Вірус, що викликає захворювання дихальних шляхів у чутливих до цього ссавців
Номер патенту: 93981
Опубліковано: 25.03.2011
Автори: Остерхаус Альбертус Домінікус Марселлінус Ерасмус, ван ден Хоген Бернадетта Герарда, Грун Ян, Фушьє Рональдус Адріанус Марія, Де Йонг Ян Корнеліус
Формула / Реферат
1. Ізольований РНК-вмісний вірус, з однонитковою антисмисловою РНК, істотно характерний для ссавців, (MPV) роду Metapneumovirus і належить до підсімейства Pneumovirinae сімейства Paramyxoviridae.
2. Ізольований РНК-вмісний метапневмовірус, з однонитковою антисмисловою РНК за п. 1, де РНК-вмісний метапневмовірус, з однонитковою антисмисловою РНК кодує білок N, який має щонайменше 91 % ідентичність амінокислотної послідовності з амінокислотною послідовністю білка N ізоляту MPV 00-1 або 99-1, як показано на Фіг. 20.
3. Вірус за п. 1 або 2, де вірус кодує білок N, який має амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 95 % ідентична білку N ізоляту I-2614.
4. Вірус за п. 1 або 2, де вказаний метапневмовірус являє собою метапневмовірус ссавців (MPV).
5. Вірус за п. 2 або 4, де вказаний метапневмовірус має послідовність нуклеїнової кислоти, яка містить відкриту рамку зчитування (ORF), яка кодує вірусний білок вказаного вірусу.
6. Вірус за п. 5, де вказану відкриту рамку зчитування вибирають з групи ORF, що кодують білки N, Р, М, SH, G і F.
7. Вірус за будь-яким з пп. 1-6, що містить нуклеїнову кислоту або її функціональний фрагмент, де нуклеїнова кислота або її фрагмент щонайменше на 90 % ідентичні послідовності, показаній на фігурі 6А, 6В, 6С.
8. Ізольований РНК-вмісний метапневмовірус, з однонитковою антисмисловою РНК за п. 1, який являє собою ізолят, депонований як І-2614 у CNCM, Institute Pasteur, Paris.
9. Вірус за п. 8, що виділяється у людей з захворюванням дихальних шляхів.
10. Виділена або рекомбінантна нуклеїнова кислота або її функціональний фрагмент, специфічний для MPV, що одержують з вірусу за будь-яким з пп. 1-9.
11. Вектор, що містить нуклеїнову кислоту за п. 10.
12. Клітина-хазяїн, що містить нуклеїнову кислоту за п. 10 або вектор за п. 11.
13. Виділена або рекомбінантна білкова молекула або її функціональний фрагмент, специфічний для MPV, що кодується нуклеїновою кислотою за п. 10.
14. Антиген, що містить білкову молекулу або її функціональний фрагмент, специфічний для MPV за п. 13.
15. Антитіло, специфічно направлене проти антигену за п. 14.
16. Спосіб ідентифікації вірусного ізоляту як MPV, що передбачає взаємодію вказаного вірусного ізоляту або його компонента з антитілом за п. 15 або нуклеїновою кислотою за п. 10.
17. Спосіб за п. 16, де вказаний MPV включає MPV людини.
18. Вірусний ізолят, що ідентифікується за допомогою способу за п. 16 або 17 як РНК-вмісний вірус ссавців, з однонитковою антисмисловою РНК роду Metapneumovirus і належить до підсімейства Pneumovirinae сімейства Paramyxoviridae.
19. Спосіб вірусологічної діагностики інфекції MPV у ссавця, що передбачає визначення присутності вірусного ізоляту або його компонента у зразку від вказаного ссавця за допомогою взаємодії вказаного зразка з нуклеїновою кислотою за п. 10 або антитілом за п. 15.
20. Спосіб серологічної діагностики інфекції MPV у ссавця, що передбачає визначення присутності специфічно направленого проти MPV антитіла або його компонента у зразку від вказаного ссавця за допомогою взаємодії вказаного зразка з білковою молекулою або її фрагментом за п. 13 або антигеном за п. 14.
21. Діагностичний набір для діагностики інфекції MPV, що містить вірус за будь-яким з пп. 1-9, нуклеїнову кислоту за п. 10, білкову молекулу або її фрагмент за п. 13, антиген за п. 14 і/або антитіло за п. 15.
22. Застосування вірусу за будь-яким з пп. 1-9 для одержання фармацевтичної композиції.
23. Застосування за п. 22 для одержання фармацевтичної композиції для лікування або профілактики інфекції MPV або для лікування або профілактики захворювань дихальних шляхів.
24. Фармацевтична композиція, що містить вірус за будь-яким з пп. 1-9, нуклеїнову кислоту за п. 10, вектор за п. 11, клітину-хазяїна за п. 12, білкову молекулу або її фрагмент за п. 13, антиген за п. 14 або антитіло за п. 15.
25. Спосіб лікування або профілактики інфекції MPV або лікування або профілактики захворювання дихальних шляхів, що передбачає введення суб'єкту фармацевтичної композиції за п. 24.
26. Спосіб за п. 25, де вказаний суб'єкт є людиною.
27. Спосіб одержання противірусного засобу, застосовного для лікування захворювання дихальних шляхів, який включає створення клітинної культури або експериментальної тварини, що містить вірус за будь-яким з пп. 1-9, вплив на вказану культуру або тварину противірусним засобом-кандидатом, визначення ефекту вказаного засобу на вказаний вірус або інфікування ним вказаної культури або тварини і вибір противірусного засобу бажаної дії.
28. Противірусний засіб, який одержують відповідно до способу за п. 27.
29. Застосування противірусного засобу за п. 28 для одержання фармацевтичної композиції.
30. Застосування за п. 29 для одержання фармацевтичної композиції.
31. Застосування за п. 30 для одержання фармацевтичної композиції для лікування захворювання дихальних шляхів або для лікування інфекції MPV.
32. Фармацевтична композиція, яка містить противірусний засіб за п. 28.
33. Спосіб лікування або профілактики інфекції MPV або захворювання дихальних шляхів, що передбачає введення суб'єкту фармацевтичної композиції за п. 32.
34. Спосіб за п. 33, де вказаний суб'єкт є людиною.
35. Спосіб для виявлення антитіла, направленого проти MPV ссавця, у зразку, що включає тестування вказаного зразка у діагностичному тесті, призначеному для виявлення антитіл, специфічних до APV.
36. Спосіб за п. 35, де вказаний тест включає імуноферментний аналіз (EIA).
Текст
1. Ізольований РНК-вмісний вірус, з однонитковою антисмисловою РНК, істотно характерний для ссавців, (MPV) роду Metapneumovirus і належить до підсімейства Pneumovirinae сімейства Paramyxoviridae. 2. Ізольований РНК-вмісний метапневмовірус, з однонитковою антисмисловою РНК за п. 1, де РНК-вмісний метапневмовірус, з однонитковою антисмисловою РНК кодує білок N, який має що UA (21) 2003087814 (22) 18.01.2002 (24) 25.03.2011 (86) PCT/NL02/00040, 18.01.2002 (31) 01200213.5 (32) 19.01.2001 (33) EP (31) 01203985.5 (32) 18.10.2001 (33) EP (46) 25.03.2011, Бюл.№ 6, 2011 р. (72) ДЕ ЙОНГ ЯН КОРНЕЛІУС, NL, ФУШЬЄ РОНАЛЬДУС АДРІАНУС МАРІЯ, NL, ВАН ДЕН ХОГЕН БЕРНАДЕТТА ГЕРАРДА, NL, ОСТЕРХАУС АЛЬБЕРТУС ДОМІНІКУС МАРСЕЛЛІНУС ЕРАСМУС, NL, ГРУН ЯН, NL (73) ВІРОНОВАТІВЕ Б.В., NL (56) WO A 0020600, 13.04.2000 FR A 2801607, 01.06.2001 SWALL; "Nucleoprotein" Database accession no. Q91F57 1 December 2001 (2001-12-01)-& DATABASE EBI [Online] SWALL; 1 May 2000 (200005-01) "Nucleocapsid protein" Database accession no. Q9QF48 SWALL; "Phosphoprotein" Database accession no. Q91KZ5 1 December 2001 (2001-12-01)-& DATABASE EBI [Online] SWALL; 1 May 2000 (200005-01) "Phosphoprotein" Database accession no. Q9QF47 SWALL; "Matrix protein" Database accession no. Q91F56 1 December 2001 (2001-12-01)-& DATABASE EBI [Online] SWALL; 1 November 1998 (1998-11-01) "Matrix protein" Database accession no. O90244 SWALL; "Fusion protein" Database accession no. Q91F55 1 December 2001 (2001-12-01)-& DATABASE EBI [Online] SWALL; 1 May 2000 (200005-01) "Fusion protein" Database accession no. Q9QDI1 SWALL; "RNA-dependent RNA polymerase" Database accession no. Q91L20 1 December 2001 (2001-12-01)-& DATABASE EBI [Online] SWALL; 1 May 1997 (1997-05-01) "RNA-dependent RNA polymerase" Database accession no. P87509 2 (19) 1 3 найменше 91 % ідентичність амінокислотної послідовності з амінокислотною послідовністю білка N ізоляту MPV 00-1 або 99-1, як показано на Фіг. 20. 3. Вірус за п. 1 або 2, де вірус кодує білок N, який має амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 95 % ідентична білку N ізоляту I-2614. 4. Вірус за п. 1 або 2, де вказаний метапневмовірус являє собою метапневмовірус ссавців (MPV). 5. Вірус за п. 2 або 4, де вказаний метапневмовірус має послідовність нуклеїнової кислоти, яка містить відкриту рамку зчитування (ORF), яка кодує вірусний білок вказаного вірусу. 6. Вірус за п. 5, де вказану відкриту рамку зчитування вибирають з групи ORF, що кодують білки N, Р, М, SH, G і F. 7. Вірус за будь-яким з пп. 1-6, що містить нуклеїнову кислоту або її функціональний фрагмент, де нуклеїнова кислота або її фрагмент щонайменше на 90 % ідентичні послідовності, показаній на фігурі 6А, 6В, 6С. 8. Ізольований РНК-вмісний метапневмовірус, з однонитковою антисмисловою РНК за п. 1, який являє собою ізолят, депонований як І-2614 у CNCM, Institute Pasteur, Paris. 9. Вірус за п. 8, що виділяється у людей з захворюванням дихальних шляхів. 10. Виділена або рекомбінантна нуклеїнова кислота або її функціональний фрагмент, специфічний для MPV, що одержують з вірусу за будь-яким з пп. 1-9. 11. Вектор, що містить нуклеїнову кислоту за п. 10. 12. Клітина-хазяїн, що містить нуклеїнову кислоту за п. 10 або вектор за п. 11. 13. Виділена або рекомбінантна білкова молекула або її функціональний фрагмент, специфічний для MPV, що кодується нуклеїновою кислотою за п. 10. 14. Антиген, що містить білкову молекулу або її функціональний фрагмент, специфічний для MPV за п. 13. 15. Антитіло, специфічно направлене проти антигену за п. 14. 16. Спосіб ідентифікації вірусного ізоляту як MPV, що передбачає взаємодію вказаного вірусного ізоляту або його компонента з антитілом за п. 15 або нуклеїновою кислотою за п. 10. 17. Спосіб за п. 16, де вказаний MPV включає MPV людини. 18. Вірусний ізолят, що ідентифікується за допомогою способу за п. 16 або 17 як РНК-вмісний вірус ссавців, з однонитковою антисмисловою РНК роду Metapneumovirus і належить до підсімейства Pneumovirinae сімейства Paramyxoviridae. 19. Спосіб вірусологічної діагностики інфекції MPV у ссавця, що передбачає визначення присутності вірусного ізоляту або його компонента у зразку від вказаного ссавця за допомогою взаємодії вказаного зразка з нуклеїновою кислотою за п. 10 або антитілом за п. 15. 20. Спосіб серологічної діагностики інфекції MPV у ссавця, що передбачає визначення присутності специфічно направленого проти MPV антитіла або 93981 4 його компонента у зразку від вказаного ссавця за допомогою взаємодії вказаного зразка з білковою молекулою або її фрагментом за п. 13 або антигеном за п. 14. 21. Діагностичний набір для діагностики інфекції MPV, що містить вірус за будь-яким з пп. 1-9, нуклеїнову кислоту за п. 10, білкову молекулу або її фрагмент за п. 13, антиген за п. 14 і/або антитіло за п. 15. 22. Застосування вірусу за будь-яким з пп. 1-9 для одержання фармацевтичної композиції. 23. Застосування за п. 22 для одержання фармацевтичної композиції для лікування або профілактики інфекції MPV або для лікування або профілактики захворювань дихальних шляхів. 24. Фармацевтична композиція, що містить вірус за будь-яким з пп. 1-9, нуклеїнову кислоту за п. 10, вектор за п. 11, клітину-хазяїна за п. 12, білкову молекулу або її фрагмент за п. 13, антиген за п. 14 або антитіло за п. 15.25. Спосіб лікування або профілактики інфекції MPV або лікування або профілактики захворювання дихальних шляхів, що передбачає введення суб'єкту фармацевтичної композиції за п. 24. 26. Спосіб за п. 25, де вказаний суб'єкт є людиною. 27. Спосіб одержання противірусного засобу, застосовного для лікування захворювання дихальних шляхів, який включає створення клітинної культури або експериментальної тварини, що містить вірус за будь-яким з пп. 1-9, вплив на вказану культуру або тварину противірусним засобом-кандидатом, визначення ефекту вказаного засобу на вказаний вірус або інфікування ним вказаної культури або тварини і вибір противірусного засобу бажаної дії. 28. Противірусний засіб, який одержують відповідно до способу за п. 27. 29. Застосування противірусного засобу за п. 28 для одержання фармацевтичної композиції. 30. Застосування за п. 29 для одержання фармацевтичної композиції. 31. Застосування за п. 30 для одержання фармацевтичної композиції для лікування захворювання дихальних шляхів або для лікування інфекції MPV. 32. Фармацевтична композиція, яка містить противірусний засіб за п. 28. 33. Спосіб лікування або профілактики інфекції MPV або захворювання дихальних шляхів, що передбачає введення суб'єкту фармацевтичної композиції за п. 32. 34. Спосіб за п. 33, де вказаний суб'єкт є людиною. 35. Спосіб для виявлення антитіла, направленого проти MPV ссавця, у зразку, що включає тестування вказаного зразка у діагностичному тесті, призначеному для виявлення антитіл, специфічних до APV. 36. Спосіб за п. 35, де вказаний тест включає імуноферментний аналіз (EIA). 5 Даний винахід відноситься до області вірусології. В останні десятиріччя було визначено декілька етіологічних збудників хвороб ссавців, особливо захворювань дихальних шляхів (RTI), особливо у людей7. Класичними етіологічними збудниками RTI у ссавців є респіраторно-синцитіальні віруси, що належать до роду Pneumovirus, виявлені у людей (hRSV) і жуйних, таких як велика рогата худоба або вівці (bRSV і/або oRSV). У RSV людини для визначення 2 антигенних підгруп hRSV використовують відмінності у зворотному аналізі перехресної нейтралізації, імунологічному аналізі реактивності білків G і нуклеотидних послідовностях гена G. У межах підгруп ідентичність амінокислотних послідовностей складає 94% (підгрупа А) і 98% (підгрупа В), тоді як виявлений рівень ідентичності амінокислотних послідовностей між підгрупами складає лише 53%. Додаткову різноманітність у підгрупах спостерігали, базуючись на застосуванні моноклональних антитіл, аналізах RT-PCR та аналізах захисту від РНКази. Віруси обох підгруп поширені у всьому світі і можуть зустрічатися під час одного сезону. Інфікування може відбуватися при наявності передіснуючого імунітету, а зміни антигенів не є суворо необхідними для виникнення повторного інфікування. [Див., наприклад, Sullender, W.M., Respiratory Syncytial Virus Genetic and Antigenic Diversity. Clinical Microbiology Reviews, 2000. 13(1): P.1-15; Collins, P.L., Mclntosh, K. and Chanock, R.M., Respiratory syncytial virus. Fields virology, ed. B.N. Knipe, Howley, P.M. 1996, Philadelphia: lippencott-raven. 1313-1351; Johnson, P.R., et al., The G glycoprotein of human respiratory syncytial viruses of subgroups A and B: extensive sequence divergence between antigenically related proteins. Proc Natl Acad Sci USA, 1987. 84(16): p. 5625-9; Collins, P.L., The molecular Biology of Human Respiratory Syncytial Virus (RSV) of the Genus Pneumovirus, in The Paramyxoviruses, D.W. Kingsbury, Editor. 