно від амінокислотної послідовності константної області важких ланцюгів антитіла відповідно ділять на класи: IgA, IgD, IgE, IgG та IgM, та деякі з них можуть бути додатково поділені на підкласи, наприклад, IgG1, IgG2, IgG3, та IgG4, IgA1 та IgA2. Константні області важкого ланцюга, відповідні до різних класів антитіл, називаються , , ,  та , відповідно. Константні області легкого ланцюга, виявлені у всіх п'яти класах антитіл, називаються  (каппа) та  (лямбда). Поняття «константна області, похідна від антитіла людини» у контексті цього винаходу означає константну область важкого ланцюга антитіла людини підкласів IgG1, IgG2, IgG3 або IgG4 та/або константної області κ легкого ланцюга. Такі константні області відомі в даній області та описані, наприклад, Kabat E.A. (див., наприклад, Johnson G. та Wu T.T., Nucleic Acids Res. 28, 2000, сс. 214-218; Kabat E.A. та інш., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 1975, сс. 2785-2788). Хоча антитіла підкласу IgG4 проявляють понижене зв'язування з рецептором Fc (FcRIIIa), антитіла інших підкласів IgG проявляють сильне зв'язування. Однак Pro238, Asp265, Asp270, Asn297 (втрата вуглеводу Fc), Pro329, Leu234, Leu235, Gly236, Gly237, Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 та His435 є залишками, які у випадку зміни також проявляють понижене зв'язування рецептора Fc (Shields R.L. та інш., J. Biol. Chem. 276, 2001, сс. 6591-6604; Lund J. та інш., FASEB J. 9, 1995, сс. 115-119; Morgan A. та інш., Immunology 86, 1995, сс. 319-324; EP 0307434). В одному з варіантів здійснення цього винаходу антитіло за цим винаходом має понижене зв'язування з FcR, у порівнянні з антитілом IgG1 та моноспецифічним двовалентним вихідним антитілом у відношенні FcR зв'язування підкласу IgG4, або підкласу IgG1 або IgG2 з мутацією в S228, L234, L235 та/або D265, та/або містить мутацію PVA236. В одному з варіантів здійснення 9 UA 103912 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 цього винаходу мутаціями в моноспецифічному двовалентному вихідному антитілі є S228P, L234A, L235A, L235E та/або PVA236. В іншому варіанті здійснення цього винаходу мутації в моноспецифічному двовалентному вихідному антитілі є S228P в IgG4 S228P та L234A та L235A в IgG1. Константні області важкого ланцюга показані в SEQ ID NO: 57 та 58. В одному з варіантів здійснення цього винаходу константна область важкого ланцюга моноспецифічного двовалентного вихідного антитіла є послідовністю SEQ ID NO: 57 з мутаціями L234A та L235A. В іншому варіанті здійснення цього винаходу константна область важкого ланцюга моноспецифічного двовалентного вихідного антитіла є послідовність SEQ ID NO: 58 з мутацією S228P. В іншому варіанті здійснення цього винаходу константна область легкого ланцюга моноспецифічного двовалентного вихідного антитіла є областю каппа легкого ланцюга послідовності SEQ ID NO: 59 або константною областю лямбда легкого ланцюга SEQ ID NO: 60. В одному з варіантів здійснення цього винаходу константна область важкого ланцюга моноспецифічного двовалентного вихідного антитіла є послідовністю SEQ ID NO: 57 або SEQ ID NO: 58 з мутацією S228P. Константна область антитіла безпосередньо бере участь в антитілозалежній кітинно опосередкованій цитотоксичності (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity - ADCC) та комплементзалежній цитотоксичності (complement-dependent cytotoxicity – CDC). Активація комплементу (CDC) ініціюється зв'язуванням фактора C1q комплементу з константною областю більшості підкласів IgG антитіл. Зв'язування C1q з антитілом викликається певними міжбілковими взаємодіями по так званим сайтам зв'язування. Такі сайти зв'язування константної області відомі в даній області та описані, наприклад, Lukas T.J. та інш., J. Immunol. 127, 1981, сс. 2555-2560; Brunhouse R. та Cebra J.J., Mol. Immunol. 16, 1979, сс. 907-917; Burton D.R. та інш., Nature 288, 1980, сс. 338-344; Thommesen J.E. та інш., Mol. Immunol. 37, 2000, сс. 995-1004; Idusogie E.E. та інш., J. Immunol. 164, 2000, сс. 4178-4184; Hezareh M. та інш., J. Virol. 75, 2001, сс. 12161-12168; Morgan A. та інш., Immunology 86, 1995, сс. 319-324; EP 0307434. Такі сайти зв'язування константної області характеризуються, наприклад, амінокислотами L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 та P329 (нумерація по індексу EU нумерації Kabat). Поняття «антитілозалежної клітинної цитотоксичності (antibody-dependent cellular cytotoxicity - ADCC)» відноситься до лізису клітин-мішеней людини антитілом за цим винаходом в присутності ефекторних клітин. ADCC переважно вимірюють шляхом обробки препарату клітин, експресуючих CCR5, антитілом за цим винаходом в присутності ефекторних клітин, наприклад, щойно виділених МКПК або очищених ефекторних клітин із лейкоцитних плівок, наприклад, моноцитів або природних клітин-кілерів (natural killer - NK), або лінії постійно зростаючих клітин NK. Поняття «комплементзалежна цитотоксичність (complement-dependent cytotoxicity - CDC)» означає процес ініціації шляхом зв'язування фактора C1q комплементу із частиною Fc більшості підкласів антитіл IgG. Зв'язування C1q з антитілом викликається вираженими міжбілковими взаємодіями по так званим сайтам зв'язування. Такі сайти зв'язування частини Fc відомі в даній області (див. вище). Такі сайти зв'язування частини Fc, наприклад, відрізняються за амінокислотами L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 та P329 (нумерація по індексу EU нумерації Kabat). Антитіла підкласів IgG1, IgG2 та IgG3 звичайно проявляють активування комплементу, включаючи зв'язування C1q та C3, причому IgG4 не активує систему комплементу та не зв'язує C1q та/або C3. Антитіло за цим винаходом одержують методами рекомбінації. Одним з об'єктів цього винаходу є нуклеїнова кислота, що кодує антитіло за цим винаходом, а іншим об'єктом є клітина, що включає зазначену нуклеїнову кислоту, що кодує антитіло за цим винаходом. Методи одержання шляхом рекомбінації широко поширені в даній області та включають експресію білка в прокаріотичних та еукаріотичних клітинах з наступним виділенням антитіла та, звичайно, очищенням до стадії фармацевтично прийнятної чистоти. Для експресії антитіл, відповідно до зазначеного вище в клітинах-хазяїнах, нуклеїнові кислоти, що кодують відповідні модифіковані легкий та важкий ланцюги, інсертовані у вектори експресії стандартними методами. Експресію проводять у відповідних прокаріотичних або еукаріотичних клітинаххазяїнах, наприклад, у клітинах CHO, у клітинах NS0, у клітинах SP2/0, у клітинах HEK293, у клітинах COS, у клітинах PER.C6, у дріжджах або в клітинах E. coli, та антитіло виділяють із клітин (з супернатанта або клітин після лізису). Основні методи рекомбінантного одержання антитіл відомі в даній області та описані, наприклад, в оглядах Makrides S.C., Protein Expr. Purif. 17, 1999, сс. 183-202; Geisse S. та інш., Protein Expr. Purif. 8, 1996, сс. 271-282; Kaufman R.J., Mol. Biotechnol. 16, 2000, сс. 151-161; Werner R.G., J. Drug Res. 48, 1998, сс. 870-880. Антитіла за цим винаходом можуть бути відповідним чином відділені із культурального середовища звичайними методами очищення імуноглобуліну, наприклад, із застосуванням 10 UA 103912 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 білка А-сефарози, хроматографії в гидроксиапатиті, гель-електрофорезом, діалізом або афінною хроматографією. ДНК та РНК, що кодують моноклональні антитіла, легко виділяють та секвенують, використовуючи звичайні методи. Клітини гібридоми можуть бути джерелом таких РНК та ДНК. Після виділення ДНК може бути інсертована у вектори експресії, які потім трансфекують у клітини-хазяї, наприклад, клітини HEK 293, клітини CHO або клітини мієломи, які іншим способом не виробляють білок імуноглобуліну, для одержання синтезу рекомбінантних моноклональних антитіл у клітинах-хазяїнах. Варіанти (або мутанти) амінокислотних послідовностей антитіла за цим винаходом одержують шляхом впровадження відповідних нуклеотидних змін у ДНК антитіла або нуклеотидним синтезом. Такі модифікації можуть бути здійснені, однак, тільки в досить обмеженому діапазоні, наприклад, за наведеним вище описом. Наприклад, модифікації не змінюють властивості зазначених вище антитіл, наприклад, ізотипу IgG, та зв'язування антигену, але можуть поліпшити продуктивність рекомбінанту, стабільність білка або полегшити очищення. Поняття «клітина-хазяїн» у даному винаході означає будь-який тип клітинної системи, який може бути сконструйований для вироблення антитіла за цим винаходом. В одному з варіантів здійснення цього винаходу клітини HEK293 та клітини CHO використовують у якості клітинхазяїв. У контексті цього винаходу поняття «клітина», «лінія клітин» та «культура клітин» використовуються взаємозамінно, та всі ці поняття також відносяться до потомства цих клітин. Таким чином, поняття «трансформанти» та «трансформовані клітини» включають первинні клітини суб'єкта та культури, одержані від них, незалежно від числа пересівань. Так само очевидно, що все потомство не може бути повною мірою ідентичним по змісту ДНК через направленно здійснених або випадкових мутацій. До зазначених понять також відносяться варіанти наступних генерацій клітин, які мають ту ж функцію або біологічну дію, які були виявлені для первісно трансформованих клітин. Експресія в клітинах NS0 описана, наприклад, Barnes L.M. та інш., Cytotechnology 32, 2000, сс. 109-123; Barnes L.M. та інш., Biotech. Bioeng. 73, 2001, сс. 261-270. Короткочасна експресія описана, наприклад, Durocher Y. та інш., Nucl. Acids. Res. 30, 2002, E9. Клонування варіабельних доменів описано Orlandi R. та інш., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1989, сс. 38333837; Carter P. та інш., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1992, сс. 4285-4289; Norderhaug L. та інш., J. Immunol. Methods 204, 1997, сс. 77-87. Переважна система короткочасної експресії (у клітинах HEK 293) описана Schlaeger E.-J. та Christensen K. в Cytotechnology 30, 1999, сс. 71-83, та Schlaeger E.