1991, Plenum Press: New York. P.103-153]. Іншим класичним Pneumovirus є вірус пневмонії мишей (PVM), взагалі виявлений лише у лабораторних мишей. Однак, частину захворювань, які спостерігаються у ссавців, все ще не можна приписати відомим патогенним мікроорганізмам. Винахід відноситься до ізольованого вірусу, що містить РНК, з однонитковою антисмисловою РНК, істотно характерного для ссавців (MPV), що належить до підсімейства Pneumovirinae сімейства Paramyxoviridae і визначається як філогенетично відповідний роду Metapneumovirus. Вказаний вірус визначають як філогенетично відповідний роду Metapneumovirus за допомогою визначення нуклеотидної послідовності вказаного вірусу і перевірки її, наприклад, за допомогою філогенетичних аналізів, де будують дерева максимальної правдоподібності із застосуванням 100 умов ініціалізації і 3 перестановок, і знаходження її більш тісно філогенетично відповідною вірусному ізоляту, депонованому у CNCM, Paris як I-2614, ніж відповідною вірусному ізоляту пневмовірусу птахів (APV), також відомому як вірус ринотрахеїту індичок (TRTV), 93981 6 етіологічному збуднику ринотрахеїту птахів. Для вказаного філогенетичного аналізу найбільш корисно одержати нуклеотидну послідовність не-MPV, як зовнішню групу для порівняння, найбільш придатний ізолят для зовнішньої групи можна одержати з серотипу С пневмовірусу птахів (C-APV), як, наприклад, продемонстровано тут на фігурі 5. Хоча філогенетичні аналізи надають зручний спосіб визначення такого вірусу як MPV, тут представлено декілька інших, можливо більш прямих, хоча у чомусь більш зрозумілих способів ідентифікації вказаного вірусу або вірусних білків, або нуклеїнових кислот вказаного вірусу. Практично MPV можна ідентифікувати за допомогою встановлення процентів гомології вірусу, білків або нуклеїнових кислот при порівнянні з ізолятами, вірусними білками або нуклеїновими кислотами, ідентифікованими тут за послідовністю або внеском. Широко відомо, що вид вірусів, особливо вид РНК-вірусів, часто складає квазівид, де кластер вказаних вірусів виявляє гетерогенність серед його представників. Таким чином, чекають, що кожний ізолят може володіти дещо відмінним процентом спорідненості з одним із різних ізолятів, як представлено тут. За бажанням порівняти з депонованим вірусом I-2614, винахід являє собою ізольований вірус, що містить РНК, з однонитковою антисмисловою РНК, істотно характерний для ссавців (MPV), що належить до підсімейства Pneumovirinae сімейства Paramyxoviridae і визначається як філогенетично відповідний роду Metapneumovirus за допомогою визначення амінокислотної послідовності вказаного вірусу і визначення того, що вказана амінокислотна послідовність володіє істотно більшим ступенем гомології амінокислот з вірусним ізолятом, депонованим у CNCM, Paris як I-2614, ніж представлені тут для білка L, білка М, білка N, білка Р або білка F, при порівнянні з APV-C або подібним; ізольований вірус, що містить РНК, з однонитковою антисмисловою РНК, істотно характерний для ссавців (MPV), який належить до підсімейства Pneumovirinae сімейства Paramyxoviridae, представляють як такий, що ідентифікується як філогенетично відповідний роду Metapneumovirus за допомогою визначення нуклеотидної послідовності вказаного вірусу і визначення того, що вказана нуклеотидна послідовність володіє істотно більшим ступенем ідентичності нуклеїнової кислоти з вірусним ізолятом, депонованим у CNCM, Paris як I-2614, ніж визначені тут нуклеїнові кислоти, які кодують білок L, білок М, білок N, білок Р або білок F, як тут визначено нижче, у порівнянні з APV-C. Знову ж, як правило, коли ізоляти або вірусні білки, або нуклеїнові кислоти ізолятів, які необхідно ідентифікувати, володіють процентами гомології, які попадають у межі процентів гомології, ідентифікованих тут для обох відокремлених груп, беручи як відповідні ізоляти для порівняння ізоляти 00-1 або 99-1, можна розглядати MPV як такий, що належить до однієї з двох ідентифікованих тут серологічних груп MPV. Однак коли проценти гомології нижче або коли необхідно у більшій мірі відрізнити вірусні ізоляти, наприклад, від APV-C, 7 краще звернутися до ідентифікованого тут філогенетичного аналізу. Знову ж треба мати на увазі, що при виборі інших ізолятів для визначення процентів гомології, вказані проценти можуть трохи змінюватися. Разом з даним MPV, винахід відноситься до діагностичних засобів і способів діагностики, і терапевтичних засобів і способів терапії для застосування у діагностиці і/або лікуванні захворювання, зокрема респіраторного захворювання, особливо ссавців, більш конкретно, людей. Однак, через, хоча і віддалену, генетичну спорідненість, істотно характерну для MPV ссавців з істотно характерною для APV птахів, зокрема з APV-C, винахід також відноситься до засобів і способів, застосовних для діагностики і лікування хвороби птахів. У вірусології найбільш рекомендованим є проведення діагностики і/або лікування конкретної вірусної інфекції реагентами, найбільш специфічними для вказаного конкретного вірусу, що викликає вказану інфекцію. У даному випадку це означає, що переважно проводити вказані діагностику і/або лікування інфекції MPV реагентами, найбільш специфічними для MPV. Однак це у жодному випадку не виключає можливості застосування менш специфічного, але достатньою мірою перехресно реагуючого агента, оскільки він, наприклад, легше доступний і достатньою мірою вирішує поставлену задачу. Саме це тут, наприклад, представлено для проведення вірусологічної і/або серологічної діагностики інфекцій MPV у ссавців реагентами, одержаними з APV, зокрема реагентами, одержаними з APV-C; тут у докладному описі, наприклад, показано, що досить надійний серологічний діагноз інфікування MPV у ссавців можна виконувати із застосуванням ELISA, конкретно призначеного для виявлення антитіл APV у птахів. Особливо застосовним для даної мети тестом є тест ELISA, призначений для визначення антитіл APV (наприклад, у сироватці або яєчному жовтку), комерційно доступна версія якого відома як APV-Ab SVANOVIR® і виготовляється SVANOVA Biotech AB, Uppsal Science Park Glunten SE-751 83 Uppsala Sweden. Зворотна ситуація також може мати місце: саме це тут представлено, наприклад, для проведення вірусологічної і/або серологічної діагностики інфекцій APV у ссавців реагентами, одержаними з MPV; тут, у докладному описі, наприклад, показано, що досить надійний серологічний діагноз інфекцій APV у птахів можна виконувати із застосуванням ELISA, призначеного для виявлення антитіл MPV. Беручи до уваги, що антигени і антитіла володіють зв'язком типу "ключ-замок", виявлення різних антигенів можна виконувати за допомогою вибору відповідного антитіла, яке володіє істотною перехресною реактивністю. Звичайно, для впевненості у такій перехресній реактивності, найкраще вибирати реагенти (такі як антигени або антитіла), керуючись гомологіями амінокислот, існуючими у різних (гліко)протеїнів різних вірусів, через що реагенти, які зв'язують більшість гомологічних білків, будуть найбільш застосовні у тестах, що залежать від вказаної перехресної реактивності. 93981 8 Для детекції нуклеїнової кислоти навіть простіше, замість підбору праймерів або зондів, які базуються на гетерологічних нуклеотидних послідовностях різних вірусів, що, таким чином, дозволяє виявити відмінності між вірусами Metapneumovirus, характерними для ссавців і птахів, підбирати або вибирати праймери або зонди, які базуються на тих ділянках нуклеотидних послідовностей, специфічних для вірусу, в яких показаний високий ступінь гомології. Загалом, для нуклеотидних послідовностей, гомологія 90% або вище гарантує достатню перехресну реактивність, щоб бути впевненим у діагностичних тестах, які застосовують жорсткі умови гібридизації. Винахід, наприклад, відноситься до способу для вірусологічної діагностики інфекції MPV тварин, конкретно ссавців, ще конкретніше людини, що включає визначення у зразках від вказаних тварин присутності вірусного ізоляту або його компонентів за допомогою реакції вказаного зразка з MPV-специфічною нуклеїновою кислотою або з антитілом за винаходом, і до способу серологічної діагностики інфекції MPV ссавців, що включає визначення у зразках від вказаних тварин присутності антитіла, специфічно направленого проти MPV або його компонента, за допомогою реакції вказаного зразка із специфічною для MPV білковою молекулою або її фрагментом або антигеном за винаходом. Також винахід відноситься до діагностичного набору для діагностики інфекції MPV, що включає MPV, специфічну для MPV нуклеїнову кислоту, білкову молекулу або її фрагмент, антиген і/або антитіло за винаходом, і, переважно, засіб для детекції вказаного MPV, специфічної для MPV нуклеїнової кислоти, білкової молекули або її фрагмента, антигену і/або антитіла, вказаний засіб, наприклад, включає легко збудливу групу, таку як флуорофор або систему ферментної детекції, що застосовується у даній області (приклади відповідного діагностичного набору включають IF, ELISA, аналіз нейтралізації, аналіз RT-PCR). Для визначення того, чи можна поки ще неідентифікований вірусний компонент або його синтетичний аналог, такий як нуклеїнова кислота, білкова молекула або їх фрагмент, ідентифікувати як специфічні для MPV, досить проаналізувати вказану нуклеотидну або амінокислотну послідовність, переважно, щонайменше з 10, більш переважно, щонайменше з 25, більш переважно з 40 нуклеотидів або амінокислот (відповідно), шляхом порівняння гомології послідовності з відомими послідовностями MPV або з відомими послідовностями не-MPV (переважно використовувати послідовності APV-C) із застосуванням, наприклад, філогенетичного аналізу, як представлено тут. Компонент або його синтетичний аналог можна ідентифікувати в залежності від ступеня спорідненості з вказаними послідовностями MPV або не-MPV. Винахід також відноситься до способу для вірусологічної діагностики інфекції MPV у ссавця, що включає визначення присутності вірусного ізоляту або його компонента у зразку від вказаного ссавця за допомогою взаємодії вказаного зразка з перехресно реагуючою нуклеїновою кислотою, 9 одержаною з APV (переважно серотип С), або з перехресно реагуючим антитілом, реактивним відносно вказаного APV, і до способу серологічної діагностики інфекції MPV у ссавця, що включає визначення у зразку від вказаного ссавця присутності перехресно реагуючого антитіла, також направленого проти APV або його компонента, за допомогою взаємодії вказаного зразка з білковою молекулою, або її фрагментом або антигеном, одержаним з APV. Більш того винахід відноситься до застосування діагностичного набору, спочатку призначеного для детекції APV або антитіл до APV, для діагностики інфекції MPV, конкретно для детекції вказаної інфекції MPV у людей. Винахід також відноситься до способу для вірусологічної діагностики інфекції APV у птаха, що включає визначення присутності вірусного ізоляту або його компонента у зразку від вказаного птаха за допомогою взаємодії вказаного зразка з перехресно реагуючою нуклеїновою кислотою, одержаною з MPV або з перехресно реагуючим антитілом, реактивним відносно вказаного MPV, і способу серологічної діагностики інфекції APV у птаха, що включає визначення у зразку від вказаного птаха присутності перехресно реагуючого антитіла, також направленого проти MPV або його компонента, за допомогою взаємодії вказаного зразка з білковою молекулою, або її фрагментом, або антигеном, одержаним з MPV. Більш того винахід відноситься до застосування діагностичного набору, спочатку призначеного для детекції MPV або антитіл до MPV, для діагностики інфекції APV, конкретно для детекції вказаної інфекції APV у домашньої птиці, такої як курка, качка або індичка. Як вказано, при лікуванні подібне застосування можна проводити через виявлену перехресну реактивність, зокрема, коли обставини роблять застосування більш гомологічного підходу менш простим. Наприклад, препаратами вакцин, одержаних з ізолятів APV (переважно серотип С), можна проводити невідкладні вакцинації, такі як екстрені вакцинації проти інфекцій MPV, коли більш гомологічна вакцина проти MPV недоступна і, навпаки, можна розглянути вакцинації проти інфекцій APV препаратами вакцин, одержаних з MPV. Також способи зворотної генетики роблять можливими створення химерних вірусних конструкцій APV-MPV, придатних як вакцина, досить відмінна від польових ізолятів кожного з відповідних штамів, яка підлягає атенуації до необхідного рівня. Подібні способи зворотної генетики також зроблять можливим одержання химерних параміксовірусних-метапневмовірусних конструкцій, таких як RSV-MPV або PI3-MPV, для застосування у препаратах вакцин. Такі конструкції особливо застосовні як сумісна вакцина для боротьби із захворюваннями дихальних шляхів. Таким чином, винахід відноситься до нового етіологічного збудника, ізольованого вірусу, що містить РНК, з однонитковою антисмисловою РНК, істотно характерного для ссавців (що також позначається тут як MPV), який належить до підсімейства Pneumovirinae сімейства Paramyxoviridae, але не ідентифікується як класичний пневмовірус, і належить до роду Metapneumovirus, і специфічних 93981 10 для MPV компонентів або їх синтетичних аналогів. До цього часу не знайдені віруси ссавців, подібні метапневмовірусам, наприклад, метапневмовіруси, що виділяються з ссавців, які, по суті, виступають як природні хазяї для вказаного вірусу, або викликають захворювання вказаних ссавців. Метапневмовіруси, що, загалом, розглядаються як по суті обмежені домашньою птицею як природним хазяїном або як етіологічний збудник їх захворювань, також відомі як пневмовіруси птахів. Останнім часом описаний ізолят APV качок (FR 2801607), який додатково демонструє, що інфекції APV істотно обмежені птахами як природними хазяями. Винахід відноситься до ізольованого пневмовірусу ссавців (що також називається тут MPV), з порядком генів і амінокислотною послідовністю, відмінними від порядку генів роду Pneumovirus і близькоспорідненого з родом Metapneumovirus підсімейства Pneumovirinae сімейства Paramyxoviridae, а, беручи до уваги їх філогенетичну спорідненість, можливо такого, що належить до нього. Хоча досі метапневмовіруси ізолювали лише з птахів, у наш час показано, що споріднені, хоча і відмінні за своєю природою, віруси можна ідентифікувати в інших видах тварин, таких як ссавці. Автори даного винаходу демонструють повторне виділення MPV у людей, незважаючи на те, що таких повідомлень для APV не існує. Більш того на відміну від APV, MPV, по суті, або зовсім не реплікується у курей та індичок, або реплікується погано, тоді як легко це робить у макаккрабоїдів. Повідомлень про реплікацію APV у ссавців не виявлено. Крім того, тоді як специфічні антисироватки, активовані проти MPV, нейтралізують MPV, антисироватки, активовані проти APV А, В або С, не нейтралізують MPV у тій же самій мірі, і дана відсутність повної перехресної реактивності являє собою інший доказ того, що MPV є особливим метапневмовірусом. Більш того там, де APV і MPV володіють однаковим порядком генів, білки G і білки SH MPV істотно відрізняються від таких, відомих для APV, внаслідок того, що для них не показано значимої гомології послідовності ні на рівні амінокислот, ні на рівні нуклеїнової кислоти. Діагностичні аналізи для розрізнення ізолятів APV і MPV, або антитіл, направлених проти даних різних вірусів, можна розробити, переважно взявши за основу один або обидва даних білки (прикладами є IF, ELISA, аналіз нейтралізації, аналіз RT-PCR). Однак, для розрізнення APV і MPV можна також застосовувати інформацію про послідовність і/або антигени, одержану з більш споріднених білків MPV N, P, M, F і L, і аналізи гомології послідовності відповідних білків APV. Наприклад, філогенетичні аналізи інформації про послідовність, одержану для MPV, виявили, що MPV і APV є двома різними вірусами. Зокрема, філогенетичне дерево демонструє, що APV і MPV є двома різними вірусними родами. Автори даного винаходу також показали, що MPV циркулює у популяції людей щонайменше 50 років, тому міжвидове перенесення, ймовірно, відбулося щонайменше 50 років тому і не є повсякденним явищем. Можливо через те, що СРЕ у MPV фактично невиразний від 11 СРЕ, викликаного hRSV або hPIV-1 в tMK або інших клітинних культурах, MPV досі вдавалося йти непоміченим. tMK (третинні клітини нирки мавпи, тобто клітини МК на третьому пасажі у клітинній культурі) переважно застосовують у зв'язку з їх малою вартістю у порівнянні з первинними або вторинними культурами. СРЕ, також як і для класичних Paramyxoviridae, характеризується утворенням синцитію, після чого клітини демонстрували швидке внутрішнє руйнування з подальшим їх відділенням від моношару. Звичайно (але не завжди) СРЕ виявляли у клітинах після трьох пасажів вірусу з оригінального матеріалу з 10 по 14 добу після інокуляції, трохи пізніше, ніж СРЕ, викликаний іншими вірусами, такими як hRSV або hPIV-1. Традиційно, як руйнівні збудники захворювання, параміксовіруси кожний рік служать причиною великої кількості летальних випадків у тварин і людей у всьому світі. Paramyxoviridae формують сімейство у порядку Mononegavirales (віруси, що містять РНК, з однонитковою антисмисловою РНК), яке складається з підсімейств Paramyxovirinae і Pneumovirinae. Останнє підсімейство у наш час таксономічно поділяють на роди Pneumovirus і Metapneumovirus1. Респіраторносинцитіальний вірус людини (hRSV), типовий вид роду Pneumovirus, є єдиною найбільш важливою причиною інфекцій нижніх дихальних шляхів у дитинстві або ранньому дитинстві у світі2. Інші представники роду Pneumovirus включають бичачий і овечий респіраторно-синцитіальні віруси і вірус пневмонії мишей (PVM). Пневмовірус птахів (APV), також відомий як вірус ринотрахеїту індичок (TRTV), етіологічний збудник ринотрахеїту птахів, інфекції верхніх дихальних шляхів індичок3, є єдиним представником нещодавно описаного роду Metapneumovirus, який, як вказано вище, досі не асоційований з інфекціями, або, найголовніше, із захворюванням ссавців. Серологічні підгрупи APV можна диференціювати на основі нуклеотидних або амінокислотних послідовностей глікопротеїну G і аналізу нейтралізації з використанням моноклональних антитіл, які також розпізнають глікопротеїн G. У підгрупах А, В і D ідентичність амінокислотної послідовності білків G у межах підгруп складає від 98,5% до 99,7%, тоді як ідентичність амінокислот між підгрупами спостерігали у межах 31,2-38%. [Див., наприклад, Collins, M.S., Gough, R.E. and Alexander, D.J., Antigenic differentiation of avian pneumovirus isolates using polyclonal antisera and mouse monoclonal antibodies. Avian Pathology, 1993. 22: p. 469-479.; Cook, J.K.A., Jones, B.V., Ellis, M.M., Antigenic differentiation of strains of turkey rhinotracheitis virus using monoclonal antibodies. Avian Pathology, 1993. 22: p. 257-273; Bäyon-Auboyer, M.H., et al., Nucleotide sequences of the F, L and G protein genes of two non-A/non-B avian pneumoviruses (APV) reveal a novel APV subgroup. J Gen Virol, 2000. 81 (Pt 11): p. 2723-33; Seal, B.S., Matrix protein gene nucleotide and predicted amino acid sequence demonstrate that the first US avian pneumovirus isolate is distinct from European strains. Virus Res, 1998. 58 (1-2): p.45-52; Bäyon-Auboyer, M.H., et al., Comparison of F-, G-and N-based RT 93981 12 PCR protocols with conventional virological procedures for the detection and typing of turkey rhinotracheitis virus. Arch Virol, 1999. 144 (6): p. 1091-109; Juhasz, K. and A.J. Easton, Extensive sequence variation in the attachment (G) protein gene of avian pneumovirus: evidence for two distinct subgroups. J Gen Virol, 1994. 75 (Pt 11): p. 2873-80. Додатковий серотип APV представлений у WO 0020600, в якому описаний ізолят APV Colorado і порівняний з відомими штамами APV або TRT за допомогою тестів нейтралізації сироватки in vitro. Спочатку ізолят Colorado тестували по відношенню до моноспецифічних поліклональних антисироваток для розпізнавання ізолятів TRT. Моноспецифічні поліклональні антисироватки до будьякого з ізолятів TRT не нейтралізували ізолят Colorado. Однак його нейтралізувала гіперімунна антисироватка, активована проти штаму підгрупи А. Дана антисироватка нейтралізувала гомологічний вірус при титрі 1:400, а ізолят Colorado - при титрі 1:80. Далі, із застосуванням вказаного вище способу, ізолят Colorado тестували відносно моноклональних антитіл до TRT. У кожному випадку, титр зворотної нейтралізації складав 104 TCID50. Для супернатантів інфікованої вірусом культуриклітин tMK не показана гемаглютинуюча активність з еритроцитами індички, курчат або морських свинок. Під час культивування на клітинах, що тестуються, реплікація вірусу здавалася залежною від трипсину. Дані комбіновані вірусологічні факти надали можливість таксономічно класифікувати знову ідентифікований вірус як представник сімейства Paramyxoviridae. Автори даного винаходу виділили РНК з клітин tMK, інфікованих 15 неідентифікованими вірусними ізолятами, для аналізів для зворотної транскрипції і полімеразної ланцюгової реакції (RT-PCR), що застосовують набори праймерів, специфічні для Pneumovirinae9, hPIV 1-4, вірусу Сендай, вірусу мавп типу 5, вірусу хвороби Ньюкасла, вірусів hRSV, кору, Nipah, Hendra, Tupaia і Mapuera. Аналізи RT-PCR проводили у м'яких умовах для того, щоб виявити можливі споріднені віруси, а РНК, ізольовану з гомологічних вірусних маткових розчинів, застосовували як контроль. Незважаючи на те, що доступні контролі виявляли позитивну реакцію з відповідними вірусоспецифічними праймерами, знову ідентифіковані вірусні ізоляти не реагували з будь-яким набором праймерів, що означало, що даний вірус не є близькоспорідненим для вірусів, які тестуються. Автори даного винаходу використовували супернатанти двох інфікованих вірусом клітинних культур tMK для інтраназальної інокуляції морським свинкам і тхорам. Сироватки цих тварин збирали на нульову добу, через два і три тижні після інокуляції. У тварин не виявили клінічних симптомів, але у всіх проходила сероконверсія, що вимірювали аналізами нейтралізації вірусу (VN) і непрямим IFA проти гомологічних вірусів. У непрямому IFA сироватки не реагували з жодним з відомих параміксовірусів, описаних вище, і з PVM. Далі, застосовуючи сироватки морських свинок і тхорів перед і після інфікування, автори даного винаходу скринували досі не ідентифіковані вірусні ізоляти, з яких 28 були безумовно позитивними при застосуванні непрямого IFA з сироватками після інфікування, це означало, що дані ізоляти серологічно близькоспоріднені або ідентичні. RAP PCR Для одержання інформації про послідовність невідомих вірусних ізолятів автори даного винаходу застосували стратегію ампліфікації PCR з випадковими праймерами, відомої як RAP-PCR10. З цією метою, клітини tMK інфікували одним з вірусних ізолятів (ізолят 00-1), а також hPIV-1, який служив контролем. Після того як в обох культурах 93981 34 виявили подібні рівні СРЕ вірус у супернатантах культур очистили на безперервних градієнтах 2060% сахарози. Фракції градієнта за допомогою ЕМ перевіряли на предмет наявності вірусоподібних частинок, і з фракції, де виявили нуклеокапсиди, що містить приблизно 50% сахарози, виділили РНК. Еквівалентні кількості РЕПС, ізольованої з обох вірусних фракцій, використовували у RAPPCR, після якої зразки, один поряд з іншим, розділяли у 3% агарозному гелі NuSieve. Потім з гелю очистили двадцять помітних смуг, специфічних для неідентифікованого вірусу, клону вали у плазміді pCR2.1 (Invitrogen) і визначили послідовність із застосуванням специфічних для вектора праймерів. Коли автори даного винаходу використовували дані послідовності для пошуку гомології з послідовностями у базі даних Genbank, застосовуючи програмне забезпечення BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), 10 з 20 фрагментів виявили подібність до послідовностей APV/TRTV. Дані 10 фрагментів розташовані у генах, що кодують нуклеопротеїн (N; фрагменти 1 і 2), матриксний білок (М; фрагмент 3), білок злиття (F; фрагменти 4, 5, 6, 7) і білок полімерази (L; фрагменти 8, 9, 10) (фігура 2). Далі автори даного винаходу підібрали праймери PCR для завершення визначення інформації про послідовність на 3'кінці вірусного геному, на основі фрагментів RAP PCR авторів даного винаходу, а також на опублікованих лідерних і кінцевих послідовностях для Pneumovirinae. Ампліфікували три фрагменти: фрагмент А охоплював крайній 3'-кінцевий відрізок відкритої рамки зчитування (ORF) для N, фрагмент В охоплював ORF для фосфопротеїну (Р), а фрагмент С перекривав проміжок між ORF для М і F (фігура 2). Аналізи послідовності даних трьох фрагментів виявили відсутність ORF для NS1 і NS2 на крайньому 3'-кінцевому відрізку вірусного геному і розташування ORF для F безпосередньо поряд з ORF для М. Дана організація геному має подібність до організації геному метапневмовірусу APV, що також узгоджується з гомологією послідовності. Сумарно, трансльовані послідовності ORF для N, Р, М і F продемонстрували в середньому 30-33% гомології з представниками роду Pneumovirus і 6668% з представниками роду Metapneumovirus. Для ORF для SH і G не виявили видимої гомології з обома з родів. Виявлені для N гомології амінокислот складають приблизно 40% з hRSV і 88% з APV-C, його найбільш близькими генетичними родичами, що, наприклад, можна вивести за допомогою порівняння амінокислотної послідовності фігури 3 з амінокислотною послідовністю відповідних білків N у інших вірусів. Амінокислотна послідовність Р володіє гомологією з hRSV у розмірі приблизно 25% і з APV-C - приблизно 66-68%, М з hRSV - приблизно 36-39% і з APV-C - приблизно 87-89%, F з hRSV - приблизно 40% і з APV-C приблизно 81%, М2-1 з пневмовірусами - приблизно 34-36% і з APV-C приблизно 84-86%, М2-2 з пневмовірусами - приблизно 15-17% і з APV-C приблизно 56%, а фрагменти, одержані для L з пневмовірусами, володіють в середньому 44% і з APV-C 64%. Філогенез 35 Хоча пошуки BLAST із застосуванням нуклеотидних послідовностей, одержаних з неідентифікованих вірусних ізолятів, виявили гомології головним чином з представниками Pneumovirinae, на основі гомології білкових послідовностей також виявлена деяка подібність до інших параміксовірусів (дані не показані). Як показник спорідненості між знову ідентифікованими вірусним ізолятом і представниками Pneumovirinae, на основі ORF для N, Р, М і F даних вірусів побудовані філогенетичні дерева. На всіх чотирьох філогенетичних деревах знову ідентифікований вірусний ізолят був найбільш близькоспорідненим з APV (фігура 4). З чотирьох описанних11 серотипів APV, серотип APV С, метапневмовірус, спочатку виявлений у птахів у США, виявив найбільш близьку відповідність із знову ідентифікованим вірусом. Однак необхідно зазначити, що для серотипу APV D доступна лише частина інформації про послідовність. Для встановлення спорідненості різних знову ідентифікованих авторами даного винаходу вірусних ізолятів, автори даного винаходу побудували філогенетичні дерева, базуючись на інформації про послідовність, одержану з 8-9 ізолятів (8 для F, 9 для N, М і L). З цією метою автори даного винаходу застосовували RT-PCR з праймерами, підібраними для ампліфікації коротких фрагментів ORF для N, M, F і L, для яких потім прямим способом визначили послідовність. Дев'ять вірусних ізолятів, які раніше визначили як споріднені за допомогою серологічних способів (див. вище), також визначили як споріднені генетично. Практично, всі дев'ять ізолятів виявилися більш близькоспорідненими один з одним, ніж з APV. Хоча використана для даних філогенетичних дерев інформація про послідовність була обмеженою, виявляється, що дев'ять ізолятів можна розділити на дві групи, де ізоляти 94-1, 99-1 і 99-2 об'єднуються в одну групу, а інші шість ізолятів (94-2; 93-1; 93-2; 93-3; 93-4; 00-1) - в іншу (фігура 5). Домінування серотипу Для вивчення домінування серотипу вірусу у популяції людей автори даного винаходу тестували сироватки людей різних вікових категорій за допомогою непрямого IFА, застосовуючи клітини tMK, інфіковані одним з неідентифікованих вірусних ізолятів. Даний аналіз виявив, що у 25% дітей між шістьма і дванадцятьма місяцями були присутніми антитіла до вірусу, а до віку 5 років майже 100% дітей виявилися серопозитивними. У результаті, 56 зразків сироватки, перевірених за допомогою непрямого IFА, тестували за допомогою аналізу VN. Для 51 (91%) зразка результати аналізу VN (титр >8) співпадають з одержаними непрямим IFA результатами (титр >32). Чотири зразки, які раніше за допомогою непрямого IFA визначили як позитивні, виявилися негативними при тесті VN (титр 32), при тесті VN виявилася позитивною (титр 16) (Таблиця 2). IFA, проведений з 72 сироватками, зібраними у людей в 1958 році (вік у діапазоні 8-99 років)12,27, виявив 100% домінування генотипу, вказуючи на те, що вірус циркулював у популяції людей більше ніж 40 років. Крім того, ряд даних сироваток засто 93981 36 совували в аналізі VN для підтвердження даних IFA (Таблиця 2). Генетичні