-J. в J. Immunol. Methods 194, 1996, сс. 191-199. Контрольні послідовності, які застосовні для прокаріот, наприклад, включають промотор, необов'язково послідовність оператора, сайт зв'язування рибосоми. Відомо, що еукаріотичні клітини використовують промотори, енхансери та сигнали поліаденілування. Нуклеїнова кислота є «оперативно зв'язаною», якщо вона встановлена у функціональному зв'язку з іншою послідовністю нуклеїнової кислоти. Наприклад, ДНК передпослідовності або секреторного лідеру оперативно пов'язана із ДНК поліпептиду, якщо вона експресується в якості білка-попередника, який бере участь у секреції поліпептиду; промотор або енхансер оперативно пов'язані з кодуючою послідовністю, якщо вона впливає на транскрипцію послідовності; або сайт зв'язування рибосоми є оперативно пов'язаним з кодуючою послідовністю, якщо він розташовується таким чином, щоб сприяти трансляції. Звичайно поняття «оперативно зв'язаний» означає, що послідовності ДНК, будучи зв'язаними, є суміжними, та, у випадку секреторного лідеру, стикаються та перебувають у рамці зчитування. Однак енхансери необов'язково повинні бути суміжними. Зв'язування доповнюється лігуванням по відповідним сайтам рестрикції. Якщо таких сайтів нема, то синтетичні олігонуклеотидні адаптери або лінкери використовують відповідно до звичайної практики. Очищення антитіл проводять для елімінації клітинних компонентів або інших контамінантів, наприклад, інших нуклеїнових кислот або білків, за допомогою стандартних методів, що включають обробку лугом/SDS, розшарування при центрифугуванні в градієнті CsСl, колоночну хроматографію, гель-електрофорез в агарозі та інші відомі в даній області методи. Див. кн.: «Current Protocols in Molecular Biology», 1987, під ред. Ausubel F. та інш., вид-во Greene Publishing and Wiley Interscience, Нью-Йорк. Різні методи були розроблені та широко застосовуються для очищення білка, наприклад, афінна хроматографія з мікробними білками (наприклад, афінна хроматографія з білком А або білком G), іонообмінна хроматографія (наприклад, катіонообмінна хроматографія (карбоксиметильні смоли), аніонообмінна хроматографія (аміноетильні смоли) та хроматографія змішаної дії), тіофільна адсорбція (наприклад, з бета-меркаптоетанолом та іншими SH лігандами), хроматографія гідрофобної взаємодії або ароматичної адсорбції (наприклад, з феніл-сефарозою, аза-аренофільними 11 UA 103912 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 смолами або м-амінофенілборною кислотою), афінна хроматографія з хелатами металів (наприклад, з Ni(II)- та Cu(II)-афінним матеріалом), ексклюзійна хроматографія та електрофоретичні методи (наприклад, електрофорез, капілярний електрофорез) (Vijayalakshmi M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75, 1998, сс. 93-102). Даний винахід включає спосіб лікування пацієнта, що потребує такого лікування, що відрізняється введенням пацієнтові терапевтично ефективної кількості антитіла за цим винаходом. Даний винахід включає застосування антитіла за цим винаходом для лікування. Даний винахід включає застосування антитіла за цим винаходом для одержання лікарського засобу для попередження метастазування. Даний винахід включає застосування антитіла за цим винаходом для одержання лікарського засобу для лікування раку. Одним з об'єктів цього винаходу є фармацевтична композиція, що включає антитіло за цим винаходом. Іншим об'єктом цього винаходу є застосування антитіла за цим винаходом для одержання фармацевтичної композиції. Ще одним об'єктом цього винаходу є спосіб одержання фармацевтичної композиції, що включає антитіло за цим винаходом. В іншому об'єкті за цим винаходом передбачена композиція, наприклад, фармацевтична композиція, що містить антитіло за цим винаходом, перероблене разом з фармацевтичним носієм. Іншим об'єктом цього винаходу є зазначена фармацевтична композиція для попередження метастазування. Іншим об'єктом цього винаходу є антитіло за цим винаходом для попередження метастазування. Ще одним об'єктом цього винаходу є застосування антитіла за цим винаходом для одержання лікарського засобу для попередження метастазування. Іншим об'єктом цього винаходу є спосіб попередження метастазування у пацієнта з первинним раковим захворюванням, що представляє собою введення антитіла за цим винаходом пацієнтові, що потребує такого превентивного лікування. Може бути продемонстроване високоефективне попередження спонтанного метастазування/вторинних пухлин in vivo в ортотопічній та підшкірній моделі раку (див. приклад 9) (іншим варіантом є модель, у якій пухлинні клітини вносять ін'єкцією внутрішньовенно. Це нагадує клінічну ситуацію, коли клітини поширюються від первинної пухлини та метастаз до вторинного органа, наприклад, до легенів або печінки (де формуються вторинні пухлини). Поняття «метастазування» за цим винаходом відноситься до переносу ракових клітин від первинної пухлини в одне або кілька місць будь-де в організмі пацієнта, де формуються вторинні пухлини. Засоби виявлення метастаз, якщо рак метастазує, є відомими в даній області та включають сканування кісток, рентген грудної клітини, комп'ютерну хроматографію, магнітнорезонансну томографію та тестування пухлинних маркерів. Поняття «попередження метастазування» або «попередження вторинних пухлин» у контексті цього винаходу мають те саме значення та направляють профілактичний агент проти метастазування у пацієнта з рецидивуючим HER2-позитивним раком, та в такий спосіб пригнічуючи або зменшуючи додатковий перенос ракових клітин від первинної пухлини в одне або кілька місць будь-де в організмі пацієнта. Це означає, що метастазування первинної пухлини або раку попереджають, відстрочують або знижують, та, в такий спосіб, розвиток вторинних пухлин попереджується, відстрочується або знижується. Переважно метастазування, тобто вторинні пухлини в легенях, попереджуються або зменшуються, що означає, що перенос у ході метастазування ракових клітин від первинної пухлини в легені попереджується або знижується. Іншим об'єктом цього винаходу є зазначена фармацевтична композиція для лікування раку. Іншим об'єктом цього винаходу є антитіло за цим винаходом для лікування раку. Ще одним об'єктом цього винаходу є застосування антитіла за цим винаходом для одержання лікарського засобу для лікування раку. Іншим об'єктом цього винаходу є спосіб лікування пацієнта з раком шляхом введення антитіла за цим винаходом пацієнтові, що потребує такого лікування. У контексті цього винаходу поняття «фармацевтичний носій» включає будь-який або всі розчинники, диспергуючі середовища, покриття, антибактеріальні та протигрибкові агенти, ізотонічні агенти та агенти відстрочки всмоктування, а також інші фізіологічно сумісні агенти. Переважно носій застосовують для внутрішньошньовенного, внутрішньом'язового, підшкірного, парентерального, спинального або епідермального введення (наприклад, за допомогою ін'єкції або інфузії). 12 UA 103912 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Композиція за цим винаходом може вводитись різними способами, відомими в даній області. Фахівцям у даній області відомо, що способи введення можуть варіюватись залежно від потрібних результатів. Для введення сполуки за цим винаходом різними способами може знадобитись нанесення покриття на сполуки, або одночасно із сполукою ввести матеріал, що перешкоджає інактивації цієї сполуки. Наприклад, сполука може вводитись суб'єктові у відповідному носії, наприклад, у ліпосамах або в розчиннику. Фармацевтично прийнятні розчинники включають фізіологічний розчин та водні буферні розчини. До фармацевтичних розчинів відносяться стерильні водні розчини або дисперсії та стерильні порошки, що готуються безпосередньо перед введенням препаратів стерильних ін'єкційних розчинів або дисперсій. Застосування таких середовищ та агентів для фармацевтично діючих речовин відомо в даній області. Фрази «парентеральне введення» та «введені парентерально», що застосовуються в даному винаході, означають способи введення, відмінні від введення усередину та місцевого введення, звичайно способи введення за допомогою ін'єкції включають, але не обмежуються ними, внутрішньовенне, внутрішньом'язове, внутрішньоартеріальне, підоболонкове, внутрішньокапсулярне, внутрішньоочне, внутрішньосерцеве, внутрішньошкірне, внутрішньочеревинне, внутрішньотрахейне, транстрачеальне, підшкірне, підкутикулярне, внутрішньосуглобне, підкапсулярне, надпавутинне, внутрішньоспинальне, епідуральне та надчеревне введення за допомогою ін'єкції та інфузії. Поняття «рак» у контексті цього винаходу відноситься до проліферативних захворювань, наприклад, до лімфоми, лімфоцитарних лейкозів, раку легенів, недрібноклітинного раку легенів (НДКРЛ), бронхоальвеолярного раку легенів, раку кісток, раку підшлункової залози, раку шкіри, раку голови та шиї, шкірної або внутрішньоочної меланоми, раку матки, раку яєчників, раку прямої кишки, раку анальної області, раку шлунку, раку області шлунку, раку товстої кишки, раку грудей, раку матки, карциноми фаллопієвих труб, карциноми ендометрія, карциноми шийки матки, карциноми піхви, карциноми зовнішніх жіночих статевих органів, хвороби Ходжкіна, раку стравоходу, раку тонкої кишки, раку ендокринної системи, раку щитовидки, раку паращитовидки, раку надниркової залози, саркоми м'яких тканин, раку уретри, раку пенісу, раку простати, раку сечового міхура, раку нирки та сечоводу, раку нирки, раку ниркових мисок, мезотеліоми, гепатоклітинного раку, раку жовчних шляхів, новоутворень центральної нервової системи (ЦНС), раку хребта, гліоми стовбура мозку, мультиформної гліоми, астроцитоми, шваннозу, епендимоми, медуллобластоми, менінгіоми плоскоклітинної карциноми, аденоми гіпофізу та саркоми Юїнга, включаючи стійкі версії будь-якої із зазначених вище форм раку або комбінацію із зазначених вище однієї або декількох форм раку. Іншим об'єктом цього винаходу є фармацевтична композиція, яку застосовують в якості антиангіогенного агента. Такий антиангіогенний агент може застосовуватись для лікування раку, особливо солідних пухлин, та інших судинних захворювань. Ще одним об'єктом цього винаходу є застосування антитіла за цим винаходом для одержання лікарського засобу для лікування судинних захворювань. Іншим об'єктом цього винаходу є антитіло за цим винаходом для лікування судинних захворювань. Переважним варіантом здійснення цього винаходу є антитіло за цим винаходом для лікування ретинопатії. Переважним варіантом здійснення цього винаходу є застосування антитіла за цим винаходом для одержання лікарського засобу для лікування ретинопатії. Іншим об'єктом цього винаходу є спосіб лікування пацієнта із судинним захворюванням шляхом введення антитіла за цим винаходом пацієнтові, що потребує такого лікування. Поняття «судинні захворювання» включає рак, запальні захворювання, атеросклероз, ішемію, травми, сепсис, хронічне обструктивне захворювання легенів (ХОЗЛ), астму, діабет, вікову дегенерацію жовтої плями (ВДЖП), ретинопатію, удар, ожиріння, гостре ушкодження легенів, крововилив, судинне просочування, наприклад, індуковане цитокіном, алергію, базедову хворобу, аутоімунний тиреоїдіт Хашімото, ідіопатичну тромбоцитопенічну пурпуру, гігантоклітинний артеріїт, ревматоїдний артрит, системний червоний вовчок (СЧВ), вовчковий нефрит, хворобу Крона, розсіяний склероз, виразковий коліт, особливо солідні пухлини, внутрішньоочні судинні синдроми, (наприклад, проліферативні ретинопатії або вікову дегенерацію жовтої плями (ВДЖП)), ревматоїдний артрит та псоріаз (Folkman J. та інш., J. Biol. Chem. 267, 1992, сс. 10931- 10934; Klagsbrun M. та інш., Annu. Rev. Physiol. 