аналізи генів N, М, Р і F виявили, що MPV володіє більш високою гомологією послідовності з раніше запропонованим родом Metapneumovirinae (в середньому 63%), ніж при порівнянні з родом Pneumovirinae (в середньому 30%), таким чином, демонструючи геномну організацію, подібну до APV/TRTV і подібну до нього. На відміну від геномної організації вірусів RSV ('3NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L-5'), у метапневмовірусів відсутні гени NS1 і NS2, а також відрізняється розташування генів між М і L ('3-N-P-M-F-M2SH-G-L-5'). Відсутність ORF між генами М і F у вірусних ізолятах авторів даного винаходу, відсутність NS1 і NS2, розташованих поблизу N, і виявлений високий ступінь гомології амінокислотної послідовності з APV є основами запропонувати класифікацію MPV, виділеного у людей як першого представника роду Metapneumovirus ссавців, зокрема людського походження. Філогенетичні аналізи виявили, що дев'ять ізолятів MPV, для яких одержана інформація про послідовність, є близькоспорідненими. Хоча інформація про послідовність була обмеженою, практично вони були більш близькоспорідненими один з одним, ніж з будь-яким з метапневмовірусів птахів. З чотирьох описаних серотипів APV, базуючись на генах N, Р, М і F, серотип С був найбільш близькоспорідненим з MPV. Однак слід зазначити, що у Genbank для гена F серотипу D доступною була лише частина послідовності, а для серотипу В доступними були лише послідовності генів М, N і F. Ізоляти MPV авторів даного винаходу формували два кластери на філогенетичних деревах. І для hRSV і для APV описані різні генетичні та серологічні підтипи. Чи являють собою два генетичних кластери ізолятів MPV також функціонально відмінні серологічні підгрупи, залишається у наш час невідомим. Серологічні спостереження авторів даного винаходу показали, що MPV є звичайним патогенним мікроорганізмом людини. Повторна ізоляція даного вірусу з клінічних зразків дітей з важкою RTI показує, що клінічний і економічний вплив MPV може бути високим. Нові діагностичні способи, які базуються на виявленні вірусу і серології, дозволять більш докладний аналіз сфери дії та клінічного і економічного впливу даного вірусного патогенного мікроорганізму. Незначна різниця результатів у IFA і VN (5 зразків) може являти собою наслідок того, що IFA детектує лише сироваткові IgG-антитіла, тоді як аналіз VN детектує обидва класи і підкласи антитіл, або різниця може бути наслідком різниці чутливості між даними двома аналізами. Для IFA застосовували крайнє значення 16, тоді як для VN-8. З іншого боку, різниця між аналізами IFA і VN може також означати можливу різницю між різними серотипами даного знову ідентифікованого вірусу. Оскільки здається, що MPV більше близькоспоріднений з APV, автори даного винаходу припускають, що вірус людини міг виникнути від птахів. Аналіз зразка сироватки, взятої у людей в 1958 році, виявив, що MPV був широко поширеним у популяції людей більше 40 років, вказуючи на те, 37 що передбачуваний випадок зоонозу повинен був відбутися задовго до 1958 року. Матеріали і методи Колекція зразків Протягом останніх десятиріч лабораторія авторів даного винаходу збирала назофарингеальні аспірати дітей, які страждають RTI, що стандартним чином перевіряли на предмет присутності вірусів. Всі назофарингеальні аспірати тестували за допомогою прямих імунофлуоресцентних аналізів (DIF), застосовуючи флуоресцентно мічені антитіла проти вірусів грипу типів А і В, hRSV і вірусу парагрипу людини (hPIV) типів 1-3. Назофарингеальні аспірати також обробляли для виділення вірусу, застосовуючи швидкі способи зняття оболонки14 на різних лініях клітин, включаючи клітини VERO, третинні клітини нирки макакикрабоїда (tMK), клітини епітелію легеня людини (HEL) і клітини нирки собаки Madin-Darby (MDCK). Зразки, в яких виявили цитопатичний ефект (СРЕ) після двох-трьох пасажів і які виявилися негативними у DIF, тестували за допомогою непрямого імунофлуоресцентного аналізу (IFA), застосовуючи антитіла, специфічні проти вірусу грипу типів А, В і С, hRSV типів А і В, вірусу кору, вірусу свинки, вірусу парагрипу людини (hPIV) типів 1-4, вірусу Сендай, мавпячого вірусу типу 5 і вірусу хвороби Ньюкасла. Хоча у багатьох випадках етіологічний агент не змогли ідентифікувати, деякі зразки виявилися негативними для всіх вірусів, що тестуються. Прямий імунофлуоресцентний аналіз (DIF) Назофарингеальні аспірати пацієнтів, які страждають RTI, використовували для DIF і виділення вірусу, як описано14,15. Зразки зберігали при -70°С. Коротко, назофарингеальні аспірати розводили 5 мл Dulbecco MEM (BioWhittaker, Walkersville, MD) і одну хвилину ретельно перемішували на пристрої типу "вортекс". Таким чином, суспензію центрифугували десять хвилин при 840х g. Осад розподіляли на предметному скельці для багатьох зразків (Nutacon, Leimuiden, The Netherlands), а супернатант використовували для виділення вірусу. Після сушіння, клітини 1 хвилину фіксували в ацетоні при кімнатній температурі. Після відмивання предметні скельця інкубували 15 хвилин при 37°С з комерційно доступними антисироватками, специфічними до вірусів, таких як грип А і В, hRSV і hPIV 1-3 (Dako, Glostrup, Denmark), міченими FITC. Після трьох відмивань у PBS і одного у проточній воді, предметні скельця поміщали у розчин гліцерин/PBS (Citifluor, UKC, Canterbury, UK) і покривали. Предметні скельця аналізували із застосуванням флуоресцентного мікроскопа Axioscop (Carl Zeiss B.V, Weesp, the Netherlands). Виділення вірусу Для виділення вірусу клітини tMK (RIVM, Bilthoven, The Netherlands) культивували у 24ямкових планшетах, що містять предметні скельця (Costar, Cambridge, UK), в описаному нижче середовищі, доповненому до 10% фетальною бичачою сироваткою (BioWhittaker, Vervier, Belgium). Перед інокуляцією планшети відмивали у PBS і заповнювали Eagle's MEM з сіллю Hanks (ICN, Costa mesa, СА), половину літра якої доповнили до 0,26 г 93981 38 NaHCO3, 0,25 М HEPES (Biowhittaker), 2 мМ Lглутаміну (Biowhittaker), 100 одиниць пеніциліну, 100 мкг стрептоміцину (Biowhittaker), 0,5 г молочного альбуміну (Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands), 1,0 г D-глюкози (Merck, Amsterdam, The Netherlands), 5,0 г пептону (Oxoid, Haarlem, The Netherlands) і 0,02% трипсину (Life Technologies, Bethesda, MD). Планшети інокулювали супернатантом зразків назофарингеального аспірату у розмірі 0,2 мл на кожну ямку по три ямки на зразок, з подальшим центрифугуванням одну годину при 840х g. Після інокуляції планшети інкубували максимум 14 діб при 37°С, змінюючи середовище один раз на тиждень і щодня контролюючи культури на предмет наявності СРЕ. Після 14 діб клітини зскрібали з другого пасажу та інкубували 14 діб. Даний крок повторили для третього пасажу. Предметні скельця використовували для демонстрації наявності вірусу за допомогою непрямого IFА, як описано нижче. Імунізація тварин Для знову виявлених вірусів одержали специфічні антисироватки тхорів і морських свинок за допомогою експериментального інтраназального інфікування двох тхорів і двох морських свинок, які не були інфіковані специфічним патогенним мікроорганізмом і знаходилися в окремих герметичних стерильних камерах з рукавичками. Через два-три тижні у всіх тварин забрали кров за допомогою серцевої пункції, і їх сироватки використовували як сироватки порівняння. Сироватки тестували на предмет наявності всіх раніше описаних вірусів за допомогою непрямого IFА, як описано нижче. Виявлення антигену за допомогою непрямого IFA Автори даного винаходу провели непрямий IFA на предметних скельцях, що містять інфіковані клітини tMK. Після відмивання у PBS предметні скельця інкубували 30 хвилин при 37°С з сироватками, специфічними до вірусу. У DIF автори даного винаходу використовували моноклональні антитіла проти грипу А, В і С, hPIV типів з 1 по 3 і hRSV, як описано вище. Для hPIV типу 4, вірусу свинки, вірусу кору, вірусу Сендай, мавпячого вірусу типу 5, вірусу хвороби Ньюкасла використовували поліклональні антитіла (RIVM) і сироватки порівняння тхорів і морських свинок. Після трьох відмивань у PBS і одного у проточній воді, предметні скельця забарвлювали вторинними антитілами, направленими проти сироваток, які застосовувалися у першій інкубації. Вторинні антитіла для поліклональних антисироваток являли собою антитіла кози проти антитіл тхора (KPL, Guilford, UK, розведені у 40 разів), антитіла миші проти антитіл кролика (Dako, Glostrup, Denmark, розведені у 20 разів), антитіла кролика проти антитіл курчат (KPL, розведені у 20 разів) і антитіла миші проти антитіл морських свинок (Dako, розведені у 20 разів). Предметні скельця обробляли, як описано для DIF. Виявлення антигену у людей за допомогою непрямого IFA Для виявлення антитіл, специфічних до вірусу, інфіковані клітини tMK фіксували охолодженим ацетоном на накривних скельцях, відмивали у PBS і забарвлювали зразками сироватки у розведенні 39 від 1 до 16. Далі, зразки забарвлювали 80-разово розведеними у PBS міченими FITC антитілами кролика проти антитіл людини (Dako). Предметні скельця обробляли, як описано вище. Культура вірусу MPV Субконфлуентний моношар клітин tMK у середовищі, як описано вище, інокулювали супернатантами зразків з зареєстрованим після другого або третього пасажу у 24-ямкових планшетах СРЕ. Культури щодня контролювали на предмет наявності СРЕ, а середовище змінювали один раз на тиждень. Оскільки у кожного ізоляту СРЕ відрізняється, всі культури з 12 по 14 добу перевіряли непрямим IFA з антитілами тхора проти нових вірусних ізолятів. Позитивні культури три рази піддавали заморожуванню-відтаванню, після чого очищали супернатанти за допомогою низькошвидкісного центрифугування, розділяли і зберігали замороженими при -70°С. Дози вірусу в одиницях 50% інфікування тканинних культур (TCID50) у супернатантах культур визначали, як описано16. Аналіз нейтралізації вірусу Аналізи VN проводили серійним дворазовим розведенням сироваток людини і тварин, починаючи з восьмиразового розведення. Розведені сироватки інкубували одну годину з 100 TCID50 вірусу перед інокуляцією клітин tMK, які ростуть у 96ямкових планшетах, після чого планшети центрифугували при 840х g. Середовище змінювали на третю і шосту добу, a IFA з антитілами тхора проти MPV проводили через 8 діб після інокуляції. Титр VN визначали як найбільше розведення зразка сироватки, що приводить до негативного результату в IFA та інгібує СРЕ у клітинних культурах. Характеристика вірусу Аналізи гемаглютинації і тести чутливості до хлороформу проводили, як описано раніше8,14. Для аналізів за допомогою ЕМ, вірус концентрували з супернатантів інфікованих клітинних культур у мікроцентрифузі при 4°С при 17000х g, після чого осад ресуспендували у PBS і перевіряли за допомогою негативної контрастної ЕМ. Для RAP-PCR вірус концентрували з інфікованих клітин tMK за допомогою ультрацентрифугування на подушці 60% сахарози (2 години при 150000х g, 4°C). Потім інтерфазу 60% сахарози розвели PBS і нашарували зверху на 20-60% безперервний градієнт сахарози, який центрифугували 16 годин при 275000х g при 4°С. Фракції градієнта сахарози перевіряли на предмет наявності вірусоподібних частинок за допомогою ЕМ та електрофорезу у поліакриламідному гелі із забарвлюванням сріблом. Приблизно 50% фракцій сахарози, в яких виявили наявність нуклеокапсидів, використовували для виділення РНК і RAP-PCR. Виділення РНК РНК виділяли із супернатантів інфікованих клітинних культур або фракцій сахарозного градієнта, застосовуючи набір High Pure RNA Isolation kit (Roche Diagnostics, Almere, The Netherlands) за інструкціями виробника. RT-PCR Вірусоспецифічні послідовності олігонуклеотидів для RT-PCR відомих параміксовірусів описані у додатку 1. Однокроковий RT-PCR проводили у 93981 40 50 мкл реакційній суміші, що містила 50 мМ TrisHCl pH 8,5, 50 мМ NaCl, 4 мМ MgCl2, 2 мМ дитіотреїтол, 200 мкМ кожного dNTP, 10 одиниць рекомбінантної RNAsin (Promega, Leiden, the Netherlands), 10 одиниць AMV RT (Promega, Leiden, The Netherlands), 5 одиниць Amplitaq Gold DNA polymerase (PE Biosystems, Nieuwerkerk aan de Ijssel, The Netherlands) і 5 мкл РНК. Умови циклу являли собою одноразову інкубацію 45 хв. при 42°С і 7 хв. при 95°С, повторені 40 разів 1 хв. при 95°С, 2 хв. при 42°С і 3 хв. при 72°С і одноразову інкубацію 10 хв. при 72°С. RAP-PCR RAP-PCR, по суті, проводили, як описано раніше10. Послідовності олігонуклеотидів описані у додатку 2. Для реакції RT2 мкл РНК використовували у 10 мкл реакційній суміші, що містить 10 нг/мкл олігонуклеотиду, 10 мМ дитіотреїтол, 500 мкм кожного dNTP, 25 мМ Tris-HCl pH 8,3, 75 мМ КС1 і 3 мМ MgCl2. Реакційну суміш інкубували 5 хв. при 70°С і 5 хв. при 37°С, після чого додали 200 одиниць Superscript RT enzyme (LifeTechnologies). Інкубація при 37°С продовжувалася 55 хв., а реакцію зупиняли за допомогою 5 хв. інкубації при 72°С. Суміш RT розчиняли для одержання 50 мкл реакційної суміші для PCR, що містить 8 нг/мкл олігонуклеотиду, 300 мкм кожного dNTP, 15 мМ Tris-HCl pH 8,3, 65 мМ КС1, 3 мМ MgCl2 і 5 одиниць ДНК-полімерази Taq (PE Biosystems). Умови циклу являли собою одноразову інкубацію 5 хв. при 94°С, 5 хв. при 40°С і 1 хв. при 72°С, з подальшими, повтореними 40 разів 1 хв. при 94°С, 2 хв. при 56°С і 1 хв. при 72°С і одноразову інкубацію 5 хв. при 72°С. Після RAP-PCR 15 мкл продукту RT-PCR один поряд з іншим розділили у 3% агарозному гелі NuSieve (FMC BioProducts, Heerhugowaard, The Netherlands). Фрагменти, що відрізняються, специфічні для MPV, очищали з гелю за допомогою набору Qiaquick Gel Extraction (Qiagen, Leusden, The Netherlands) і клонували у векторі pCR2.1 (Invitrogen, Groningen, The Netherlands) за інструкціями виробника. Аналіз послідовності Для продуктів RAP-PCR, клонованих у векторі pCR2.1 (Invitrogen), визначили послідовність із специфічними для М13 олігонуклеотидами. Фрагменти ДНК, одержані за допомогою RT-PCR, очищали з агарозного гелю за допомогою набору Qiaquick Gel Extraction (Qiagen, Leusden, The Netherlands) і визначали послідовність прямим способом з тими ж олігонуклеотидами, що і для PCR. Аналізи послідовності проводили із застосуванням набору Dyenamic ET terminator sequencing (Amersham Pharmacia Biotech, Roosendaal, The Netherlands) і автоматичного ДНК-секвенатора АВІ 373 (PE Biosystem). Всі способи проводили за інструкціями виробника. Одержання фрагментів геному MPV за допомогою RT-PCR Для одержання фрагментів PCR, що перекривають проміжки А, В і С між фрагментами RAPPCR (фігура 2), автори даного винаходу застосовували аналіз RT-PCR