53, 1991, сс. 217239; та Garner A. у кн.: «Pathobiology of ocular disease, A dynamic approach», 1994, під ред. Garner A. та Klintworth G. K., 2-е вид., вид-во Marcel Dekker, Нью-Йорк, сс. 1625-1710). 13 UA 103912 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Ці композиції також можуть містити допоміжні речовини, наприклад, консерванти, зволожуючі агенти, емульгуючі агенти та диспергуючі агенти. Гарантованого попередження присутності мікроорганізмів можна досягти як описаними вище процедурами стерилізації, так і включенням різних антибактеріальних та протигрибкових агентів, наприклад, парабену, хлорбутанолу, фенолу, сорбінової кислоти та ін. Може бути бажаним включення в композиції ізотонічних агентів, наприклад, цукрів, хлориду натрію та інших. Крім того, може бути досягнуте пролонговане всмоктування ін'єкційної фармацевтичної форми, наприклад, за допомогою включення агентів, які відстрочують всмоктування, наприклад, моностеарату алюмінію та желатину. Незалежно від обраного способу введення сполуки за цим винаходом, які з них можуть застосовуватись у відповідній гідратованій формі, та/або фармацевтичні сполуки за цим винаходом переробляють у фармацевтично прийнятні дозовані форми за допомогою звичайних методів, відомих фахівцям у даній області. Фактичні рівні дозування діючих інгредієнтів у фармацевтичних композиціях за цим винаходом можуть варіюватись таким чином, щоб одержати кількість діючого інгредієнта, яка є ефективною для досягнення необхідної терапевтичної відповіді для певного пацієнта, композицію та спосіб введення без токсичності для пацієнта. Обраний рівень дозування може залежати від різних фармакокінетичних факторів, включаючи дію певних застосовуваних композицій за цим винаходом та від способу введення без токсичності для пацієнта. Обраний рівень дозування може залежати від різних фармакокінетичних факторів, включаючи дію певних застосовуваних композицій за цим винаходом, способу введення, часу введення, швидкості екскреції певної застосовуваної сполуки, тривалості лікування, інших лікарських засобів, сполук та/або матеріалів, використаних у комбінації з певними застосовуваними композиціями, а також від віку, статі, маси тіла, стану, загального стану здоров'я та історії хвороби пацієнта, що піддається лікуванню, та інших факторів, відомих у медицині. Композиції повинні бути стерильними та рідкими настільки, щоб композиція могла увійти в шприц. Крім води, носієм переважно є ізотонічний буферний сольовий розчин. Необхідна текучість може підтримуватись, наприклад, за допомогою застосування покривних агентів, наприклад, лецитину, за допомогою підтримки необхідного розміру часток у випадку дисперсії та за допомогою застосування поверхнево-активних речовин. У багатьох випадках є переважним включати в композицію ізотонічні агенти, наприклад, цукри, багатоатомні спирти, наприклад, манніт або сорбіт, та натрій хлорид. У контексті цього винаходу поняття «клітина», «лінія клітин» та «культура клітин» використовують взаємозамінно, та всі вони також включають слідуючі покоління клітин. Таким чином, поняття «трансформанти» та «трансформовані клітини» включають первинні клітини суб'єкта та похідні від них культури, незалежно від числа пересівань. Також слід враховувати, що все потомство клітин може бути неідентичним за змістом ДНК через планові або випадкові мутацій. До цих понять також відносяться варіанти клітин слідуючої генерації, які мають ту ж біологічну дію або функцію, що виявляються при скринінзі первісно трансформованих клітин. Якщо маються на увазі інші позначення, це буде ясно з контексту. Поняття «трансформація», що використовується в даному винаході, відноситься до процесу переносу вектора/нуклеїнової кислоти в клітину-хазяїна. Якщо використовують клітини без важкоподоланої стінки в якості клітин-хазяїв, то трансфекцію виконують, наприклад, методом осадження кальцієм фосфатом згідно з описом Graham F.L. та van der Eb, Virology 52, 1973, сс. 456-467. Однак також можуть застосовуватись інші методи введення ДНК у клітини, наприклад, ядерної ін'єкції або злиття протопластів. Якщо використовують прокаріотичні клітини або клітини, які мають міцну будову клітинної стінки, то один з методів трансфекції наприклад, представляє собою обробку кальцієм, використовуючи кальцій хлорид згідно з описом Cohen F. N, та інш., PNAS. 69, 1972, сс. 7110 та наступні. У контексті цього винаходу поняття «експресія» відноситься до процесу, за допомогою якого нуклеїнова кислота транскрибується в іРНК, та/або до процесу, за допомогою якого транскрибована іРНК (яку також називають транскриптом) пізніше транслюється в пептиди, поліпептиди або білки. Транскрипти та кодуємі поліпептиди разом називаються генними продуктами. Якщо полінуклеотид походить від геномної ДНК, то експресія в еукаріотичних клітинах може включати сплайсинг іРНК. Поняття «вектор» означає молекулу нуклеїнової кислоти, зокрема яка самореплікується, яка переносить інсертовану молекулу нуклеїнової кислоти в клітини-хазяї та/або між клітинамихазяями. До цього поняття відносяться вектори, які діють в основному для інсерції ДНК або РНК у клітину (наприклад, інтеграція в хромосому), реплікації векторів, функція яких переважно полягає в реплікації ДНК або РНК, та вектори експресії, які діють для транскрипції та/або 14 UA 103912 C2 5 10 трансляції ДНК або РНК. Також до цього поняття відносяться вектори, які забезпечують більше однієї з описаних функцій. Поняття «вектор експресії» відноситься до полінуклеотиду, який інтродукований у відповідну клітину-хазяїна та може бути транскрибований та трансльований у поліпептид. Поняття «система експресії» звичайно відноситься до відповідної клітини-хазяїна, що включає вектор експресії, який може функціонувати для вироблення необхідного продукту експресії. Приклади, що наводяться нижче, переліки послідовностей та фігури передбачені для кращого розуміння цього винаходу, дійсна область охоплення якого викладена нижче у формулі цього винаходу. Слід враховувати, що модифікації можуть бути здійснені в ході описаних нижче дій, не відхиляючись від духу цього винаходу. Опис амінокислотних послідовностей SEQ ID NO: 1 CDR3 важкого ланцюга, Ang2i_LC06 SEQ ID NO: 2 CDR2 важкого ланцюга, Ang2i_LC06 SEQ ID NO: 3 CDR1 важкого ланцюга, Ang2i_LC06 SEQ ID NO: 4 CDR3 легкого ланцюга, Ang2i_LC06 SEQ ID NO: 5 CDR2 легкого ланцюга, Ang2i_LC06 SEQ ID NO: 6 CDR1 легкого ланцюга, Ang2i_LC06 SEQ ID NO: 7 варіабельний домен важкого ланцюга, Ang2i_LC06 SEQ ID NO: 8 варіабельний домен легкого ланцюга, Ang2i_LC06 SEQ ID NO: 9 CDR3 важкого ланцюга, Ang2i_LC07 SEQ ID NO: 10 CDR2 важкого ланцюга, Ang2i_LC07 SEQ ID NO: 11 CDR1 важкого ланцюга, Ang2i_LC07 SEQ ID NO: 12 CDR3 легкого ланцюга, Ang2i_LC07 SEQ ID NO: 13 CDR2 легкого ланцюга, Ang2i_LC07 SEQ ID NO: 14 CDR1 легкого ланцюга, Ang2i_LC07 SEQ ID NO: 15 варіабельний домен важкого ланцюга, Ang2i_LC07 SEQ ID NO: 16 варіабельний домен легкого ланцюга, Ang2i_LC07 SEQ ID NO: 17 CDR3 важкого ланцюга, Ang2k_LC08 SEQ ID NO: 18 CDR2 важкого ланцюга, Ang2k_LC08 SEQ ID NO: 19 CDR1 важкого ланцюга, Ang2k_LC08 SEQ ID NO: 20 CDR3 легкого ланцюга, Ang2k_LC08 SEQ ID NO: 21 CDR2 легкого ланцюга, Ang2k_LC08 SEQ ID NO: 22 CDR1 легкого ланцюга, Ang2k_LC08 SEQ ID NO: 23 варіабельний домен важкого ланцюга, Ang2k_LC08 SEQ ID NO: 24 варіабельний домен легкого ланцюга, Ang2k_LC08 SEQ ID NO: 25 CDR3 важкого ланцюга, Ang2s_LC09 SEQ ID NO: 26 CDR2 важкого ланцюга, Ang2s_LC09 SEQ ID NO: 27 CDR1 важкого ланцюга, Ang2s_LC09 SEQ ID NO: 28 CDR3 легкого ланцюга, Ang2s_LC09 SEQ ID NO: 29 CDR2 легкого ланцюга, Ang2s_LC09 SEQ ID NO: 30 CDR1 легкого ланцюга, Ang2s_LC09 SEQ ID NO: 31 варіабельний домен важкого ланцюга, Ang2s_LC09 SEQ ID NO: 32 варіабельний домен легкого ланцюга, Ang2s_LC09 SEQ ID NO: 33 CDR3 важкого ланцюга, Ang2i_LC10 SEQ ID NO: 34 CDR2 важкого ланцюга, Ang2i_LC10 SEQ ID NO: 35 CDR1 важкого ланцюга, Ang2i_LC10 SEQ ID NO: 36 CDR3 легкого ланцюга, Ang2i_LC10 SEQ ID NO: 37 CDR2 легкого ланцюга, Ang2i_LC10 SEQ ID NO: 38 CDR1 легкого ланцюга, Ang2i_LC10 SEQ ID NO: 39 варіабельний домен важкого ланцюга, Ang2i_LC10 SEQ ID NO: 40 варіабельний домен легкого ланцюга, Ang2i_LC10 SEQ ID NO: 41 CDR3 важкого ланцюга, Ang2k_LC11 SEQ ID NO: 42 CDR2 важкого ланцюга, Ang2k_LC11 SEQ ID NO: 43 CDR1 важкого ланцюга, Ang2k_LC11 SEQ ID NO: 44 CDR3 легкого ланцюга, Ang2k_LC11 SEQ ID NO: 45 CDR2 легкого ланцюга, Ang2k_LC11 SEQ ID NO: 46 CDR1 легкого ланцюга, Ang2k_LC11 SEQ ID NO: 47 варіабельний домен важкого ланцюга, Ang2k_LC11 SEQ ID NO: 48 варіабельний домен легкого ланцюга, Ang2k_LC11 SEQ ID NO: 49 CDR3 важкого ланцюга, Ang2s_R3_LC03 15 UA 103912 C2 SEQ ID NO: 50 SEQ ID NO: 51 SEQ ID NO: 52 SEQ ID NO: 53 SEQ ID NO: 54 SEQ ID NO: 55 SEQ ID NO: 56 SEQ ID NO: 57 SEQ ID NO: 58 SEQ ID NO: 59 SEQ ID NO: 60 SEQ ID NO: 61 SEQ ID NO: 62 SEQ ID NO: 63 5 10 15 20 25 30 35 40 CDR2 важкого ланцюга, Ang2s_R3_LC03 CDR1 важкого ланцюга, Ang2s_R3_LC03 CDR3 легкого ланцюга, Ang2s_R3_LC03 CDR2 легкого ланцюга, Ang2s_R3_LC03 CDR1 легкого ланцюга, Ang2s_R3_LC03 варіабельний домен важкого ланцюга, Ang2s_R3_LC03 варіабельний домен легкого ланцюга, Ang2s_R3_LC03 константна область важкого ланцюга людини, похідна від IgG1 константна область важкого ланцюга людини, похідна від IgG4 константна область каппа легкого ланцюга константна область лямбда легкого ланцюга рецептор Tie-2 людини ангіопоетин-2 людини (ANG-2) з лідерною послідовністю та Hisміткою ангіопоетин-1 людини (ANG-1) з лідерною послідовністю та Hisміткою Опис фігур Фіг. 1. Клонування IgG для короткочасної експресії у векторах експресії для короткочасної експресії A) Ang2i-LC06 (фіг. 1A), Б) Ang2i-LC06 (фіг. 1Б). Фіг. 2. Очищення в гелі SDS-PAGE анти- ANG-2 антитіл Ang2i-LC06, Ang2i-LC07 та Ang2kLC08. Фіг. 3. Дослідження взаємодії ангіопоетину-Tie2 методом ELISA. Фіг. 4. Пригнічення зв'язування ANG-2 з Tie2 за рахунок Ang2i-LC06 та Ang2k-LC08. Фіг. 5. Пригнічення зв'язування ANG-1 з Tie2 за рахунок Ang2i-LC06 та Ang2k-LC08. Фіг. 6. Модель ксенотрансплантата Colo205 для тестування in vivo ефективності анти-ANG-2 антитіл. Фіг. 7. Модель ксенотрансплантата KPL-4 для тестування in vivo ефективності анти-ANG-2 антитіл. Фіг. 8. Зв'язування ANG-1 за допомогою сенсограмм Biacore. Фіг. 9. Попередження метастаз/вторинних пухлин в легенях антитілами за цим винаходом в первинному ксенотрансплантаті пухлини товстої кишки (9A) та первинному ксенотрансплантаті грудей (9B). Фіг. 10. Пригнічення ретинопатії антитілами за цим винаходом. Експеримент 1 Матеріали та основні методи Загальна інформація, що стосується нуклеотидних послідовностей легкого та важкого ланцюгів імуноглобулінів людини, наведена в кн.: Kabat E.A. та інш. «Sequences of Proteins of Immunological Interest», 1991, 5-е вид., вид-во Public Health Service, Національний інститут здоров'я, Бетесда, Меріленд. Амінокислоти ланцюжків антитіл нумерують та вказують за нумерацією EU (Edelman G.M. та інш., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63, 1969, сс. 78-85; у кн.: Kabat E.A. та інш. «Sequences of Proteins of Immunological Interest», 1991, 5-е вид., вид-во Public Health Service, Національний інститут здоров'я, Бетесда, Меріленд). Методи рекомбінації ДНК Стандартні методи застосовують для роботи із ДНК відповідно описаному Sambrook J. та інш. у кн.: «Molecular cloning: A laboratory manual», 1989, вид-во Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Нью-Йорк. Реагенти для молекулярної біології використовують за інструкціями виробника. Генний синтез Необхідні генні сегменти одержують із олігонуклеотидів хімічним синтезом. Генні сегменти, фланковані єдиними сайтами розщеплення ендонуклеазами, збирають шляхом віджигу та лігування олігонуклеотидів, включаючи ПЦР-ампліфікацію, та потім клонують через зазначені сайти рестрикції, наприклад, KpnI/ SacI або AscI/PacI, у векторі клонування pGA4, заснованому на pPCRScript (фірма Stratagene). Послідовності ДНК субклонованих генних фрагментів підтверджують сиквенсом ДНК. Фрагменти генного синтезу впорядковують відповідно до технічних вимог фірми Geneart (Regensburg, Німеччина). Визначення послідовності ДНК Послідовності ДНК визначають дволанцюговим секвенуванням, виконуваним фірмами MediGenomix GmbH (Martinsried, Німеччина) або Sequiserve GmbH (Vaterstetten, Німеччина). Аналіз послідовностей ДНК та білка та використання даних за послідовностями 16 UA 103912 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Використовують версію 10.2 пакета програмного забезпечення GCG (Genetics Computer Group, Медісон, Вісконсін) та Infomax's Vector NT1 Advance suite версію 8.0 для створення послідовностей, картування, аналізу, пояснень та ілюстрацій. Вектори експресії Для експресії необхідних антитіл використовують варіанти експресуючих плазмід для короткочасної експресії (наприклад, у клітинах HEK293 EBNA або HEK293-F) або для стабільної експресії (наприклад, у клітинах CHO), засновані на організації кДНК із промотором CMV-інтрону A або на геномній організації із промотором CMV (наприклад, фіг. 1). Крім касети експресії антитіла вектори містять: - початок реплікації, який дозволяє здійснювати реплікацію цієї плазміди в E. coli, та - ген -лактамази, який зумовлює стійкість до ампіциліну в E. coli. Одиниця транскрипції гену антитіла складається з наступних елементів: - унікального сайту (сайтів) рестрикції з 5’-кінця, - прямого раннього енхансера та промотору від цитомегаловіруса людини, - наступної послідовності інтрону А у випадку організації кДНК, - 5’-нетрансльованої області гену антитіла людини, - сигнальної послідовності важкого ланцюга імуноглобуліну, - ланцюга антитіла людини (важкого ланцюга, модифікованого важкого ланцюга або легкого ланцюга), або в якості кДНК, або в якості геномної організації з організацією екзону-нінтрону імуноглобуліну, - 3’-нетрансльованої області із сигнальною послідовністю поліаденілування, та - унікального сайту (сайтів) рестрикції з 3’-кінця. Гібридні гени, що включають послідовності важкого ланцюга вибраного антитіла, відповідно до описаного нижче, одержують методом ПЦР та/або генним синтезом та збирають відомими методами рекомбінації шляхом з’єднання відповідних сегментів нуклеїнової кислоти, наприклад, використовуючи унікальні сайти NsiI та EcoRI у геномних векторах важкого ланцюга. Субклоновані послідовності нуклеїнової кислоти вивіряють сиквенсом ДНК. Для тимчасової та стабільної трансфекції підвищені кількості плазмід одержують виділенням плазмід із трансформованих культур E. coli (колонка Nucleobond AX, фірма Macherey-Nagel). Методи культури клітин Стандартні методи культур клітин застосовують згідно з описом у кн.: «Current Protocols in Cell Biology», 2000, під ред. Bonifacino J.S., Dasso M., Harford J.B., Lippincott-Schwartz J. та Yamada K.M., вид-во John Wiley & Sons, Inc. Короткочасні трансфекції в системі HEK293-F Антитіла одержують короткочасною трансфекцією двох плазмід, що кодують важкий або модифікований важкий ланцюги, відповідно, та відповідний легкий ланцюг, використовуючи систему HEK293-F (фірма Invitrogen) за інструкцією виробника. Якщо коротко, то клітини HEK293-F (фірма Invitrogen), що ростуть у суспензії, або в качалочній колбі, або у ферментері з перемішуванням у середовищі для експресії без сироватки FreeStyle 293 (фірма Invitrogen), трансфекують сумішшю двох відповідних експресуючих плазмід, а також 293фектину або фектину (фірма Invitrogen). Наприклад, качалочні колби об’ємом 2 л (фірма Corning) засівають 6 клітинами HEK293-F щільністю 1,0×10 клітин/мл в 600 мл та інкубують при 120 об/хв, 8 % CO 2. 6 Через добу після трансфекції при щільності клітин приблизно 1,5×10 клітин/мл приблизно з 42 мл суміші A) 20 мл Opti-MEM (фірма Invitrogen) з 600 мкг сумарної плазмідної ДНК (1 мкг/мл), що кодує важкий або модифікований важкий ланцюг, відповідно, та відповідний легкий ланцюг в еквімолярному співвідношенні та Б) 20 мл Opti-MEM + 1,2 мл 293фектину або фектину (2 мкл/мл). У міру споживання глюкози додають розчин глюкози протягом курсу ферментації. Супернатант, що містить секретоване антитіло, збирають через 5 - 10 діб та антитіла або очищають прямо із супернатанту, або супернатант заморожують та зберігають. Визначення білка Концентрацію білка очищених антитіл та їх похідних визначають за оптичною щільністю (ОП) при 280 нм, використовуючи коефіцієнт молярної екстинкції, розрахований на основі амінокислотної послідовності за Pace C.N. та інш., Protein Science, 4, 1995, сс. 2411-1423. Визначення концентрації антитіл у супернатантах Концентрацію антитіл та їх похідних у супернатантах культури клітин оцінюють за імунопреципітації із застосуванням агарозних гранул з білком А (фірма Roche). 60 мкл агарозних гранул з білком А промивають тричі за допомогою TBS-NP40 (50 мМ Tris, pH 7,5, 150 мМ NaCl, 1% Nonidet-P40). Потім 1-15 мл супернатантів культури клітин наносять на агарозні гранули з білком А, попередньо врівноважені в TBS-NP40. Після інкубації протягом 1 год при кімнатній температурі гранули промивають у колонці Ultrafree-MС-filter (фірма Amicon) 17 UA 103912 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 однократно за допомогою 0,5 мл TBS-NP40, двічі за допомогою 0,5 мл 2× фосфатно-сольового буферу (2×ФСБ, фірма Roche) та чотири рази швидко промивають 0,5 мл 100 мМ Na цитрату ® рH 5,0. Зв'язане антитіло елююють додаванням 35 мкл буферу для зразків NuPAGE LDS ® (фірма Invitrogen). Половину зразка комбінують із агентом NuPAGE , що відновлюють зразок, або зразок залишають невідновленим, відповідно, та нагрівають протягом 10 хв при ® температурі 70 °C. Потім 20 мкл наносять на 4 - 12 % NuPAGE Bis-Tris SDS-PAGE (фірма Invitrogen) (з буфером MOPS для методу SDS-PAGE під час відсутності відновлювача та з буфером MES з додаванням антиоксидантного рухливого буферу (фірма Invitrogen) для методу SDS-PAGE у присутності відновлювача) та зафарбовують кумассі синім. Концентрацію антитіл та їх похідних у супернатантах культур клітин вимірюють за допомогою хроматографії ВЕРХ із білком А. Якщо коротко, то супернатанти культур клітин, що містять антитіла та їх похідні, що несуть білок А, вносять у колонку HiTrap Protein A (фірма GE Healthcare) в 50 мМ K2HPO4, 300 мМ NaCl, pH 7,3 та елююють з матриксу за допомогою 50 мМ оцтової кислоти, pH 2,5, у системі ВЕРХ Dionex. Кількість елюйованого білка підраховують за поглинанням в УФ та за інтеграцією пікових областей. Очищене стандартне антитіло IgG1 слугує стандартом. В іншому варіанті концентрацію антитіл та їх похідних у супернатантах культур клітин вимірюють методом сендвич-IgG-ELISA. Якщо коротко, то 96-лункові планшети для мікротитрування StreptaWell High Bind Strepatavidin (фірма Roche) покривають у кількості 100 мкл/лунку біотинвльованої захопленої молекули антитіла проти IgG людини F(ab’)2 BI (фірма Dianova) у концентрації 0,1 мкг/мл протягом 1 год при кімнатній температурі або в іншому варіанті протягом ночі при температурі 4 °C та потім промивають тричі за допомогою 200 мкл/лунку ФСБ, 0,05 % Tween ( ФСБ-Твін (ФСБТ), фірма Sigma). По 100 мкл/лунку серійних розведень у ФСБ (фірма Sigma) супернатантів культур клітин, що містять відповідне антитіло, вносять у лунки та інкубують протягом 1-2 год на струшувачі для мікропланшетів при кімнатній температурі. Лунки промивають тричі за допомогою 200 мкл/лунку ФСБТ та зв'язане антитіло виявляють за допомогою 100 мкл F(ab‘)2POD (фірма Dianova) у концентрації 0,1 мкг/мл у якості виявляючого антитіла протягом 1-2 год на струшувачі для мікропланшетів при кімнатній температурі. Незв'язане виявляюче антитіло тричі промивають 200 мкл/лунку ФСБТ та зв'язане виявляюче антитіло виявляють додаванням 100 мкл ABTS/лунку. Поглинання визначають на спектрометрі Tecan Fluor при хвилі виміру 405 нм (контрольна