PHK, виділеної з вірусного 41 ізоляту 00-1, як описано раніше. Застосовували наступні праймери: Для фрагмента A: TR1 (5'AAAGAATTCACGAGAAAAAAACGC-3'), підібраний до лідерного кінця, і N1 (5'CTGTGGTCTCTAGTCCCACTTC-3'), підібраний до 3'-кінця фрагментів RAP-PCR, одержаних з N. Для фрагмента В: N2 (5'CATGCAAGCTTATGGGGC-3'), підібраний до 5'кінця фрагментів RAP-PCR, одержаних з N, і М1 (5'-CAGAGTGGTTATTGTCAGGGT-3'), підібраний до 3'-кінця фрагментів RAP-PCR, одержаних з М. Для фрагмента С: М2 (5'GTAGAACTAGGAGCATATG-3'), підібраний до 5'кінця фрагментів RAP-PCR, одержаних з М, і F1 (5'-TCCCCAATGTAGATACTGCTTC-3'), підібраний до 3'-кінця фрагментів RAP-PCR, одержаних з F. Фрагменти очищали з гелю, клонували і визначали послідовність, як описано раніше. RT-PCR для діагностики MPV Для ампліфікації і визначення послідовності частин ORF для N, M, F і L дев'яти з ізолятів MPV автори даного винаходу використовували праймери N3 (5'-GCACTCAAGAGATACCCTAG-31) і N4 (5'AGACTTTCTGCTTTGCTGCCTG-3'), ампліфікуючи фрагменти, що складаються з 151 нуклеотиду, М3 (5'-CCCTGACAATAACCACTCTG-3') і М4 (5'GCCAACTGATTTGGCTGAGCTC-3'), ампліфікуючи фрагмент, що складається з 252 нуклеотидів, F7 (5'-TGCACTATCTCCTCTTGGGGCTTTG-3') і F8 (5'TCAAAGCTGCTTGACACTGGCC-3'), ампліфікуючи фрагмент, що складається з 221 нуклеотиду і L6 (5'-CATGCCCACTATAAAAGGTCAG-3') і L7 (5'CACCCCAGTCTTTCTTGAAA-3'), ампліфікуючи фрагмент, що складається з 173 нуклеотидів, відповідно. RT-PCR, очищення з гелю і пряме визначення послідовності проводили, як описано вище. Крім того, використовували зонди: Зонд, що використовується для М: 5'TGCTTGTACTTCCCAAAG-3' Зонд, що використовується для N: 5'TATTTGAACAAAAAGTGT-3' Зонд, що використовується для L: 5'TGGTGTGGGATATTAACAG-3' Філогенетичні аналізи Для всіх філогенетичних дерев, послідовності ДНК вирівнювали із застосуванням програмного пакету ClustalW, а дерева максимальної правдоподібності одержували із застосуванням програмного пакету DNA-ML програмного забезпечення Phylip 3.5 із застосуванням 100 умов ініціалізації та 3 перестановок15. Для одержання філогенетичних дерев використовували раніше опубліковані послідовності, доступні у Genbank з номерами доступу: всі ORF: hRSV: NC001781; bRSV: NC001989; ORF для F: PVM, D11128; APV-A, D00850; APV-B, Y14292; APV-C, AF187152; ORF для N: PVM, D10331; APV-A, U39295; APV-B, U39296; APV-C, API76590; ORF для M: PMV, U66893; APV-A, X58639; APV-B, U37586; APV-C, AF262571; ORF для P: PVM, 09649; APV-A, U22110, APV-C, AF176591. Філогенетичні аналізи для дев'яти вірусних ізолятів MPV проводили зі штамом APV-C як зовнішньої групи. 93981 42 Абревіатури, що застосовуються на фігурах: hRSV: людський RSV; bRSV: бичачий RSV; PVM: вірус пневмонії мишей; APV-A, -В і -С: пневмовірус птахів, типи А, В і С. Приклади способів ідентифікації MPV Колекція зразків З метою виявлення вірусних ізолятів необхідно вивчати назофарингеальні аспірати, глоткові і назальні мазки, бронхоальвеолярні змиви переважно ссавців, таких як людина, м'ясоїдні (собаки, коти, куницеві, тюлені і т.п.), коні, жуйні (велика рогата худоба, вівці, кози і т.п.), свині, кролики, птахи (домашня птиця, страуси). У птахів також можна вивчати мазки з клоаки і послід. Для імунологічних аналізів, таких як ELISA і аналіз нейтралізації вірусу, необхідно збирати сироватки. Зібрані вірусні зразки розводили 5 мл середовища Dulbecco MEM (BioWhittaker, Walkersville, MD) одну хвилину ретельно перемішували на пристрої типу "вортекс". Таким чином, суспензію центрифугували десять хвилин при 840x g. Осад розподіляли на накривному скельці для багатьох зразків (Nutacon, Leimuiden, The Netherlands), а супернатант використовували для виділення вірусу. Виділення вірусу Для виділення вірусу, клітини tMK (RIVM, Bilthoven, The Netherlands) культивували у 24ямкових планшетах, що містять предметні скельця (Costar, Cambridge, UK), в описаному нижче середовищі, доповненому до 10% фетальною бичачою сироваткою (BioWhittaker, Vender, Belgium). Перед інокуляцією планшети відмивали у PBS і заповнювали Eagle's MEM з сіллю Hanks (ICN, Costa mesa, СА) доповненою до 0,52 г/л NaHCO3, 0,025 М HEPES (Biowhittaker), 2 мМ L-глутаміну (Biowhittaker), 200 одиниць/л пеніциліну, 200 мкг/л стрептоміцину (Biowhittaker), 1,0 г/л молочного альбуміну (Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands), 2,0 г/л D-глюкози (Merck, Amsterdam, The Netherlands), 10,0 г/л пептону (Oxoid, Haarlem, The Netherlands) і 0,02% трипсину (Life Technologies, Bethesda, MD). Планшети інокулювали супернатантом зразків назофарингеального аспірату у розмірі 0,2 мл на кожну ямку по три ямки на зразок, з подальшим центрифугуванням одну годину при 840х g. Після інокуляції планшети інкубували максимум 14 діб при 37°С, змінюючи середовище один раз на тиждень і щодня контролюючи культури на предмет наявності СРЕ. Після 14 діб клітини зскоблювали з другого пасажу та інкубували 14 діб. Даний крок повторили для третього пасажу. Предметні скельця використовували для демонстрації наявності вірусу за допомогою непрямого IFА, як описано нижче. СРЕ звичайно спостерігали після третього пасажу, з 8 по 14 добу в залежності від ізоляту. У tMK або інших клітинних культурах СРЕ практично не відрізнявся від СРЕ, викликаного hRSV або hPIV. Однак, hRSV індукує СРЕ, починаючи приблизно з 4 доби. СРЕ характеризувався утворенням синцитію, після чого клітини демонстрували швидке внутрішнє руйнування з подальшим їх відділенням від моношару. Для деяких ізолятів спостереження СРЕ являло собою ускладнення і, для 43 підтвердження присутності вірусу у даних культурах, застосовували IFА. Культура вірусу MPV Субконфлуентний моношар клітин tMK у середовищі, як описано вище, інокулювали супернатантами зразків із зареєстрованим після другого або третього пасажу у 24-ямкових планшетах СРЕ. Культури щодня контролювали на предмет наявності СРЕ, а середовище змінювали один раз на тиждень. Оскільки СРЕ відрізняється у кожного ізоляту, всі культури з 12 по 14 добу перевіряли непрямим IFA з антитілами тхора проти нових вірусних ізолятів. Позитивні культури три рази піддавали заморожуванню-відтаванню, після чого очищали супернатанти за допомогою низькошвидкісного центрифугування, розділяли і зберігали замороженими при -70°С. Дози вірусу 50% інфікування тканинних культур (TCID50) у супернатантах культур визначали, як описано16. Характеристика вірусу Аналізи гемаглютинації і тести чутливості до хлороформу проводили, дотримуючись добре відпрацьованих і описаних способів, які застосовуються у даній області14. Для аналізів за допомогою ЕМ, вірус концентрували із супернатантів інфікованих клітинних культур у мікроцентрифузі при 4°С при 17000х g, після чого осад ресуспендували у PBS і перевіряли за допомогою негативної контрастної ЕМ. Виявлення антигену за допомогою непрямого IFA Зібрані зразки обробляли, як описано, а осад зразків розподіляли на предметному скельці для багатьох зразків. Після сушіння, клітини 1 хвилину фіксували в ацетоні при кімнатній температурі. Альтернативно, вірус культивували на клітинах tMK у 24-ямкових напрямних, що містять предметні скельця. Дані предметні скельця відмивали у PBS і 1 хвилину фіксували в ацетоні при кімнатній температурі. Після відмивання у PBS предметні скельця інкубували ЗО хвилин при 37°С з поліклональними антитілами, розведеними у PBS від 1:50 до 1:100. Для одержання поліклональних антитіл автори даного винаходу використовували імунізованих тхорів і морських свинок, але дані антитіла можна активувати у інших ссавців, а робоче розведення поліклональних антитіл може варіювати для кожної імунізації. Після трьох відмивань у PBS і одного у проточній воді, предметні скельця інкубували 30 хвилин при 37°С з козячими антитілами проти антитіл тхора міченими FITC (KPL, Guilford, UK, розведені у 40 разів). Після трьох відмивань у PBS і одного у проточній воді предметні скельця поміщали у розчин гліцерин/PBS (Citifluor, UKC, Canterbury, UK) і покривали. Предметні скельця аналізували з застосуванням флуоресцентного мікроскопа Axioscop (Carl Zeiss B.V, Weesp, the Netherlands). Виявлення антитіл у людей, ссавців, жуйних або інших тварин за допомогою непрямого IFA Для виявлення специфічних для вірусу антитіл, інфіковані клітини tMK з MPV фіксували з ацетоном на накривних скельцях (як описано вище), відмивали у PBS та інкубували 30 хвилин при 37°С 93981 44 із зразками сироваток у розведенні від 1 до 16. Після двох відмивань у PBS і одного у проточній воді, предметні скельця інкубували 30 хвилин при 37°С з міченими FITC вторинними антитілами до виду (Dako). Предметні скельця обробляли, як описано вище. Антитіла можна мітити флуоресцентним барвником безпосередньо, що приведе до прямого імунофлуоресцентного аналізу. FITC можна замінити будь-яким флуоресцентним барвником. Імунізація тварин Для знову виявлених вірусів одержали специфічну антисироватку тхорів і морських свинок за допомогою експериментального інтраназального інфікування двох тхорів і двох морських свинок, які не були інфіковані специфічним патогенним мікроорганізмом і знаходилися в окремих герметичних стерильних камерах з рукавичками. Через два-три тижні у всіх тварин забрали кров за допомогою серцевої пункції та їх сироватки використали як сироватки порівняння. Сироватки тестували на предмет наявності всіх раніше описаних вірусів за допомогою непрямого IFA як описано нижче. Інші види тварин також підходять для одержання препаратів специфічних антитіл, а також можна застосовувати інші антигенні препарати. Аналіз нейтралізації вірусу Аналізи VN проводили серійними дворазовими розведеннями сироваток людини і тварин, починаючи з восьмиразового розведення. Перед інокуляцією клітин tMK, які ростуть у 96-ямкових планшетах, розведені сироватки інкубували одну годину з 100 TCID50 вірусу, після чого планшети центрифугували при 840х g. Застосовували те ж середовище, як і описане вище. Середовище змінювали на третю і шосту добу, a IFA проводили через 8 діб після (див. вище). Титр VN визначали як найбільше розведення зразка сироватки, що приводить до негативного результату в IFA та інгібує СРЕ у клітинних культурах. Виділення РНК РНК виділяли з супернатантів інфікованих клітинних культур або фракцій сахарозного градієнта, застосовуючи набір High Pure RNA Isolation, за інструкціями виробника (Roche Diagnostics, Almere, The Netherlands). РНК можна виділяти іншими способами, загальновідомими у даній області (Current Protocols in Molecular Biology). RT-PCR Однокроковий RT-PCR проводили у 50 мкл реакційній суміші, що містила 50 мМ Tris-HCl pH 8,5, 50 мМ NaCl, 4 мМ MgCl2, 2 мМ дитіотреїтол, 200 мкМ кожного dNTP, 10 одиниць рекомбінантної RNAsin (Promega, Leiden, the Netherlands), 10 одиниць AMV RT (Promega, Leiden, the Netherlands), 5 одиниць Amplitaq Gold DNA polymerase (PE Biosystems, Nieuwerkerk aan de Ijssel, The Netherlands) і 5 мкл РНК. Умови циклу являли собою одноразову інкубацію 45 хв. при 42°С і 7 хв. при 95°С, повторені 40 разів 1 хв. при 95°С, 2 хв. при 42°С і 3 хв. при 72°С і одноразову інкубацію 10 хв. при 72°С. Для діагностичної PCR застосовували наступні праймери: 45 Для нуклеопротеїну: N3 (5'GCACTCAAGAGATACCCTAG-3') і N4 (5'AGACTTTCTGCTTTGCTGCCTG-3'), ампліфікуючи фрагмент, що складається з 151 нуклеотиду. Для матриксного білка: М3 (5'CCCTGACAATAACCACTCTG-3') і М4 (5'GCCAACTGATTTGGCTGAGCTC-3'), ампліфікуючи фрагмент, що складається з 252 нуклеотидів. Для білка полімерази: L6 (5'CATGCCCACTATAAAAGGTCAG-3') і L7 (5'CACCCCAGTCTTTCTTGAAA-3'), ампліфікуючи фрагмент, що складається з 173 нуклеотидів. На основі послідовностей MPV можна підібрати інші праймери, а також, для конкретних цілей, можна використовувати інші буфери та умови аналізу. Аналіз послідовності Аналізи послідовності проводили із застосуванням набору Dyenamic ET terminator sequencing (Amersham Pharmacia Biotech, Roosendaal, The Netherlands) і автоматичного ДНК-секвенатора АВІ 373 (PE Biosystem). Всі способи проводили за інструкціями виробника. У фрагментів після PCR прямим способом визначили послідовність з тими ж олігонуклеотидами, що і для PCR або фрагменти очищали з гелю за допомогою набору Qiaquick Gel Extraction (Qiagen, Leusden, The Netherlands), клонували у векторі pCR2.1 (Invitrogen, Groningen, The Netherlands) за інструкціями виробника, а потім визначали послідовність із специфічними для М13 олігонуклеотидами. Олігонуклеотиди, що застосовуються для аналізу 3'-кінця геному (відсутність NS1/NS2) Базуючись на опублікованих Randhawa (1997) кінцевій та лідерній послідовностях hRSV і APV, підібрали праймер TR1 (5'AAAGAATTCACGAGAAAAAAACGC-3'), а, базуючись на одержаних для білка N послідовностях, підібрали праймер N1 (5'CTGTGGTCTCTAGTCCCACTTC-3'). Аналіз RTPCR і визначення послідовності проводили, як описано вище. Результатом RT-PCR був продукт довжиною приблизно 500 пар основ, який був дуже маленьким, щоб містити інформацію для двох ORF, а трансляція даних послідовностей не виявила ORF. Виявлення антитіл у людей, ссавців, жуйних та інших тварин за допомогою ELISA У Paramyxoviridae білок N є найбільш представленим білком, і імунна відповідь на цей білок при інфікуванні розвивається рано. З цих причин, для розробки аналізу ELISA для виявлення антитіла до MPV переважно застосовують рекомбінантне джерело білків N. Антигени, придатні для виявлення антитіла, включають будь-які білки MPV, що зв'язуються з будь-якими специфічними до MPV антитілами пацієнта, який зазнавав впливу вірусу MPV або інфікованого ним. Переважні антигени за винаходом включають антигени, які переважно породжують імунну відповідь у пацієнтів, які зазнавали впливу MPV, і які, тому, найбільш легко пізнають антитіла пацієнта. Особливо переважні антигени включають білки N, F і G з MPV. Антигени, що застосовуються в імунологічних способах, можуть бути нативними або модифікованими. Для зміни амінокислотної послідовності антигену MPV, 93981 46 з метою одержання модифікованого варіанту антигену, який можна використовувати в імунологічних способах, можна застосовувати загальновідомі способи молекулярної біології. Способи клонування генів, переміщення генів в експресуючі вектори та з них і експресії білка, що кодується геном у гетерологічному хазяїні, загальновідомі, і дані способи можна застосовувати для надання експресуючих векторів, клітин-хазяїв і клонованих для експресії генів, що кодують антигени у хазяїна для одержання рекомбінантних антигенів для використання у діагностичних аналізах. Див., наприклад, Molecular cloning, A laboratory manual and Current