довжина хвилі 492 нм). Очищення білка Білки очищають із відфільтрованих супернатантів клітин за стандартними протоколами. Якщо коротко, то антитіла вносять у колонку сефарози з білком А (фірма GE Healthcare) та промивають ФСБ. Елюцію антитіл проводять при кислій величині рН із наступною негайною нейтралізацією зразка. Агрегований білок відокремлюють від мономерних антитіл ексклюзійною хроматографією (Superdex 200, фірма GE Healthcare) в 20 мМ гістидині, 140 мМ NaCl, pH 6,0. Фракції мономерних антитіл поєднують, при необхідності концентрують, використовуючи, наприклад центрифугуючий концентратор MILLIPORE Amicon Ultra (30 MWCO) та зберігають при температцпі -80 °C. Частину зразків надають надалі для аналізу та опису білка, наприклад, методом SDS-PAGE, ексклюзійною хроматографією, мас-спектрометрією та визначенням ендотоксину (див. фіг. 2). Натрій додецил сульфат – поліакриламідний гель електрофорез (sodium dodecyl sulphate polyacrilamid gel electrophoresis – SDS-PAGE) ® Гель-систему NuPAGE заводської збірки (фірма Invitrogen) використовують за інструкцією ® ® виробника. Зокрема, використовують гелі 4 – 20 % NuPAGE Novex TRIS-Glycine Pre-Cast та рухливий буфер Novex® TRIS-Glycine SDS. (див., наприклад, фіг. 1). Відновлення зразків ® досягається додаванням відновлюючого зразок агента NuPAGE перед рухом у гелі. Аналітична ексклюзійна хроматографія Екслюзійну хроматографію для визначення агрегування та олігомерного стану антитіл проводять методом ВЕРХ. Якщо коротко, то очищені із застосуванням білка А антитіла вносять у колонку Tosoh TSKgel G3000SW в 300 мМ NaCl, 50 мМ KH 2PO4/K2HPO4, pH 7,5 у системі ВЕРХ Dionex або в колонку Superdex 200 (фірма GE Healthcare) в 2×ФСБ у систему ВЕРХ Dionex. Елюйований білок підраховують шляхом поглинання в УФ та інтеграції областей піків. У якості стандарту застосовують BioRad Gel Filtration Standard 151–1901. Мас-спектрометрія Загальну глікозовану масу антитіл визначають та підтверджують методом електро-спрей іонізуючої мас-спектрометрії (electrospray ionization mass spectrometry – ESI-MS). Якщо коротко, то 100 мкг очищених антитіл деглікозують за допомогою 50 мОд N-глікозидази F (PNGaseF, 18 UA 103912 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ProZyme) в 100 мМ KH2PO4/K2HPO4, pH 7 при температурі 37 °C протягом 12 - 24 год при концентрації білка до 2 мг/мл та потім обезсолюють за допомогою ВЕРХ на колонці Sephadex G25 (фірма GE Healthcare). Масу відповідних важкого та легкого ланцюгів визначають методом мас-спектрометрії з іонізацією електроспреєм (ESI-MS) після деглікозування та відновлення. Якщо коротко, то 50 мкг антитіла в 115 мкл інкубують з 60 мкл 1M TCEP та 50 мкл 8 M гуанідінію гідро хлориду, потім обезсолюють. Загальну масу та масу відновлених важкого та легкого ланцюгів визначають за допомогою ESI-MS у системі Q-Star Elite MS, обладнаної джерелом NanoMate. Оцінка зв'язування ANG-1 та ANG-2 медом ELISA Зв’язуючі властивості антитіл, спрямованих проти ANGPT (ангіопоетину-1 та ангіопоетину-2) оцінюють методом ELISA з білком повної довжини ангіопоетином-2-His (фірма R&D Systems #623-AN/CF або із самостійно отриманим матеріалом) або ангіопоетином -1-His (фірма R&D systems #923-AN). Для цього 96-лункові планшети (посилені прозорі планшети для мікротитрування з полістиролу Falcon або Nunc Maxisorb) покривають 100 мкл рекомбінантного ангіопоетину-1 або ангіопоетину-2 людини (без носія) у концентрації 1 мкг/мл у ФСБ (фірма Sigma) протягом 2 год при кімнатній температурі або протягом ночі при 4 °C. Лунки промивають тричі за допомогою 300 мкл ФСБT (0,2 % Tween 20) та блокують 200 мкл 2 % БСА 0,1% Tween 20 протягом 30 хв при кімнатній температурі, потім промивають тричі 300 мкл ФСБT. Додають по 100 мкл/лунку серійних розведень (від 40 пМ до 0,01 пМ) очищеного досліджуваного антитіла проти та в якості контролю антитіла MAb536 (Oliner J. та інш., Cancer Cell. Nov 6, 2004, сс. 507-516, US 2006/0122370) у ФСБ та інкубують протягом 1 год на струшувачі для мікропланшетів при кімнатній температурі. Лунки промивають тричі 300 мкл ФСБT (0,2 % Tween 20) та виявляють зв'язане антитіло за допомогою 100 мкл/лунку 0,1 мкг/мл F(ab‘) POD (фірма Biozol, номер у каталозі 206005) в 2 % БСА 0,1% Tween 20 у якості виявляючого антитіла протягом 1 год на струшувачі для мікропланшетів при кімнатній температурі. Незв'язане виявляюче антитіло відмивають тричі за допомогою 300 мкл/лунку ФСБT та зв'язане виявляюче антитіло виявляють додаванням 100 мкл ABTS/лунку. Поглинання визначають на спектрометрі Tecan Fluor при довжині хвилі 405 нм (контрольна довжина хвилі 492 нм). Визначення зв'язування ANG-2 методом BIACORE Зв'язування антитіл з антигеном, наприклад, ANG-2 людини, досліджують методом поверхневого плазмонного резонансу, використовуючи прилад BIACORE T100 (фірма GE Healthcare Biosciences AB, Упсала, Швеція). Якщо коротко, то для вимірів зв'язування козині поліклональні антитіла іммобілізують на чипі CM4 через амінну сполуку для презентації антитіл проти ANG-2 людини. Зв'язування вимірюють у буфері HBS (HBS-P: 10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 0,05 % Tween 20, pН 7,4), 25 °C. Очищений ANG-2-His (фірма R&D systems або очищення проводять самостійно) додають у різних концентраціях від 0,41 нМ до 200 нМ у розчин. Асоціацію вимірюють шляхом 3-хвилинної ін'єкції ANG-2; дисоціацію вимірюють промиванням поверхні чіпа буфером HBS протягом 5 хв, та величину KD оцінюють, використовуючи 1:1 модель зв'язування Ленгмюра. Через гетерогенність препарату ANG-2 можна не спостерігати зв'язування 1:1; таким чином, величини KD одержують тільки відносні оцінки. Дані по негативному контролю (наприклад, криві буферу) віднімають від кривих зразків для корекції зсуву системного вихідного рівня та для зменшення шуму сигналу. Для аналізу сенсограмм та для підрахунку даних по зв'язуванню застосовують програмне забезпечення Biacore T100 Evaluation Software, версія 1.1.1. В іншому варіанті антиген ANG-2 може бути захоплений з рівнем захоплення 2000 - 1700 КЕ через PentaHis антитіло (PentaHis-Ab без БСА, фірма Qiagen, номер у каталозі 34660), яке іммобілізоване на чипі CM5 шляхом амінного зв'язку ( без БСА) (див. нижче). Пригнічення зв'язування ANG-2 людини з Tie-2 (метод ELISA) Взаємодію методом ELISA проводять в 384-лункових планшетах для мікротитрувань (фірма MicroCoat, DE, номер у каталозі 464718) при кімнатній температурі. Після кожної стадії інкубування планшети тричі промивають буфером ФСБТ. Планшети ELISA покривають 0,5 мкг/мл білка Tie-2 (фірма R&D Systems, Великобританія, номер у каталозі 313-TI) протягом щонайменше 2 г. Потім лунки блокують ФСБ, збагаченим 0,2 % Tween-20 та 2 % БСА (фірма Roche Diagnostics Gmbh, DE) протягом 1 г. Розведення очищених антитіл у ФСБ інкубують разом з 0,2 мкг/мл ангіопоетином-2 людини (фірма R&D Systems, Великобританія, номер у каталозі 623AN) протягом 1 год при кімнатній температурі. Після промивання суміш 0,5 мкг/мл біотинільованого анти-ангіопоетин-2 клону BAM0981 (фірма R&D Systems, Великобританія) та розведеного 1:3000 стрептавідину HRP (фірма Roche Diagnostics GmbH, Делавер, номер у каталозі 11089153001) додають на 1 г. Потім планшети промивають 6 раз за допомогою ФСБТ. 19 UA 103912 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Планшети обробляють щойно приготовленим реагентом ABTS (фірма Roche Diagnostics GmbH, Делавер, буфер #204 530 001, таблетки #11 112 422 001) протягом 30 хв при кімнатній температурі. Поглинання вимірюють при 405 нм. Пригнічення зв'язування ANG-1 людини з Tie-2 (ELISA) Взаємодія методом ELISA проводять в 384-лункових планшетах для мікротитрувань (фірма MicroCoat, DE, номер у каталозі 464718) при кімнатній температурі. Після кожної стадії інкубування планшети промивають тричі буфером ФСБТ. Планшети ELISA покривають 0,5 мкг/мл білка Tie-2 (фірма R&D Systems, Великобританія, номер у каталозі 313-TI) протягом щонайменше 2 ч. Потім лунки блокують ФСБ, збагаченим 0,2% Tween-20 та 2% БСА (фірма Roche Diagnostics GmbH, DE) протягом 1 ч. Розведення очищених антитіл у ФСБ інкубують разом з 0,2 мкг/мл ангіопоетином-2 людини (фірма R&D Systems, Великобританія, номер у каталозі 923-AN/CF або отриманим самостійно) протягом 1 год при кімнатній температурі. Після промивання суміш 0,5 мкг/мл біотинільованого антитангіопоетинт1 клону (фірма R&D Systems, номер у каталозі BAF923) та розведеного 1:3000 стрептавідину HRP (фірма Roche Diagnostics GmbH, Делавер, номер у каталозі 11089153001) додають на 1 ч. Потім планшети промивають 6 раз за допомогою ФСБТ. Планшети обробляють щойно приготовленим реагентом ABTS (фірма Roche Diagnostics GmbH, Делавер, буфер #204 530 001, таблетки #11 112 422 001) протягом 30 хв при кімнатній температурі. Поглинання вимірюють при 405 нм. Одержання лінії клітин HEK293-Tie2 Для визначення інтерференції антитіл проти ангіопоетину-2 із стимулюємим ANGPT2 фосфолюванням Tie2 та зв'язуванням ANGPT2 з Tie2 на клітинах одержують рекомбінантну лінію клітин HEK293-Tie. Якщо коротко, то плазміду на основі pcDNA3 (RB22-pcDNA3 Topo hTie2), що кодує Tie2 людини повної довжини (SEQ ID 61) під контролем промотору CMV та маркер стійкості до неоміцину трансфекують, використовуючи Fugene (фірма Roche Applied Science) у якості реагенту трансфекції в клітини HEK293 (ATCC), та стійкі клітини відбирають на середовищі DMEM 10 % ФСТ, 500 мкг/мл G418. Окремі клони виділяють за допомогою циліндра для клонування та потім аналізують на наявність експресії Tie2 методом FACS. Клон 22 ідентифікують у якості клону з високою та стабільною експресією Tie2 при відсутності G418 (HEK293-Tie2 клон 22). HEK293-Tie2 клон 22 потім використовують для клітинних досліджень: дослідження індукованого ANGPT2 фосфолювання Tie2 та дослідження зв'язування клітинного ліганда ANGPT2. Дослідження індукованого ANGPT2 фосфолювання Tie2 Пригнічення індукованого ANGPT2 фосфолювання Tie2 антитілами ANGPT2 вимірюють у такий спосіб. HEK293-Tie2 клон 22 стимулюють із застосуванням ANGPT2 протягом 5 хв при відсутності або при наявності ANGPT2 антитіла та P-Tie2 підраховують методом сендвич ELISA. 5 Якщо коротко, то 2×10 клітин HEK293-Tie2 клону 22 на лунку вирощують протягом ночі в 96лункових планшетах для мікротитрування, покритих полі-D-лізином в 100 мкл DMEM, 10 % ФСТ, з 500 мкг/мл генетицину. Наступного дня ряд титрування антитіл ANGPT2 одержують у планшеті для мікротитрування (4-кратне концентрування, кінцевий обсяг 75 мкл/лунку, повтори) та перемішують із 75 мкл ANGPT2 (фірма R&D systems, номер у каталозі 623-AN) розведення (3,2 мкг/мл у якості розчину 4-х кратної концентрації). Антитіла та ANGPT2 попередньо інкубують протягом 15 хв при кімнатній температурі. 100 мкл вносять до клітин HEK293-Tie2 клону 22 (попередньо інкубованим протягом 5 хв із 1 мМ NaV3O4, фірма Sigma, номер у каталозі S6508) та інкубують протягом 5 хв при температурі 37 °C. Потім клітини промивають 200 мкл крижаного ФСБ + 1 мМ NaV3O4 на лунку та лізують додаванням 120 мкл лізуючого буферу (20 мМ Tris, pH 8,0, 137 мМ NaCl, 1 % NP-40, 10 % гліцерин, 2 мМ EDTA, 1 мМ NaV3O4, 1 мМ PMSF та 10 мкг/мл апротиніну) на лунку на льоду. Клітини лізують протягом 30 хв при температурі 4 °C на струшувачі для мікропланшетів для титрування при кімнатній температурі та 100 мкл лізату переносять безпосередньо в планшет для мікротитрування p-Tie2 ELISA (фірма R&D Systems, R&D #DY990) без попереднього центрифугування та без визначення сумарного білка. Кількості P-Tie2 підраховують за інструкціями виробника та величини IC50 по пригіченню визначають, використовуючи підключення XLfit4 аналізу для Excel (одна ділянка доза-відповідь, модель 205). Величини IC50 можуть співставлятись у рамках експерименту, але можуть варіюватись від експерименту до експерименту. Дослідження індукованого ANGPT2 фосфолювання Tie2 Пригнічення індукованого ANGPT1 фосфолювання Tie2 антитілами ANGPT1 вимірюють у такий спосіб. HEK293-Tie2 клон 22 стимулюють із застосуванням ANGPT1 протягом 5 хв при відсутності або при наявності ANGPT1 антитіла та P-Tie2 підраховують методом сендвич ELISA. 5 Якщо коротко, то 2×10 клітин HEK293-Tie2 клон 22 на лунку вирощують протягом ночі в 96лункових планшетах для мікротитрування, покритих полі-D-лізином в 100 мкл DMEM, 10 % ФСТ, 20 UA 103912 C2 5 10 15 20 25 30 35 500 мкг/мл генетицину. Наступного дня ряд титрування антитіл ANGPT1 одержують у планшеті для мікротитрування (4-кратне концентрування, кінцевий обсяг 75 мкл/лунку, повтори) та перемішують із 75 мкл ANGPT12 (фірма R&D Systems, номер у каталозі 923-AN) розведення (0,8 мкг/мл у якості розчину 4-х кратної концентрації). Антитіла та ANGPT1 попередньо інкубують протягом 15 хв при кімнатній температурі. 100 мкл вносять до клітин HEK293-Tie2 клон 22 (попередньо інкубованим протягом 5 хв із 1 мМ NaV3O4, фірма Sigma, номер у каталозі S6508) та інкубують протягом 5 хв при температурі 37 °C. Потім клітини промивають 200 мкл крижаного ФСБ + 1 мМ NaV3O4 на лунку та лізують додаванням 120 мкл лізуючого буферу (20 мМ Tris, pH 8,0, 137 мМ NaCl, 1 % NP-40, 10 % гліцерин, 2 мМ EDTA, 1 мМ NaV3O4, 1 мМ PMSF та 10 мкг/мл апротиніну) на лунку на льоду. Клітини лізують протягом 30 хв при 4 °C на струшувачі для мікропланшетів для титрування та 100 мкл лізату переносять безпосередньо в планшет для мікротитрування p-Tie2 ELISA (фірма R&D Systems, R&D #DY990) без попереднього центрифугування та без визначення сумарного білка. Кількості P-Tie2 підраховують за інструкціями виробника та величини IC50 по пригіченню визначають, використовуючи підключення XLfit4 аналізу для Excel (одна ділянка доза-відповідь, модель 205). Величини IC50 можуть зіставлятись в рамках експерименту, але можуть варіюватись від експерименту до експерименту. Приклад 1. Експресія та очищення моноклональних антитіл Ang2i-LC06, Ang2iLC07 та Ang2k-LC08 Легені та важкі ланцюги відповідних антитіл Ang2i-LC06, Ang2i-LC07 та Ang2k-LC08 конструюють у векторах експресії відповідно описаному вище. Важкий ланцюг та область каппа легкого ланцюга клонують у геномній касеті експресії, а область лямбда легкого ланцюга клонують у якості кДНК із інтроном A (фіг. 1Б). Плазміди ампліфікують в E. coli, очищають та потім трансфекують для короткочасної експресії рекомбінантних білків у клітинах HEK293-F (використовуючи систему FreeStyle 293 фірми Invitrogen). Через 7 діб супернатанти клітин HEK 293-F збирають, фільтрують та антитіла очищають за допомогою білка А та ексклюзійної хроматографії. Гомогенність усіх антитіл підтверджують методом SDS-PAGE в умовах відновлення та відсутності відновлення та аналітичною ексклюзійною хроматографією. В умовах відновлення (фіг. 1) важкі поліпептидні ланцюги антитіл чітко показують при аналізі методом SDS-PAGE, що молекулярна маса становить близько 50 кДа, що відповідає розрахунковим молекулярним масам, а легкі поліпептидні ланцюги антитіл чітко показують, що молекулярна маса становить близько 25 кДа, що відповідає розрахунковим молекулярним масам. Мас-спектрометрією підтверджують ідентичність очищених антитіл. Рівні експресії всіх конструкцій аналізують за допомогою ВЕРХ із білком А. Аналіз методом ексклюзійної хроматографії очищених антитіл. Усі антитіла одержують та описують аналітично за методикою, на зразок описаної вище. Дані ексклюзійної хроматографії SEC відповідних антитіл підсумовані нижче в таблиці. Ang2i_LC07 Ang2i_LC06 Ang2k_LC08 40 45 Ланцюг антитіла HC LC HC LC HC LC Теоретично Експериментально одержана SEC (%) розрахована маса (Да) маса (Да) середній пік 50343 50325 (pyro-Glu) 99,7% 22738 22720 (pyro-Glu) 50343 50325 (pyro-Glu) 99,8% 22620 22605 (pyro-Glu) 49544 49527 (pyro-Glu) 99,8% 22685 22667 (pyro-Glu) Приклад 2. Дослідження зв'язування методом ELISA з ANG-1 людини та ANG-2 людини Зв'язування антитіл Ang2i-LC06, Ang2i-LC07 та Ang2k-LC08 з ANG-1 людини та ANG-2 людини визначають описаним вище методом ELISA зв'язування ANG-1 або ANG-2. Якщо коротко, то аналіз типу ELISA заснований на іммобілізації ангіопоетину-1 або ангіопоетину-2 людини в планшеті для мікротитрування. Зв'язування антитіла, спрямованого проти іммобілізованого ANG-1 або ANG-2, вимірюють за допомогою (анти-IgG) антитіла з кон’югатом POD. Серії розведень антитіла дозволяють визначити величину концентрації EC50. У якості контролю анти-ANG-2 антитіло людини використовують антитіло MAb536 (Oliner та інш., Cancer Cell. Nov 6, 2004, сс. 507-516, US 2006/0122370). Певні концентрації EC50 підсумовані нижче в таблиці. 50 21 UA 103912 C2 Антитіло MAb536 Ang2i-LC06 Ang2i-LC07 Ang2i-LC08 5 10 Ang2iLC06 Ang2kLC08 MAb536 20 25 30 35 EC50 зв'язування hANG-2 133 нг/мл 84 нг/мл 3006 нг/мл 105 нг/мл Усі антитіла, що специфічно зв'язуються з ANG-2, MAb536 та Ang2k-LC08 також проявляють специфічне зв'язування з ANG-1, хоча Ang2i-LC06 та Ang2i-LC07 не зв'язуються специфічно з ANG-1, оскільки вони мають величину EC50 приблизно 8000 нг/мл (межа виявлення). Приклад 3. Зв'язування з ANG-2 методом Biacore Зв’язуючу спорідненість із ANGPT2 людини досліджують методом Biacore, описаним вище. Якщо коротко, то у цьому дослідженні захоплююче антитіло (анти-Fc) іммобілізують на поверхні чіпа Biacore, який захоплює та презентирує відповідне антитіло (наприклад, Ang2i-LC06). Ліганд (у цьому випадку ANGPT2) захоплюється з розчину. Спорідненість при такій взаємодії визначають при допущенні, що взаємодія відбувається при співвідношенні 1:1. З подробицями цього експерименту можна ознайомитись в загальному розділі методів. Величини спорідненості, встановлені для зв'язування ANGPT2 (KD), підсумовані в таблиці внизу. ANG-2 людини 15 EC50 зв'язування hANG-1 2538 нг/мл > 8000 нг/мл > 8000 нг/мл 4044 нг/мл Експеримент 1 Експеримент 2 Середнє значення (за двома експериментами 1+2) KD kd t(1/2)diss KD kd t(1/2)diss (пM) (1/сек) (хв) (пM) (1/сек) (хв) 7,16• 1,14• 11 161 21 102 -05 -04 10 10 1,61• 2,28• 16 72 27 51 -04 -04 10 10 1,44• 1,25• 29 80 29 92 -04 -04 10 10 KD (пM) t(1/2)diss (хв) 16 132 22 61 29 86 Антитіла Ang2i-LC06 та Ang2k зв'язуються з високою спорідненістю з ANGPT2. Приклад 4. Нейтралізація взаємодії ANGPT1/2-Tie2 (людини) Блокування взаємодії ANGPT-2 людини з Tie2 людини показано за допомогою рецепторної взаємодії ELISA. 384-лункові планшети Maxisorp (фірма Nunc) покривають 0,5 мкг/мл Tie2 людини (фірма R&D Systems, Великобританія, номер у каталозі 313-TI, або матеріал одержують самостійно) протягом 2 год при кімнатній температурі та блокують ФСБ, збагаченим 0,2 % Tween-20 та 2 % БСА (фірма Roche Diagnostics GmbH, Делавер) протягом 1 год при кімнатній температурі в умовах струшування. Тим часом розведення очищених антитіл у ФСБ інкубують разом з 0,2 мкг/мл ангіопоетину-1/2 людини (фірма R&D Systems, номер у каталозі 923-AN/CF, фірма R&D Systems, Великобританія, номер у каталозі 623-AN або матеріал одержують самостійно) протягом 1 год при кімнатній температурі. Після промивання суміш 0,5 мкг/мл біотинільованого анти-ангіопоетину-1/2 клону (фірма R&D Systems, номер у каталозі BAF923, фірма R&D Systems, номер у каталозі BAM0981, Великобританія) та розведеного стрептавідину HRP 1:3000 (фірма Roche Diagnostics GmbH, Делавер, номер у каталозі 11089153001) додають на 1 г. Потім планшети промивають 6 раз за допомогою ФСБT. Планшети обробляють щойно приготовленим реагентом ABTS (фірма Roche Diagnostics GmbH, DE, буфер з номером у каталозі 204 530 001, таблетки з номером у каталозі 11 112 422 001) протягом 30 хв при кімнатній температурі. Поглинання вимірюють при 405 нм. Одержані пригнічуючі концентрації підсумовані в наступній таблиці. Антитіло Ang2i-LC06 Ang2k-LC08 MAb536 Взаємодія ANGPT1/Tie2 методом ELISA > 100 нM 11 нM Немає даних Взаємодія ANGPT2/Tie2 методом ELISA 0,1 нM 0,17 нM 0,15 нM Представлена вище таблиця показує різні профілі селективності для двох антитіл – Ang2iLC06 та Ang2k-LC08. Антитіло Ang2i-LC06 є селективним у відношенні ANGPT2, а антитіло 22 UA 103912 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Ang2k-LC08 має перехресну реакційну здатність у відношенні ANGPT1/2 у відношенні пригічення взаємодії ANGPT1/2 Tie2. Приклад 5. Фосфолювання Tie2 Здатність ідентифікованих антитіл до ANGPT2 інтерферувати із ANGPT2- та ANGPT1опосередкованим фосфолюванням Tie2 визначають у дослідженнях індукованого під дією ANGPT2 та ANGPT1 фосфолювання Tie2, відповідно описаному вище. Схема дослідження представлена на фіг. 3. Обидва антитіла, Ang2i-LC06 та Ang2k-LC08, показують дозозалежну інтерференцію зі стимулюємим ANGPT2 фосфолюванням Tie2, що показано на фіг. 4, у порівнянні з величинами IC50. Антитіло Ang2i-LC06 інтерферує зі стимулюємим ANGPT2 фосфолюванням Tie2 з величиною IC50 приблизно 508 нг/мл та антитіло Ang2k-LC08 інтерферує зі стимулюємим ANGPT2 