Protocols in Molecular Biology. Для одержання антигенів MPV можна застосовувати велику кількість експресуючих систем. Наприклад, для одержання білків в E.coli, B.subtilis, дріжджах, клітинах комах і ссавців описана велика кількість відповідних експресуючих векторів, будьякий з них можна застосовувати для одержання антигену MPV, придатного для виявлення антитіл проти MPV у пацієнтів, які зазнали впливу. Бакуловірусна експресуюча система володіє перевагою, надаючи необхідну обробку білків, і тому переважна. Система використовує промотор поліедрину для безпосередньої експресії антигенів MPV (Matsuura et al., 1987, J.Gen.Virol.68: 12331250). Антигени, які одержують за допомогою рекомбінантних бакуловірусів, можна застосовувати у великій кількості імунологічних аналізів для виявлення антитіл проти MPV у пацієнта. Доведено, що рекомбінантні антигени можна використовувати замість справжніх вірусів практично у будь-якому імунологічному аналізі для виявлення антитіл, специфічних до вірусу. Аналізи включають прямий і непрямий аналізи, сендвіч-аналізи, аналізи у твердій фазі, такі, поряд з іншими, як аналізи із застосуванням планшетів або бус і аналізи у рідкій фазі. Відповідні аналізи включають аналізи, в яких застосовують первинні і вторинні антитіла, і аналізи, в яких застосовують зв'язувальні реагенти, такі як білок А. Більш того, велика кількість способів виявлення, які можна застосовувати за винаходом, включають способи, що використовують колориметрію, флуоресценцію, фосфоресценцію, хемілюмінесценцію, люмінесценцію та радіоактивність. Приклад 1: непрямий ЕІА з IgG проти MPV із застосуванням білка N Застосовуючи білок N (що одержують за допомогою бакуловірусу у клітин Sf9 комах) як антиген, можна провести непрямий ЕІА з IgG. Для одержання антигену клітини Sf9 інфікували рекомбінантним бакуловірусом і збирали на 3-7 добу після інфікування. Клітинну суспензію двічі відмивали у PBS, рН 7,2, доводячи щільність клітин до 5,0105 клітин/мл, і три рази піддавали заморожуванню-відтаванню. Великі уламки клітин осаджували за допомогою низькошвидкісного центрифугування (15 хв. при 500х g), а супернатанти збирали і до застосування зберігали при -70°С. Неінфіковані клітини обробляли подібним чином для негативного контролю антигену. Для покриття планшетів для мікротитрування використовували 100 мкл лізату, обробленого за 47 морожуванням-відтаванням, у розведеннях у діапазоні від 1:50 до 1:1000. Неінфіковані клітинні лізати вносили у спарені ямки, де вони служили негативним контролем. Після нічної інкубації, планшети двічі відмивали у PBS/0,05% Tween. Тестові сироватки розводили у співвідношеннях від 1:50 до 1:200 у буфері для ELISA (PBS, доповнений до вмісту 2% нормальної козячої сироватки, 0,5% бичачого сироваткового альбуміну і 0,1% коров'ячого молока), з подальшою інкубацією ямки 1 годину при 37°С. Планшети двічі відмивали у PBS/0,05% Tween. В ямки додавали козячі IgG проти антитіл людини (або проти антитіл інших видів), мічені пероксидазою хрону і розведені у співвідношенні від 1:3000 до 1:5000 у буфері для ELISA, та інкубували 1 годину при 37°С. Планшети двічі відмивали у PBS/0,05% Tween і один раз у проточній воді, інкубували з субстратом ферменту ТМВ, 3,3',5,5'тетраметилбензидином, наприклад, одержаним з Sigma, 15 хвилин при кімнатній температурі і зупиняли реакцію 100 мкл 2 М фосфорної кислоти. Зчитування результату за допомогою колориметричного вимірювання проводили при 450 нм із застосуванням автоматичного пристрою для аналізу планшетів для мікротитрування. Приклад 2: ЕІА захоплення IgM проти MPV із застосуванням рекомбінантного нуклеопротеїну ЕІА захоплення IgM проти MPV із застосуванням рекомбінантного нуклеопротеїну або будьякого іншого рекомбінантного білка як антигену можна проводити за допомогою модифікації раніше описаних Erdman et al. (1990) J. Clin. Microb. 29: 1466-1471 аналізів. В ямки планшета для мікротитрування, в 0,1 М карбонатний буфер з рН 9,6, додавали афінноочищене захоплююче антитіло проти IgM людини (або проти антитіл інших видів), наприклад одержане з Dako у концентрації 250 нг на ямку. Після нічної інкубації при кімнатній температурі планшети двічі відмивали у PBS/0,05% Tween. 100 мкл тестової сироватки, розведеної у співвідношеннях від 1:200 до 1:1000 у буфері для ELISA, вносили в ямки з розрахунку три ямки на зразок та інкубували 1 годину при 37°С. Потім планшети двічі відмивали у PBS/0,05% Tween. Лізат клітин Sf21 (інфікований рекомбінантним вірусом), оброблений заморожуваннямвідтаванням і розведений у діапазоні від 1:100 до 1:500 у буфері для ELISA, внесли в ямки та інкубували 2 години при 37°С. Неінфікований лізат клітин служив негативним контролем, і його вносили у спарену ямку. Потім планшети тричі відмивали у PBS/0,05% Tween та інкубували з 100 мкл поліклональних антитіл проти MPV в оптимальному розведенні у буфері для ELISA 1 годину при 37°С. Після двох відмивань у PBS/0,05% Tween планшети інкубували з вторинними антитілами (такими як антитіла кролика проти антитіл тхора), міченими пероксидазою хрону 20 хвилин при 37°С. Потім планшети п'ять разів відмивали у PBS/0,05% Tween, інкубували з субстратом ферменту ТМВ, 3,3',5,5'-тетраметилбензидином, наприклад, одержаним з Sigma, 15 хвилин при кімнатній температурі і зупиняли реакцію 100 мкл 2 М 93981 48 фосфорної кислоти. Зчитування результату за допомогою колориметричного вимірювання проводили при 450 нм із застосуванням автоматичного пристрою для аналізу планшетів для мікротитрування. Чутливість ЕІА захоплення IgM проти MPV із застосуванням рекомбінантного нуклеопротеїну (або іншого рекомбінантного білка) і цілого вірусу MPV визначали шляхом порівняння пар сироваток пацієнтів з клінічною інфекцією MPV у гострій фазі та фазі одужання. Специфічність ЕІА захоплення рекомбінантного нуклеопротеїну визначали за допомогою тестування зразків сироватки здорових суб'єктів і суб'єктів з іншими видами параміксовірусної інфекції. Можливості ЕІА для використання білка злиття і глікопротеїну, що одержують експресією бакуловірусів Глікопротеїни G і F є двома трансмембранними оболонковими глікопротеїнами віріону MPV і являють собою головні антигени для нейтралізації і захисні антигени. Експресія даних глікопротеїнів у системі вірусного вектора, такій як бакуловірусна система, надає джерело рекомбінантних антигенів для застосування в аналізах виявлення антитіл, специфічних до MPV. Більш того їх застосування у комбінації з нуклеопротеїном, наприклад, додатково посилює чутливість ферментного імунологічного аналізу при виявленні антитіл проти MPV. Як альтернативні описаним тут способам можна застосовувати велику кількість інших імунологічних аналізів (Current Protocols in Immunology). Для того щоб виявити вірусні ізоляти, можна також вивчати назофарингеальні аспірати, глоткові та назальні мазки, бронхоальвеолярні змиви і глоткові мазки переважно людей, м'ясоїдних (собак, котів, тюленів і т.п.), коней, жуйних (великої рогатої худоби, овець, кіз і т.п.), свиней, кроликів, птахів (домашньої птиці, страусів), але не обмежуючись ними. У птахів також можна вивчати мазки з клоаки і послід. Для всіх прикладів для виявлення вірусу можна застосовувати серологічні способи (виявлення антитіла або антигену і т.п.), способи для виділення вірусу і способи для виявлення нуклеїнової кислоти. Моноклональні антитіла можна одержувати за допомогою імунізації мишей (або інших тварин) очищеним MPV або його частинами (білки, пептиди) з подальшим застосуванням добре розробленої гібридомної технології (Current Protocols in Immunology). Альтернативно, для даної мети можна застосовувати технологію фагового дисплея (Current Protocols in Immunology). Подібним чином поліклональні антитіла можна одержувати від інфікованих людей або тварин, або від імунізованих людей або тварин (Current Protocols in Immunology). Виявлення присутності або відсутності білків NS1 і NS2 можна проводити застосовуючи вестерн-блотинг, IFА, способи імунопреципітації з використанням великої кількості препаратів антитіл. Виявлення присутності або відсутності у вірусних ізолятах генів білків NS1 і/або NS2 або їх гомологів можна проводити, застосовуючи PCR з наборами праймерів підібраних на основі відомих 49 93981 генів NS1 і NS2, а також великою кількістю способів гібридизації нуклеїнової кислоти. Для визначення можливої присутності генів NS1 і NS2 на 3'-кінці вірусного геному можна проводити PCR з праймерами, специфічними до 3'кінця геному. У цьому випадку автори даного винаходу використовували праймер, специфічний до 3'-нетрансльованої ділянки вірусного геному і праймер до ORF для N. Для тієї ж мети можна підібрати інші праймери. Відсутність генів NS1/NS2 виявляють за допомогою визначення довжини і/або визначення послідовності продукту PCR. З метою зробити можливою позитивну ідентифікацію присутності генів NS1 або NS2 можна використовувати праймери, специфічні до генів NS1 і/або NS2, у комбінації з праймерами, специфічними до інших частин 3'-кінця вірусного геному (таких як ділянка, що не транслюється або ORF для N, М або F). Крім того, для тієї ж мети можна застосовувати велику кількість способів, таких як молекулярне клонування і гібридизація нуклеїнової кислоти. Приклад 3: Різні серотипи/підгрупи MPV За допомогою аналізів нуклеотидних послідовностей ORF для N, M, F і L 9 вірусних ізолятів виявлені два потенційних генних кластери. Ідентичність нуклеотидів у межах кластера спостерігали у розмірі 90-100%, а між підгрупами ідентичність спостерігали у межах 81-88%. Інформація про послідовність, одержана з великої кількості вірусних 50 ізолятів, підтвердила існування двох генотипів. Вірусний ізолят ned/00/01 як прототип для кластера А і вірусний ізолят ned/99/01 як прототип для кластера В використовували для аналізів перехресної нейтралізації для перевірки можливого зв'язку генотипів з різними серотипами або підгрупами. Результати Застосовуючи аналізи RT-PCR з праймерами, розташованими у ділянці гена полімерази, із зразків назофарингеальних аспіратів автори даного винаходу ідентифікували 30 додаткових вірусних ізолятів. Інформацію про послідовність частин генів матриксного білка і полімерази даних нових ізолятів, разом з інформацією про послідовність частин генів матриксного білка і полімерази попередніх 9 ізолятів використовували для конструювання філогенетичних дерев (фігура 16). Аналізи даних дерев підтвердили наявність двох генетичних кластерів, з вірусним ізолятом ned/00/01 як прототип для кластера А і вірусним ізолятом ned/99/01 як прототип для кластера В. Ідентичність нуклеотидної послідовності у межах груп складала більше ніж 92%, тоді як між кластерами ідентичність складала 81-85%. Вірусні ізоляти ned/00/01 і ned/99/01 використовували для інокуляції тхорам з метою активації вірусоспецифічних антисироваток. Дані антисироватки використовували в аналізах нейтралізації вірусу з обома вірусами. Таблиця 3 Титри нейтралізації вірусу Ізолят 00-1 2 64 2 4 Сироватка тхора до інокуляції А (00-1) Тхір А 22 dpi (00-1) Сироватка тхора до інокуляції В (00-1) Тхір В 22 dpi (00-1) Для ізоляту 00-1 титр відрізняється у 32 (64/2) рази. Для ізоляту 99-1 титр відрізняється у 16 (64/4) разів. Крім того, по 6 морських свинок інокулювали одним з вірусів (ned/00/01 і ned/99/01). Аналізи RT Ізолят 99-1 2 2 2 64 PCR зразків назофарингеальних аспіратів виявили реплікацію вірусу з 2 до 10 доби після інфікування. На 70 добу після інфікування у морських свинок провокували імунну відповідь як на гомологічний, так і гетерологічний вірус, і для всіх чотирьох випадків відмічена реплікація вірусу. Таблиця 4 Морська свинка 1-3 Морська свинка 4-6 Морська свинка 7-9 Морська свинка 10-12 Первинне інфікування 00-1 00-1 99-1 99-1 Реплікація вірусу 2з3 3з3 3з3 3з3 Вторинне інфікування 99-1 00-1 00-1 99-1 Реплікація вірусу 1з2 1з3 2з2 1з3 замітка: морських свинок 2 і 9 не піддавали вторинному інфікуванню Аналізи нейтралізації вірусу з антисироватками після першої провокації імунної відповіді виявили істотно подібні результати, як і в аналізах VN, що проводилися у тхорів (відмінність у титрі в VN >16 разів). Результати, представлені у даному прикладі підтверджують існування двох генотипів, відповідних двом серотипам MPV, і демонструють можливість повторного інфікування гетерологічним і гомологічним вірусами. 51 Приклад 4: Додаткове визначення послідовності Даний приклад описує додатковий аналіз послідовностей відкритих рамок зчитування (ORF) та міжгенних послідовностей у MPV, а також неповних послідовностей кінців геному. Аналізи послідовностей генів нуклеопротеїну (N), фосфопротеїну (Р), матриксного білка (М) і білка злиття (F) MPV виявляють найвищий ступінь гомології з серотипом С APV, пневмовірусом птахів, первинно виявленим у Сполучених Штатах. Дані аналізи також виявили відсутність неструктурних білків NS1 і NS2 на 3'-кінці вірусного геному і розташування білка злиття безпосередньо поряд з матриксним білком. Тут автори даного винаходу пропонують послідовності генів білка 22К (М2), малого гідрофобного білка (SH), білка прикріплення (G) і білка полімерази (L), послідовність міжгенних ділянок і кінцеву послідовність. У комбінації з послідовностями, описаними раніше, послідовності, що пропонуються тут, завершують послідовність геному MPV, за винятком крайніх 12-15 нуклеотидів кінців геному і визначають геномну організацію MPV. Попарне порівняння послідовностей геному MPV з послідовностями геномів підтипів А, В і С APV, підтипів А і В RSV, PVM та інших параміксовірусів являє собою вагомий доказ систематизації MPV у рід Metapneumovirus. Результати Стратегія визначення послідовності Ізолят MPV 00-1 (van den Hoogen et al., 2001) розмножували у третинних клітинах нирки мавпи (tMK), а РНК виділяли з супернатанту на 3 тижні після інокуляції і використовували як матрицю для аналізів RT-PCR. Праймери підібрали на основі інформації про часткову послідовність, доступну для MPV 00-1 (van den Hoogen et al., 2001), а також лідерну і кінцеву послідовності APV і RSV (Randhawa et al., 1997; Mink et al., 1991). Початково, за допомогою ампліфікації RT-PCR, одержали фрагменти між раніше одержаними продуктами, у діапазоні довжин від 500 п.н. до 4 т.п.н. і точно визначили послідовність. Геномну послідовність згодом підтвердили за допомогою одержання серії фрагментів RT-PCR, що перекриваються, у діапазоні від 500 до 800 п.