фосфолюванням Tie2 з величиною IC50 приблизно 499 нг/мл. Навпроти, тільки антитіло Ang2k-LC08 інтерферує зі стимулюємим ANGPT1 фосфолюванням Tie2 з величиною IC50 приблизно 391 нг/мл, причому Ang2i-LC06 не інтерферує із стимулюємим ANGPT2 фосфолюванням Tie2 у тому самому дослідженому діапазоні концентрацій (фіг. 5). Приклад 6. Ефективність in vivo. Вплив анти-ANGPT антитіл на ріст ксенотрансплантата Colo205 In vivo ефективність антитіл Ang2i-LC06 та Ang2k-LC08 у порівнянні з антитілом MAb536 у ступінчатій підшкірній моделі ксенотрансплантата Colo205 Очищені антитіла Ang2i-LC06 та Ang2k-LC08 порівнюють із антитілом MAb536 у ступінчатій підшкірній моделі ксенотрансплантата Colo205 (Ang2_PZ_Colo205_006) у самок бежевих мишей лінії Scid. Антитіла Антитіло MAb536 одержують у вигляді замороженого вихідного розчину (концентрація = 4,5 мг/мл), Ang2i-LC06 та Ang2k-LC08 одержують у вигляді замороженого вихідного розчину (концентрація = 1 мг/мл) в 20 мМ гістидині, 140 мМ NaCl, pH 6,0. Розчин антитіла був розведений відповідним чином у ФСБ із вихідного розчину перед проведенням ін'єкцій у тих випадках, коли це потрібно, та ФСБ використовували в якості розчинника. Гуманізоване IgG1 анти-IgE антитіло Xolair (продукт Omalizumab) виступає в якості контролю та було куплено в аптеці. Лінії клітин та умови культивування Клітини раку кишечнику людини лінії Colo205 первісно одержують із колекції АТСС та після розмноження депонують у внутрішньому банку клітин фірми Roche Penzberg. Пухлинні клітини звичайним чином культивують у середовищі RPMI 1640 (PAA, Laboratories, Австрія), збагаченої 10 % фетальної сироватки теляти (PAA Laboratories, Австрія) та 2 мМ L-глютаміну при 37 °C у вологій атмосфері при вмісті СО2 5 %. Третє пересівання культури використовують для трансплантації. Тварини Самок бежевих мишей лінії SCID (фірма Charles River, Німеччина) витримують у специфічних умовах без патогенів при добовому циклі 12 год світла/12 год темряви згідно з ухваленими нормами (GV-Solas; Felasa; TierschG). Протокол експериментальних умов був розглянутий та схвалений місцевою владою. Після отримання тварин їх витримують у карантинному відсіку приміщення для тварин протягом одному тижня для звикання до нового середовища та для спостереження. Постійний моніторинг дихання проводять на регулярній основі. Дієтичний корм (Provimi Kliba 3337) та воду (підкислену до величини pH 2,5-3) надають за потребою. На початку дослідження вік тварин становить приблизно 12-14 тижнів. Моніторинг У тварин щодня перевіряють клінічні симптоми та виявляють побічні ефекти. Для моніторингу по мірі проведення експерименту визначають масу тіла тварин та обсяг пухлин за допомогою циркуля після визначення стадії захворювання. Ін'єкція пухлинних клітин У день проведення ін'єкції збирають пухлинні клітини лінії Colo205 за допомогою центрифугування, промивають однократно та ресуспендують у ФСБ. Після додаткового промивання за допомогою ФСБ, визначають концентрацію клітин та розмір клітин, використовуючи лічильник клітин та систему аналізу (Vi-CELL, Beckman Coulter). Для ін'єкції 7 клітин Colo205 кінцевий титр доводять до 5,0×10 клітин/мл, життєздатність клітин приблизно 90 6 %. Потім 100 мкл такої суспензії, що відповідає 2,5×10 клітин на тварину, вводять підшкірно в правий бік миші. Лікування тварин 23 UA 103912 C2 Лікування тварин починають у день рандомізування, через 16 діб після трансплантації клітин 3 (дослідження Ang2_PZ_Colo205_006) при середньому об’ємі пухлини 178 мм . Схема дозування при дослідженні Ang2_PZ_Colo205_006: Група 1 25 30 35 40 45 10 5 20 10 4 15 10 3 10 10 2 5 Кількість тварин 10 Сполука Доза (мг/кг) 5 Внутрішньобрюшинно, раз на тиждень 10 Число обробок Внутрішньобрюшинно, раз на тиждень Розчинник Контрольне антитіло Xolair Антитіло Ang2i-LC06 Антитіло Ang2k-LC08 Антитіло MAB536 Комулятивна доза (мг/кг) Спосіб введення 5 50 5 50 5 50 5 50 Внутрішньобрюшинно, раз на тиждень Внутрішньобрюшинно, раз на тиждень Внутрішньобрюшинно, раз на тиждень 10 10 10 Пригнічення росту пухлин до 50 діб показано на фіг. 6. Ці дані показують, що антитіло Ang2iLC06, селективне у відношенні ANGPT2, є найбільш сильно діючим антитілом (величина ступеню знищення пухлини (Tumor control ration – TCR) становить 0,39). Антитіло Ang2i-LC06 є більш ефективним в пригніченні росту пухлини, в порівнянні з антитілом MAb536 (TCR становить 0,47) та селективним у відношенні ANGPT2, перехресно-реакційноздатне ANGPT1 антитіло Ang2k-LC08 (TCR становить 0,46). Дія анти-ANGPT антитіл на ріст ксенотрансплантату KPL-4 In vivo ефективність антитіл Ang2i-LC06 та Ang2k-LC08 у порівнянні з MAb536 у ступінчатій ортотопічній моделі ксенотрансплантата KPL-4 Очищені антитіла Ang2i-LC06 та Ang2k-LC08 порівнюють із антитілом MAb536 у ступінчатій ортотопічній моделі ксенотрансплантата KPL-4 (Ang2_PZ_KPL-4_002) у самок бежевих мишей лінії Scid. Антитіла Антитіло MAb536 одержують у якості замороженого розчину (концентрація = 4,5 мг/мл), Ang2i-LC06 та Ang2k-LC08 одержують у якості замороженого розчину (концентрація = 1 мг/мл) в 20 мМ гістидині, 140 мМ NaCl, pH 6,0. Розчин антитіла розбавляють відповідним чином у ФСБ із вихідного розчину перед проведенням ін'єкцій у тих випадках, коли це потрібно, та ФСБ використовують у якості розчинника. Лінії клітин та умови культивування Клітини раку грудей людини KPL-4 первісно одержують зі злоякісної плевральної інфузії пацієнта з раком грудей із запальними метастазами шкіри. Клітини KPL-4 були люб'язно надані професором J. Kurebayashi (Kawasaki Medical School, Kurashiki, Японія). Пухлинні клітини звичайним чином культивують у середовищі DMEM (фірма PAN Biotech, Німеччина), збагаченої 10 % фетальної сироватки теляти (фірма PAN Biotech, Німеччина), та 2 мМ L-глютаміну (фірма PAN Biotech, Німеччина) при 37 °C у вологій атмосфері при вмісті СО 2 5 %. Пересівання культури проводять із трипсином/ EDTA 1× (PAN), розщеплюючи її тричі на тиждень. Тварини Самок бежевих мишей лінії SCID (фірма Charles River, Німеччина) витримують у специфічних умовах без патогенів при добовому циклі 12 год світла/12 год темряви згідно з ухваленими нормами (GV-Solas; Felasa; TierschG). Протокол експериментальних умов був розглянутий та схвалений місцевою владою. Після одержання тварин їх витримують у карантинному відсіку приміщення для тварин протягом одного тижня для звикання до нового середовища та для спостереження. Постійний моніторинг дихання проводять на регулярній основі. Дієтичний корм (Provimi Kliba 3337) та воду (підкислену до величини pH 2,5-3) надають за потребою. На початку дослідження вік тварин становить приблизно 12 тижнів. Моніторинг У тварин щодня перевіряють клінічні симптоми та виявляють побічні ефекти. По мірі проведення експерименту визначають масу тіла тварин та обсяг пухлин за допомогою циркуля після визначення стадії захворювання. Ін'єкція пухлинних клітин 24 UA 103912 C2 5 10 15 У день проведення ін'єкції збирають пухлинні клітини (трипсин-EDTA) із флаконів для культивування (фірма Greiner TriFlask) та переносять в 50 мл культурального середовища, промивають однократно та ресуспендують у ФСБ. Після стадії додаткового промивання у ФСБ ™ 8 та фільтрації (сито для клітин; Falcon ; 100 мкм) кінцевий титр клітин доводять до 1,5×10 /мл. Суспензію пухлинних клітин ретельно перемішують за допомогою піпетки, щоб уникнути агрегування клітин. Анестезію проводять, використовуючи блок для інгаляції Stephens для дрібних тварин у камері попереднього інкубування (із плексигласу), індивідуальні носові маски для мишей (із силікону) та не займисту і не вибухову анестезуючу сполуку ізофлуран (Pharmacia-Upjohn, Німеччина) у закритій системі циркуляції. За дві доби до проведення ін'єкції тваринам вистригають шерсть. Для ін'єкції усередину жирової подушки молочної залози клітини 6 вносять ін'єкцією ортотопічно об’ємом 20 мкл (3×10 клітин/тварину) кожній анестезованій миші в праву передостанню пахову жирову подушку молочної залози. Для ортотопічної імплантації суспензію клітин вносять ін'єкцією через шкіру під сосок, використовуючи шприц на мікролітр Hamilton та голку 30Gx1/2". Лікування тварин починають у день рандомізування при наявності пухлин, що варіюються у 3 розмірі від 60 до 180 мм , через 35 діб після трансплантації клітин (дослідження Ang2_PZ_KPL3 4_002) при середньому об’ємі пухлини приблизно 90 мм . Схема дозування при дослідженні Ang2_PZ_KPL-4_002: Група Кількість тварин 2 40 45 10 6 35 10 5 30 10 3 25 Доза (мг/кг) 10 Контрольне антитіло Xolair Антитіло Ang2iLC06 Антитіло Ang2k-LC08 Антитіло MAB536 Спосіб введення Внутрішньобрюшинно раз на тиждень Внутрішньобрюшинно раз на тиждень Внутрішньобрюшинно раз на тиждень Внутрішньобрюшинно раз на тиждень Внутрішньобрюшинно раз на тиждень Розчинник 1 20 Сполука 10 10 10 10 Число обробок Комулятивна доза (мг/кг) 5 5 50 5 50 5 50 5 50 Пригнічення росту пухлини до 64 діб показано на фіг. 7. Дані показують, що селективне антитіло Ang2i-LC06 проти ANGPT2 є найбільше сильно діючим антитілом (TCR становить 0,55) на моделі KPL-4. Антитіло Ang2i-LC06 є більш ефективним в пригніченні росту пухлини в порівнянні з антитілом MAb536 (TCR становить 0,57) та є селективним у відношенні ANGPT2, перехресно-реакційноздатне ANGPT1 антитіло Ang2k-LC08 (TCR становить 0,57). Приклад 7. Зв'язування з ANG-1 методом Biacore Зв’язуючу спорідненість із ANG-1 людини досліджують методом Biacore: huAng-1 іммобілізують на біосенсорному чипі CM5, використовуючи амінні хімічні зв'язки. Білок вводять ін'єкцією протягом 20 хв в ацетаті натрію, pH 4,5, при концентрації 10 мкг/мл при швидкості потоку 5 мкл/хв. Одержана на поверхні щільність становить приблизно 20000 КЕ. У контрольній проточній кюветі БСА іммобілізують при тих же умовах. Антитіла розбавляють в HBS-P дo 100 нМ та вводять ін'єкцією протягом 3 хв (фаза асоціації). Після промивання рухливим буфером протягом 3 хв (фаза дисоціації) поверхню регенерують ін'єкцією 10 мМ натрію гідроксиду протягом 1 хв при швидкості 5 мкл/хв. Результати показані на фіг. 8: період 50 % повної дисоціації Ang2k_LC08 становить приблизно 50 сек, період 50 % повної дисоціації антитіла Ang2i_LC06 становить приблизно 5 сек, а Ang2i_LC10 не проявляє зв'язування з ANG-1. Приклад 8. Попередження метастаз/вторинних пухлин in vivo при первинних пухлинах а) Попередження метастаз/вторинних пухлин у мишей із ксенотрансплантатом первинних пухлин Colo205 Лінії клітин та умови культивування Клітини раку кишечнику людини Colo205, первісно одержують із АТСС та потім розмножують та депонують у внутрішньому банку клітин фірми Roche Penzberg. Лінію пухлинних клітин звичайним чином культивують у середовищі RPMI 1640 (PAA, Laboratories, Австрія), збагаченої 10 % фетальної сироватки теляти (фірма PAA Laboratories, Австрія) та 2 мМ L-глютаміну, при 37 °C у вологій атмосфері при вмісті СО2 5 %. Третє пересівання використовують для трансплантації. Тварини 25 UA 103912 C2 5 10 15 20 25 30 35 Самок бежевих мишей лінії SCID, вік 4-5 тижнів у момент одержання тварин (фірма Charles River, Німеччина), витримують у специфічних умовах без патогенів при добовому циклі 12 год світла/12 год темряви згідно з ухваленими нормами (GV-Solas; Felasa; TierschG). Протокол експериментальних умов був розглянутий та схвалений місцевою владою. Після отримання тварин їх витримують у карантинному відсіку приміщення для тварин протягом одного тижня для звикання до нового середовища та для спостереження. Постійний моніторинг дихання проводять на регулярній основі. Дієтичний корм (Provimi Kliba 3337) та воду (підкислену до величини pH 2,5-3) надають за потребою. На початку дослідження вік тварин становить приблизно 10 тижнів. Ін'єкція пухлинних клітин У день проведення ін'єкції збирають пухлинні клітини Colo205 (трипсин-EDTA) із флаконів для культивування (фірма Greiner TriFlask) та переносять в 50 мл культурального середовища, промивають однократно та ресуспендують у ФСБ. Після стадії додаткового промивання у ФСБ та фільтрації (сито для клітин; Falcon™; діаметр пор 100 мкм) кінцевий титр клітин доводять до 7 2,5×10 /мл. Суспензію пухлинних клітин ретельно перемішують за допомогою піпетки, щоб уникнути агрегування клітин. Потім суспензією клітин заповнюють туберкуліновий шприц об’ємом 1,0 мл (фірма Braun Melsungen), використовуючи широку голку (1,10 × 40 мм); для ін'єкції голку заміняють (на голку 0,45 × 25 мм) та для кожної ін'єкції використовують нову голку. Анестезію проводять, використовуючи блок для інгаляції Stephens для дрібних тварин у камері попереднього інкубування (із плексигласу), індивідуальні носові маски для мишей (із силікону) та не займисту та не вибухову анестезуючу сполуку ізофлуран (cp-pharma) у закритій системі циркуляції. За дві доби до проведення ін'єкції тваринам вистригають шерсть, при внесенні ін'єкцією клітин, шкіру анестезованих тварин ретельно відтягують анатомічним пінцетом та 100 6 мкл суспензії клітин (2,5×10 клітин) вколюють тваринам підшкірно в правий бік. Проводять моніторинг росту пухлин (дані не представлені). Моніторинг вторинних пухлин, наприклад, в легенях, шляхом підрахунку послідовностей Aluповторів людини Наприкінці дослідження (103 доба) у тварин із усіх груп видаляють легені. Якщо коротко, то зразки негайно переносять у рідкий азот. На наступній стадії із зразків виділяють сумарну ДНК за допомогою приладу MagNA Pure LC за інструкціями виробника. Специфічні праймери Aluповторів людини вибирають для селективної ампліфікації послідовностей Alu-повторів методом кількісної ПЦР (прилад LightCycler). (T. Schneider та інш., Clin. Exp. Metas. 19, 2002, сс. 571-582). Лікування тварин Лікування тварин авастином (10 мг/кг внутрішньобрюшинно раз на тиждень) починають через 14 діб після трансплантації клітин (дослідження Ang2_PZ_Colo205_008) при середньому 3 об’ємі пухлини 340 мм . Через 7 тижнів мишей рандомізують для наступної вторинної обробки, починаючи з 51 доби, сполуками, перерахованими в таблиці нижче. Другу обробку починають із 51 доби дослідження Ang2_PZ_Colo205_008. Група Кількість тварин 1 10 Сполука Доза (мг/кг) Авастин 10 2 10 Авастин 10 3 40 Внутрішньобрюшинно раз на тиждень Внутрішньобрюшинно раз на тиждень Внутрішньобрюшинно раз на тиждень Внутрішньобрюшинно раз на тиждень 10 LC06 + 10 LC06 Спосіб введення 10 Число обробок Комулятивна доза (мг/кг) 11 110 6 60 11 110 6 60 Результати попередження метастазування/ вторинних пухлин (у легенях) перелічені в таблиці нижче та показані на фіг. 9A 26 UA 103912 C2 Таблиця 1 Кількісна оцінка ДНК Alu-повторів людини в легких мишей, в яких є первинні пухлини Colo205, після лікування різними антитілами Середнє значення Серединне значення вибірки 5 10 15 20 25 30 35 40 Авастин 101 0,0264 102 5,6740 103 0,0307 104 0,0203 105 0,0215 106 0,0338 107 0,0075 108 0,0113 109 0,0087 110 0,0587 0,5893 0,0240 Авастин + Ang2i-LC06 201 0,0042 202 0,0044 203 0,0065 204 0,0081 205 0,0063 206 0,0061 207 0,0053 208 0,0506 209 0,0065 210 0,0160 0,0114 0,0064 Ang2i_LC06 301 0,0047 302 0,0055 303 0,0050 304 0,0064 305 0,0062 306 0,0066 307 0,0250 308 0,0062 309 0,0067 310 0,0064 0,0079 0,0063 Результати показують очевидно поліпшене попередження вторинних пухлин/метастаз антитілом ANG2i-LC06, у порівнянні з авастином. б) Попередження вторинних пухлин/метастаз у мишей із ксенотрансплантатами первинних пухлин KPL-4 Лінія пухлинних клітин Лінія клітин раку грудей людини KPL-4 (люб'язно надана професором J. Kurebayashi) первісно була одержана із злоякісної плевральної інфузії пацієнта з раком грудей із запальними метастазами шкіри. Клітини пухлини культивують звичайним чином у середовищі DMEM (фірма PAN Biotech, Німеччина), збагаченої 10 % фетальної сироватки теляти (фірма PAN Biotech, Німеччина), та 2 мМ L-глютаміну (фірма PAN Biotech, Німеччина) при 37 °C у вологій атмосфері при вмісті СО 2 5 %. Пересівання культури проводять із трипсином/ EDTA 1× (PAN), розщеплюючи її тричі на тиждень. Миші Після придбання мишей (самок бежевих мишей лінії SCID у віці 10-12 тижнів з масою тіла 18-20 г) на фірмі Charles River, Sulzfeld, Німеччина, їх витримують у карантинному відсіку приміщення для тварин протягом одного тижня для звикання до нового середовища та для спостереження. Постійний моніторинг дихання проводять на регулярній основі. Мишей тримають в SPF-умовах згідно з міжнародними правилами (GV-Solas; Felasa; TierschG) при добовому циклі 12 год світла/12 год темряви. Дієтичний корм (Provimi Kliba 3337) та воду (фільтровану) надають за потребою. Протокол експериментальних досліджень був розглянутий та схвалений місцевою владою (Regierung von Oberbayern; реєстраційний номер 211.2531.222/2003). Ін'єкція пухлинних клітин У день проведення ін'єкції збирають пухлинні клітини (трипсин-EDTA) із флаконів для культивування (фірма Greiner TriFlask) та переносять в 50 мл культурального середовища, промивають однократно та ресуспендують у ФСБ. Після стадії додаткового промивання у ФСБ та фільтрації (сито для клітин; Falcon™; діаметр 100 мкм) кінцевий титр клітин доводять до 8 1,5×10 /мл. Суспензію пухлинних клітин ретельно перемішують за допомогою піпетки, щоб уникнути агрегування клітин. Анестезію проводять, використовуючи блок для інгаляції Stephens для дрібних тварин у камері попереднього інкубування (із плексигласу), індивідуальні носові маски для мишей (із силікону) та не займисту та не вибухову анестезуючу сполуку ізофлуран (Pharmacia-Upjohn, Німеччина) у закритій системі циркуляції. За дві доби до проведення ін'єкції тваринам вистригають шерсть. Для ін'єкції усередину жирової подушки молочної залози, клітини вносять ін'єкцією ортотопічно об’ємом 20 мкл кожній анестезованій миші в праву передостанню пахову жирову подушку молочної залози. Для ортотопічної імплантації суспензію клітин вносять ін'єкцією через шкіру під сосок, використовуючи шприц на мікролітр Hamilton та голку 30Gx1/2". Проводять моніторинг росту первинних пухлин (дані не представлені). Моніторинг вторинних пухлин, наприклад, в легенях, шляхом підрахунку послідовностей Aluповторів людини 27 UA 103912 C2 5 Наприкінці дослідження (103 доба) у тварин із усіх груп видаляють легені. Якщо коротко, то зразки негайно переносять у рідкий азот. На наступній стадії із зразків виділяють сумарну ДНК за допомогою приладу MagNA Pure LC Instrument за інструкціями виробника. Специфічні праймери Alu-повторів людини вибирають для селективної ампліфікації послідовностей Aluповторів методом кількісноїПЦР (прилад LightCycler). (T. Schneider та інш., Clin. Exp. Metas. 19, 2002, сс. 571-582). Лікування тварин Лікування тварин починають через 35 діб після трансформації клітин при середньому об’ємі 3 пухлини 60-160 мм . Сполуки та схема дозування перелічені в таблиці нижче. 10 Група Кількість тварин 4 10 Розчинник 5 10 Контрольне антитіло Xolair 10 6 10 Ang2i_LC06 10 7 10 Ang2i_LC07 10 8 10 Ang2k_LC08 Сполука Доза (мг/кг) Спосіб введення Число обробок Внутрішньобрюшинно двічі на тиждень Внутрішньобрюшинно двічі на тиждень Внутрішньобрюшинно раз на тиждень Внутрішньобрюшинно раз на тиждень Внутрішньобрюшинно раз на тиждень Комулятивна доза (мг/кг) 5 5 50 4 40 4 40 4 40 Результати попередження метастаз/вторинних пухлин (у легенях) перелічені нижче в таблиці та представлені на фіг. 9Б Таблиця 2 Кількісна оцінка ДНК Alu-повторів людини в легких мишей, в яких є первинні пухлини KPL4, після лікування різними антитілами 0,0121 0,0143 Контрольне антитіло Xolair 201 0,0157 202 0,0516 203 0,0108 204 0,0148 205 0,0020 206 0,0340 207 0,0141 208 0,0422 209 0,0227 210 0,0383 0,0132 0,0192 0,0044 0,0072 0,0051 0,0205 0,0246 0,0098 0,0126 0,0086 Розчинник 101 102 103 104 0,0098 0,0090 0,0119 0,0405 106 107 0,0381 0,0281 109 110 Середнє значення Серединне значення вибірки 15 20 Ang2i_LC06 302 303 304 305 306 307 308 309 310 0,0076 0,0413 0,0042 0,0041 0,0093 0,0038 0,0044 0,0036 0,0094 Ang2i_LC07 401 402 403 404 405 406 407 408 409 410 0,0273 0,0060 0,0046 0,0164 0,0040 0,0044 0,0060 0,0174 0,0314 0,0083 Ang2i_LC08 501 502 503 504 505 506 507 508 509 540 0,0069 0,0261 0,0067 0,0044 0,0039 0,0051 0,0037 0,0037 0,0051 0,0200 Результати показують високо ефективне попередження вторинних пухлин/метастаз антитілами ANG2i-LC06, ANG2i-LC07, ANG2k-LC08. Приклад 9. Результати лікування ретинопатії Методи Щенят лінії C57/Bl6 перехресно виховують CD1 годуючі суки, та їх піддають впливу 75 % кисню між днями постнатального життя з P7 по P12 (камера контролю кисню PRO-OX 110, фірма Biospherix Ltd, Редфілд, Нью-Йорк), в результаті чого індукується знищення судин та відключення капілярів у центрі сітківки. Щенят і годуючих сук поміщають в умови нормальної атмосфери, що приводить до відносної гіпоксії та індукції неоваскуляризації. У день P13 28