н., що являють собою весь геном MPV. Для мінімізації помилок ампліфікації і визначення послідовності у всіх фрагментів PCR визначали точну послідовність обох ланцюгів. Нуклеотидну і амінокислотну послідовності застосовували для пошуку гомологій послідовності у базі даних Genbank із застосуванням програмного забезпечення BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Назви білків приписували відкритим рамкам зчитування (ORF) базуючись на гомології з відомими вірусними генами, а також на їх положенні у геномі. Базуючись на даній інформації, створили геномну карту MPV (фігура 7). Геном MPV складається з 13378 нуклеотидів і його організація подібна до геномної організації APV. Нижче автори даного винаходу представляють порівняння ORF і некодуючих послідовностей MPV і ORF та некодуючих послідовностей інших параміксовірусів та обговорюють основні подібності і відмінності. Ген нуклеопротеїну (N) 93981 52 Як показано, перший ген на геномній карті MPV кодує білок з 394 амінокислот і володіє великою гомологією з білком N інших параміксовірусів. Довжина ORF для N ідентична довжині ORF для N у APV-C (Таблиця 5) і менша ніж довжина ORF для N інших пневмовірусів (Ваrr et al., 1991). Аналіз амінокислотної послідовності виявив найвищу гомологію з APV-C (88%) і лише 7-11% з іншими параміксовірусами (Таблиця 6). Ваrr et al. (1991) ідентифікували 3 ділянки подібності між вірусами, що належать до порядку Mononegavirales: А, В і С (фігура 8). Хоча подібність найбільш висока у межах вірусного сімейства, у різних сімействах вірусів дані ділянки є високо консервативними. У всіх трьох ділянках MPV виявлена ідентичність амінокислот у розмірі 97% з APV-C, 89% - з APV-B, 92% - з APV-A і 66-73% - з RSV і PVM. Ділянка між амінокислотними залишками 160 і 340 виявляється високо консервативною у метапневмовірусів і, дещо у меншій мірі, у Pneumovirinae (Miyahara et al., 1992; Li et al., 1996; Barr et al., 1991). Дана конкретна ділянка, яка виявляє 100% подібності до APV-C, узгоджується з тим, що MPV являє собою метапневмовірус. Ген фосфопротеїну (Р) Друга ORF геномної карти кодує білок з 294 амінокислот, що виявляє гомологію за послідовністю у розмірі 68% амінокислот з білком Р APV-C і лише 22-26% з білком Р RSV (Таблиця 6). Ген Р MPV містить одну додаткову ORF і у цьому відношенні подібний до генів Р багатьох інших параміксовірусів (розглянуто у Lamb and Kolakofsky, 1996; Sedlmeier et al., 1998). На противагу APV-A і -В і PVM і подібно до RSV і APV-C в ORF для Р у MPV відсутні залишки цистеїну. Ling (1995) припустив, що ділянка високої подібності у всіх пневмовірусів (амінокислоти 185-241) грає роль або у процесі синтезу РНК або підтримці структурної цілісності нуклеокапсидного комплексу. Дана ділянка високої подібності також виявлена у MPV (фігура 9), конкретно, коли у розрахунок беруть консервативні заміни, демонструючи 100% подібності до APV-C, 93% до APV-A і В і приблизно 81% до RSV. С-кінець білка Р MPV багатий на глутамінові залишки, як описано у вірусів APV (Ling et al., 1995). Ген матриксного білка (М) Третя ORF у геномі MPV кодує білок з 254 амінокислот, відповідний ORF інших пневмовірусів. ORF для М у MPV володіє точно таким самим розміром як ORF для М інших пневмовірусів (Таблиця 5) і володіє значною гомологією з матриксними білками APV (78-87%), меншою гомологією з матриксними білками RSV і PVM (37-38%) та гомологією у розмірі 10% або менше з матриксними білками інших пневмовірусів (Таблиця 6). Easton (1997) порівняв послідовності матриксних білків всіх пневмовірусів і виявив консервативний гексапептид із залишків з 14 по 19, який також консервативний у MPV (фігура 10). Для RSV, PVM і APV ідентифіковані малі вторинні ORF у межах головної ORF для М або такі, що перекриваються з нею (52 амінокислоти і 51 амінокислота у bRSV, 75 амінокислот у RSV, 46 амінокислот у PVM і 51 амінокислота у APV) (Yu et al., 1992; Easton et al., 53 1997; Samal et al, 1991; Satake et al., 1984). Автори даного винаходу помітили дві малих ORF в ORF для М у MPV. Одну малу ORF з 53 амінокислотних залишків виявили у межах головної ORF для М (фрагмент 1, фігура 7), починаючи від нуклеотиду 2281, а іншу малу ORF з 33 амінокислотних залишків виявили такою, що перекривається з головною ORF для М, починаючи з нуклеотиду 2893 (фрагмент 2, фігура 7). Подібно до вторинних ORF RSV і APV значимої гомології вторинних ORF з вторинними ORF інших пневмовірусів не виявлено, а також відсутні видимі сигнали початку і закінчення транскрипції. Крім того, докази синтезу білків, відповідних даним вторинним ORF APV і RSV, відсутні. Ген білка злиття (F) ORF для F у MPV розташована поряд з ORF для М, що характерно для представників роду Metapneumovirus. Ген F у MPV кодує білок з 539 амінокислот, що на два амінокислотних залишки більше ніж F у APV-C (Таблиця 5). Аналіз амінокислотної послідовності виявив 81% гомології з APVC, 67% з APV-A і В, 33-39% з білками F пневмовірусів і лише 10-18% з іншими параміксовірусами (Таблиця 6). Однією з консервативних ознак у білків F параміксовірусів, яку також спостерігали у MPV, є розташування цистеїнових залишків (Morrison, 1988; Yu et al., 1991). Метапневмовіруси володіють 12 залишками цистеїну в F1 (7 є консервативними у всіх параміксовірусів) і двома в F2 (1 є консервативним у всіх параміксовірусів). З 3 можливих ділянок N-зв'язаного глікозилування, представлених в ORF для F у MPV, жодна не є спільною з RSV і дві (позиції 74 і 389) є спільними з APV. Третя, унікальна, ділянка можливого Nзв'язаного глікозилування розташована у позиції 206 (фігура 11). Незважаючи на низьку гомологію послідовності з іншими параміксовірусами, білок F MPV виявляє типові характеристики білка злиття, що узгоджуються з характеристиками, описаними для білків F інших представників сімейства Paramyxoviridae (Morrison, 1988). Білки F представників Paramyxoviridae синтезуються у вигляді неактивних попередників (F0), що розщеплюються за допомогою протеаз клітини-хазяїна, утворюючих N-кінцеві субодиниці F2 і великі С-кінцеві субодиниці F1. Передбачувана ділянка розщеплення (Collins et al., 1996) консервативна у всіх представників сімейства Paramyxoviridae. Ділянка розщеплення у MPV містить залишки RQSR. Обидва аргінінових (R) залишки є спільними з APV і RSV, але глутаміновий (Q) і сериновий (S) залишки є спільними з іншими параміксовірусами, такими як вірус парагрипу людини типу 1, вірус Сендай та морбілівіруси (дані не показані). Вважають, що N-кінцева гідрофобна ділянка F1 функціонує як мембранний домен злиття і показує високу подібність до послідовності у параміксовірусів і морбілівірусів і, у меншій мірі, у пневмовірусів (Morrison, 1988). Дані 26 залишків (позиції 137-163, фігура 11) консервативні у MPV і APV-C, що узгоджується з тим, що дана ділянка є високо консервативною у метапневмовірусів (Naylor et al., 1998; Seal et al., 2000). 93981 54 Як видно для субодиниць F2 у APV та інших параміксовірусів, MPV виявляє делецію 22 амінокислотних залишків у порівнянні з RSV (позиції 107-128, фігура 11). Більш того для RSV і APV, виявлено, що сигнальний пептид і якірний домен є консервативними у межах підтипів і високо варіабельні між підтипами (Plows et al., 1995; Naylor et al., 1998). Сигнальний пептид MPV (амінокислоти 10-35, фігура 11) на N-кінці F2 демонструє деяку подібність до послідовності з APV-C (18 з 26 амінокислотних залишків є подібними) і меншу консервативність з іншими видами APV або RSV. Набагато більшу варіабельність спостерігають у мембранному якірному домені на карбоксильному кінці F1, хоча деяка гомологія з APV-C ще помітна. Білок 22К (М2) Ген М2 унікальний для Pneumovirinae і для всіх пневмовірусів спостерігали дві ORF, що перекриваються. Перша головна ORF відповідає білку М2-1, який посилює процесивність вірусної полімерази (Collins et al., 1995; Collins, 1996) і проходження нею міжгенних ділянок (Hardy et al., 1998; Fearns et al., 1999). Ген M2-1 у MPV, розташований поряд з геном F, кодує білок з 187 амінокислот (Таблиця 5) і виявляє найвищу (84%) гомологію з М2-1 у APV-C (Таблиця 6). Порівняння всіх пневмовірусних білків М2-1 виявило найбільшу консервативність N-кінцевих частин білка (Collins et al., 1990; Zamora et al., 1992; Ahmadian et al., 1999), що узгоджується зі спостереженням, що MPV виявляє 100% подібність до APV-C перших 80 амінокислотних залишків білка (Фігура 12А). Білок М2-1 у MPV містить 3 цистеїнових залишки, розташованих у межах перших 30 амінокислотних залишків, що є консервативним у всіх пневмовірусів. Така концентрація цистеїнових залишків часто виявляється у білків, які зв'язують цинк (Ahmadian et al, 1991; Cuesta et al., 2000). Вторинні ORF (M2-2), що перекриваються з М2-1 ORF пневмовірусів, є консервативними за розташуванням, але не за послідовністю, і, як вважається, залучені до контролю переключення між реплікацією вірусної РНК і транскрипцією (Collins et al., 1985; Elango et al., 1985; Baybutt et al., 1987; Collins et al., 1990; Ling et al., 1992; Zamora et al., 1992; Alansari et al., 1994; Ahmadian et al., 1999; Bermingham et al., 1999). У MPV ORF для М2-2 починається з 512 нуклеотиду ORF для М2-1 (Фігура 7), що є точно такою ж стартовою позицією, як у APV-C. Довжини ORF для М2-2 є однаковими для APV-C і MPV і складають 71 амінокислотний залишок (Таблиця 5). Порівняння послідовності ORF для М2-2 (Фігура 12В) виявило 64% гомологію амінокислотних послідовностей у MPV і APV-C і лише 44-48% гомологію амінокислотних послідовностей у MPV і APV-A і В (Таблиця 6). ORF малого гідрофобного білка (SH) Ген, розташований поряд з М2 у hMPV, можливо кодує білок SH з 183 амінокислот (Фігури 1 і 7). Видимої ідентичності послідовності у даної ORF з іншими вірусними генами або продуктами генів РНК не виявлено. Це не є несподіваним, оскільки подібність послідовностей у білків SH пневмовірусів, як правило, невелика. Передбачу 55 вана ORF для SH у hMPV є найдовшою ORF для SH, відомою до цього часу (Таблиця 1). Амінокислотний склад ORF для SH відносно подібний до амінокислотного складу APV, RSV і PVM з високим процентом вмісту залишків треоніну і серину (22%, 18%, 19%, 20%, 21% і 28% у hMPV, APV, RSV A, RSV В, bRSV і PVM, відповідно). ORF для SH у MPV містить 10 цистеїнових залишків, тоді як SH у APV містить 16 цистеїнових залишків. ORF для SH у MPV володіє двома ділянками можливого Nзв'язаного глікозилування (амінокислоти 76 і 121), тоді як APV - однією, RSV - двома або трьома і PVM -чотирма. Профілі гідрофобності передбачуваного білка SH у hMPV, і SH у APV і RSV виявили однакові структурні особливості (Фігура 7В). ORF для SH у APV та у hMPV володіють гідрофільним N-кінцем, центральним гідрофобним доменом, який може служити як можливий трансмембранний домен (амінокислоти 30-53 для hMPV), другим гідрофобним доменом (амінокислоти 155-170) і гідрофільним С-кінцем. Навпаки, у SH у RSV виявлена відсутність С-кінцевої частини ORF з APV і MPV. У всіх пневмовірусів гідрофобні домени білків SH фланкуються основними амінокислотними залишками, які також виявлені в ORF для SH у hMPV (амінокислоти 29 і 54). ORF глікопротеїну прикріплення (G) ORF для G у hMPV розташована поряд з геном SH і кодує білок з 236 амінокислот (нуклеотиди 6262-6972, фігура 1). Виявлена вторинна мала ORF, розташована безпосередньо після даної ORF, потенційно кодує 68 амінокислотних залишків (нуклеотиди 6973-7179), але у неї відсутній стартовий кодон. Третя можлива ORF у другій рамці зчитування з 194 амінокислотних залишків перекривається з обома з даних ORF, але також не володіє стартовим кодоном (нуклеотиди 64167000). Дана ORF, що йде за можливою четвертою ORF у тій же рамці зчитування, яка складається з 65 амінокислотних залишків (нуклеотиди 70017198), знову не володіє стартовим кодоном. Нарешті, у третій рамці зчитування (нуклеотиди 64446737, Фігура 1) виявлена потенційна ORF з 97 амінокислотних залишків (але така, що не володіє стартовим кодоном). На відміну від першої ORF, інші ORF не мають видимих послідовностей початку або кінця гена (див. нижче). Хоча 236 амінокислотних залишків ORF для G, ймовірно, являють собою, щонайменше, частину білка прикріплення hMPV, не можна виключити, що додаткові кодуючі послідовності експресуються у вигляді окремих білків або як частина білка прикріплення внаслідок деякої події, що змінює РНК. Слід зазначити, що у APV і RSV не ідентифікували вторинних ORF після первинної ORF для G, але і APV, і RSV володіють вторинними ORF у межах головної ORF для G. Однак доказ експресії цих ORF відсутній, а також не існує гомології розрахункової амінокислотної послідовності у різних вірусів (Ling et al., 1992). У вторинних ORF для G у hMPV не виявили особливостей інших білків G, а щоб з'ясувати, чи експресуються додаткові ORF, треба провести додаткові дослідження. 93981 56 Аналіз BLAST з усіма ORF не виявив помітної гомології з іншими відомими вірусними генами або продуктами генів на рівнях нуклеотидів або амінокислотної послідовності. Це узгоджується з низькими процентами гомології послідовності, знайденими для інших білків G, таких як hRSV А і В (53%) (Johnson et al., 1987) і APV А і В (38%) (Juhasz and Easton, 1994). Тоді як більшість ORF у hMPV мають подібність до ORF у APV як по довжині, так і по послідовності, можлива ORF для G з 236 амінокислотних залишків значно менша, ніж ORF для G у APV (Таблиця 1). Амінокислотна послідовність виявляє вміст серину і треоніну у розмірі 34%, що навіть вище, ніж 32% у RSV і 24% у APV. Можлива ORF для G також містить 8,5% пролінових залишків, що вище, ніж 8% у RSV і 7% у APV. Незвичайну величезну кількість пролінових залишків у білках G у APV, RSV і MPV також спостерігали у глікопротеїнів слизового походження, де вони були головною детермінантою третинної структури білків (Collins and Wertz, 1983; Wertz et al., 1985; Jentoft, 1990). ORF для G у hMPV містить п'ять потенційних ділянок N-зв'язаного глікозилування, тоді як у hRSV їх 7, у bRSV - 5 і у APV - від 3 до 5. Передбачений профіль гідрофобності G у MPV виявив особливості, подібні до інших пневмовірусів. N-кінці містять гідрофільну ділянку, за якою йде коротка гідрофобна зона (амінокислоти 33-53 для hMPV) і переважно гідрофільний карбоксильний кінець (фігура 14В). Така спільна організація узгоджується з організацією заякорених трансмембранних білків II типу і добре відповідає даним ділянкам білків G у APV і RSV. Можлива ORF для G у hMPV містить лише 1 цистеїновий залишок, на відміну від RSV і APV (5 і 20 відповідно). Відомо, що лише дві з чотирьох вторинних ORF у гені G містять один додатковий цистеїновий залишок і що дані чотири можливих ORF містять 12-20% серинових і треонінових і 6-11% пролінових залишків. Ген полімерази (L) Аналогічно з іншими вірусами з "мінус"ланцюгом, остання ORF геному MPV є компонентом РНК-залежної РНК полімерази комплексів реплікації і транскрипції. Ген L у MPV кодує білок з 2005 амінокислот, який на 1 залишок довший, ніж даний білок у APV-A (Таблиця 5). Білок L у MPV виявляє гомологію за послідовністю у розмірі 64% з APV-A, 42-44% - з RSV і приблизно 13% з іншими параміксовірусами (Таблиця 6). Poch et al. (1989; 1990) ідентифікували шість консервативних доменів у білках L несегментованих РНК-вірусів з "мінус"-ланцюгом, з яких домен III включає чотири мотиви ядра полімерази, які, як вважається, є основними для функціонування полімерази. Дані мотиви (А, В, С і D) є у високій мірі консервативними у білку L у MPV: за мотивами А, В і С MPV володіє 100% подібністю до усіх пневмовірусів, а за мотивом D MPV володіє 100% подібністю до APV і 92% - до вірусів RSV. Для цілого домену III (амінокислоти 627-903 в ORF для L) MPV володіє гомологією з APV у розмірі 77%, з RSV - 61-62% і з іншими параміксовірусами - 23-27% (Фігура 15). На додаток до мотивів полімерази, білки L пневмовірусів містять послідовність, відповідну консенсус 57 ному АТФ-зв'язувальному мотиву K(X)21GEGAGN(X)20K (Stec, 1991). ORF для L у MPV містить подібно до APV мотив, в якому розміщення проміжних залишків зсунуте на один: K(X)22GEGAGN(X)19K. Філогенетичні аналізи Як показник спорідненості MPV з представниками Pneumovirinae, раніше, базуючись на ORF для N, Р, М і F, сконструювали філогенетичні дерева, які виявили близьку спорідненість MPV з APV-C. У зв'язку з низькою гомологією генів G і SH у MPV з іншими пневмовірусами побудувати достовірні філогенетичні дерев для даних генів не уявлялося можливим. Крім того, різна організація геному у представників родів Pneumovirus і Metapneumovirus зробила неможливою створення філогенетичних дерев на основі послідовності цілого геному. Тому, на додаток до раніше опублікованих, автори даного винаходу побудували філогенетичні дерева лише для генів М2 і L. Обидва ці дерева підтвердили близьку спорідненість APV і MPV у межах підсімейства Pneumovirinae (фігура 16). Некодуючі послідовності MPV Генні контакти геному параміксовірусів містять короткі і висококонсервативні послідовності нуклеотидів на початку і кінці кожного гена (сигнали початку та кінця гена), що можливо грають роль в ініціації і термінації транскрипції (Curran et al., 1999). Порівняння міжгенних послідовностей всіх генів MPV виявило консенсусну послідовність сигналу старту гена для N, P, M, F, M2 і G: GGGACAAGU (фігура 17а), яка ідентична для консенсусного сигналу старту гена у метапневмовірусів (Ling et al., 1992; Yu et al., 1992; Li et al., 1996; Bäyon-Auboyer et al., 2000). Виявлено, що сигнали старту гена для генів SH і L у MPV трохи відрізняються від консенсусного (SH: GGGAUAAAU, L: GAGACAAAU). Виявлено, що сигнал старту гена для L у APV також відрізняється від консенсусного: AGGACCAAT (APV-A) (Randhawa et al., 1996) і GGGACCAGT (APV-D) (Bäyon-Auboyer et al., 2000). На противагу подібним послідовностям старту гена у MPV і APV, у міжгенних послідовностях MPV не вдалося виявити консенсусну послідовність кінця гена у APV, UAGUUAAUU (Randhawa et al., 1996). Повторюваною послідовністю, яку знайшли у багатьох генах, виключаючи міжгенні ділянки GL, і яка, можливо, могла б діяти як сигнал кінця гена, була U ААААА U/A/C. Однак оскільки автори даного винаходу визначали послідовність вірусної РНК раніше, ніж послідовність мРНК, визначені сигнали кінця гена визначити не вдалося і, таким чином, необхідні подальші дослідження. Міжгенні ділянки пневмовірусів змінюються по розміру і послідовності (Curran et al., 1999; Blumberg et al., 1991; Collins et al., 1983). Міжгенні ділянки у MPV не виявляють гомології з міжгенними ділянками APV і RSV і їх розмір знаходиться у діапазоні від 10 до 228 нуклеотидів (фігура 17В). Міжгенна ділянка між ORF для М і F у MPV містить частину вторинної ORF, яка починається у первинній ORF для М (див. вище). Міжгенна ділянка між SH і G містить 192 нуклеотиди, і, базуючись на присутності численних термінуючих кодонів у всіх трьох 93981 58 рамках зчитування, не виявляє можливості кодування. Міжгенна ділянка між G і L містить 241 нуклеотид і може включати додаткові ORF (див. вище). Цікаво, що старт ORF для L розташований у даних вторинних ORF. Оскільки ген L у APV не починається у попередній ORF для G, ORF для L у RSV також починається у попередньому гені М2. На 3'-кінці і 5'-кінці геному параміксовірусів коротка позагенна ділянка, що відноситься до лідерних і кінцевих послідовностей, і приблизно перші 12 лідерних і 12 кінцевих нуклеотидів комплементарні, ймовірно, через те, що кожний містить основні елементи вірусного промотору (Curran et al., 1999; Blumberg et al., 1991; Mink et al., 1986). 3'-лідерна послідовність і у MPV, і у APV складає 41 нуклеотид у довжину, і у ділянці між нуклеотидами 16 і 41 спостерігають деяку гомологію обох вірусів (18 з 26 нуклеотидів) (фігура 17В). Як згадувалося раніше, перші 15 нуклеотидів геномної карти MPV базуються на послідовності праймерів, на основі геному APV. Довжина 5'-кінця у MPV (188 нуклеотидів) подібна до розміру 5'-кінця у RSV (155 нуклеотидів), який істотно більше, ніж у APV (40 нуклеотидів). Вирівнювання 40 крайніх нуклеотидів кінця MPV і кінця APV виявило гомологію 21 з 32, не рахуючи крайніх 12 нуклеотидів, що являють собою послідовності праймерів, які базуються на геномній послідовності APV. Аналізи послідовності авторами даного винаходу виявили відсутність генів NS1 і NS2 на 3'-кінці геному, і геномна організація подібна до організації метапневмовірусів (3'N-P-M-F-M2-SH-G-L-5'). Висока гомологія послідовності, виявлена у родів MPV і APV додатково акцентує близьку спорідненість даних двох вірусів. Для генів N, P, M, F, M2-1 і М2-2 у MPV виявлена загальна гомологія амінокислот з APV-C у розмірі 79%. Фактично, для цих генів APV-C і MPV виявляють гомології послідовності, які знаходяться у тому ж діапазоні, що і гомології послідовності, виявлені у підгруп інших родів, таких як RSV-A і -В або APV-A і -В. Дану близьку спорідненість APV-C з MPV також бачать при філогенетичних аналізах, які виявляють, що APV-С і MPV завжди знаходяться на одній гілці, окремо від гілки, що містить APVA і -В. Ідентична геномна організація, гомології послідовності і філогенетичні аналізи - всі свідчать на користь класифікації MPV як першого представника роду Metapneumovirus, що виділяється з ссавців. Необхідно зазначити, що виявлені зміни послідовності у різних вірусних ізолятів MPV у генах N, M, F і L виявляють можливе існування різних генотипів (van den Hoogen et al., 2001). Близька спорідненість між MPV і APV-C не відбивається на ряді хазяїв, оскільки APV заражає птахів, на противагу MPV (van den Hoogen et al., 2001). Дану різницю у ряді хазяїв можуть визначати відмінності між високо дивергентними білками SH і G обох вірусів. Білки SH і G у MPV не виявляють значимої гомології амінокислотної послідовності з білками SH і G будь-якого іншого вірусу. Хоча вміст амінокислот і графіки гідрофобності свідчать на користь визначення даних ORF як SH і G, для оцінки їх функції необхідні експериментальні дані. Такі аналізи проллють світло на роль додаткових ORF, що перекриваються, у даних генах SH і G. Крім того, 59 аналізи послідовності генів SH і G у APV-C можуть представити більше розуміння про функції білків SH і G у MPV та їх спорідненість з білками SH і G у APV-C. Виявлено, що некодуючі ділянки MPV є досить подібними до некодуючих ділянок APV. 3'лідерна і 5'-кінцева послідовності APV і MPV виявляють високий ступінь гомології. Хоча довжини міжгенних ділянок у APV і MPV не завжди однакові, консенсусні сигнали старту гена для більшості знайдених ORF ідентичні. На противагу цьому, сигнали кінця гена APV у геномі у MPV не виявлені. Хоча автори даного винаходу виявили послідовність (U ААААА U/A/C), що повторюється, у більшості міжгенних ділянок, необхідний аналіз послідовності вірусних мРНК для формального встановлення даних послідовностей кінця гена. Необхідно зазначити, що інформація про послідовність для 15 нуклеотидів на крайньому 3'-кінці і 12 нуклеотидах на крайньому 5'-кінці одержана за допомогою застосування способів модифікованої швидкої ампліфікації кінців кДНК (RACE). Доведено, що даний спосіб для споріднених вірусів є більш успішним у порівнянні з іншими (Randhawa, J.S. et al. Rescue of synthetic minireplicons establishes the absence of the NS1 and NS2 genes from avian pneumovirus. J. Virol, 71, 9849-9854 (1997); Mink, M.A., et al. Nucleotide sequences of the 3'leader and 5'trailer regions of human respiratory syncytial virus genomic RNA. Virology 185, 615-24 (1991)). Для визначення послідовності 3'-лідерної послідовності вРНК, до очищеної вРНК, з використанням полі-А-полімерази, додали кінцевий гомополімер А, а потім лідерну послідовність ампліфікували за допомогою PCR із застосуванням праймеру полі-Т і праймеру у гені N. Для визначення послідовності 5'-кінця вРНК, із застосуванням зворотної транскриптази і праймеру у гені L, одержали кДНК-копію кінцевої послідовності, з подальшим додаванням dG-гомополімеру до кінця кДНК за допомогою термінальної трансферази. Далі, кінцеву ділянку ампліфікували із застосуванням праймеру полі-С і праймеру у гені L. Як альтернативну стратегію, вРНК лігують саму з собою або синтетичними лінкерами, після чого лідерну і кінцеву ділянки ампліфікують із застосуванням праймерів у генах L і N і праймерів, специфічних до лінкера. Для 5'-кінцевої послідовності також можливе пряме визначення послідовності очищеної вРНК з дидезоксинуклеотидами (Randhawa, 1997). Застосовуючи дані підходи, автори даного винаходу можуть аналізувати точну послідовність кінців геному hMPV. Інформація про послідовність, представлена тут, є важливою для створення діагностичних тестів, вакцин і противірусних препаратів для MPV та інфекцій MPV. Матеріали і методи Аналізи послідовностей Вірусний ізолят 00-1 розмножували до високих титрів (приблизно 10000 TCID50/мл) у третинних клітинах нирки мавпи, як описано раніше (van den Hoogen et al., 2001). Вірусну ДНК виділяли з супернатанту інфікованих клітин, використовуючи High Pure RNA Isolating Kit відповідно до інструкцій виробника (Roch Diagnostics, Almere, The Netherlands). Праймери підбирали, базуючись на 93981 60 раніше опублікованих послідовностях (van den Hoogen et al., 2001) додатково до послідовностей, опублікованих для лідерної і кінцевої послідовностей APV/RSV (Randhawa et al., 1997; Mink et al., 1991), і вони знаходилися у розпорядженні за вимогою. З вірусною РНК проводили аналізи RTPCR, застосовуючи аналіз в одній пробірці загальним об'ємом 50 мкл, що містила 50 мМ Tris з рН 8,5, 50 мМ NaCl, 4,5 мМ MgCl2, 2 мМ DTT, 1 мкМ прямого праймеру, 1 мкМ зворотного праймеру, 0,6 мМ dNTP, 20 одиниць RNAsin (Promega, Leiden, The Netherlands), 10 одиниць зворотної транскриптази AMV (Promega, Leiden, The Netherlands) і 5 одиниць Taq-полімерази (РЕ Applied Biosystems, Nieuwerkerk aan de IJssel, The Netherlands). Зворотну транскрипцію проводили 30 хвилин при 42°С, з подальшою інактивацією протягом 8 хвилин при 95°С. кДНК ампліфікували протягом 40 циклів: 1 хв. - 95°С, 2 хв. - 42°С, 3 хв. 72°С, із заключним добудовуванням при 72°С 10 хв. Після перевірки в 1% агарозному гелі продукти RT-PCR очищали з гелю з використанням набору Qiaquick Gel Extraction kit (Qiagen, Leusden, The Netherlands) і визначали послідовність прямим способом з використанням набору Dyenamic ET terminator sequencing (Amersham Pharmacia Biotech, Roosendaal, the Netherlands) і автоматичного секвенатора ДНК АВІ 373 (РЕ Applied Biosystem, Nieuwerkerk aan den IJssel, the Netherlands), за інструкціями виробника. Вирівнювання послідовності проводили із застосуванням програмного пакету Clustal, доступного у програмному пакеті BioEdit версії 5.0.6. (http://jwbrown.mbio.ncsu.edu/Bioedit//bioedit.html; Hall, 1999). Філогенетичний аналіз Для побудови філогенетичних дерев, послідовності ДНК вирівнювали із застосуванням програмного пакету ClustalW, а дерева максимальної правдоподібності одержували із застосуванням програмного пакету DNA-ML програми Phylip 3.5, із застосуванням 100 умов ініціалізації і 3 перестановок. Величини умов ініціалізації обчислювали для консенсусних дерев, створених з консенсусною упаковкою (Felsenstein, 1989). Геномна послідовність MPV доступна у Genbank під номером доступу AF371337. Всі інші послідовності, що використовуються тут, доступні у Genbank під номерами доступу АВ046218 (вірус кору, всі ORF), NC-001796 (вірус парагрипу людини 3 типу, всі ORF), NC-001552 (вірус Сендай, всі ORF), X57559 (вірус парагрипу людини 2 типу, всі ORF), NC-002617 (вірус хвороби Ньюкасла, всі ORF), NC-002728 (вірус Nipah, всі ORF), NC001989 (bRSV, всі ORF), M11486 (hRSV А, всі ORF, виключаючи L), NC-001803 (hRSV, L для ORF), NC-001781 (hRSVВ, всі ORF), D10331 (PVM, N ORF), U09649 (PVM, P ORF), U66893 (PVM, М ORF), U66893 (PVM, SH ORF), D11130 (PVM, G ORF), D11128 (F ORF). PVM М2 ORF одержана з Ahmadian (1999), AF176590 (APV-C, N ORF), U39295 (APV-A, N ORF), U39296 (APV-B, N ORF), AF262571 (APV-C, M ORF), U37586 (APV-B, M ORF), X58639 (APV-A, M ORF), AF176591 (APV-C,
ДивитисяДодаткова інформація
Назва патенту англійськоюVirus causing respiratory tract illness in susceptible mammals
Автори англійськоюDe Jong Jan Cornelius, Fouchier Ronaldus Adrianus Mari, Van Den Hoogen Bernadetta Gera, Osterhaus Albertus Dominicus Marcellinus Erasmus, Groen Jan
Назва патенту російськоюВирус, который вызывает заболевание дыхательных путей у чувствительных k этому млекопитающих
Автори російськоюДе Йонг Ян Корнелиус, Фушье Рональдус Адрианус Мария, ван ден Хоген Бернадетта Герарда, Остерхаус Альбертус Доминикус Марселлинус Эрасмус, Грун Ян
МПК / Мітки
МПК: A61K 39/155, C07K 16/08, C07K 14/135, A61P 11/00
Мітки: викликає, захворювання, цього, шляхів, ссавців, дихальних, вірус, чутливих
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/71-93981-virus-shho-viklikaeh-zakhvoryuvannya-dikhalnikh-shlyakhiv-u-chutlivikh-do-cogo-ssavciv.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Вірус, що викликає захворювання дихальних шляхів у чутливих до цього ссавців</a>
Штам бактерій, який є збудником захворювання верхніх дихальних та статевих шляхів курчат, та вакцина, що його містить
Номер патенту: 89607
Опубліковано: 25.02.2010
Автори: Кампогаррідо Рауль, Гонзалес-Єрнандес Карлос, Вазкез Марія Елена, Сіванандан Вайсінасан
МПК: A61K 39/102, C12N 1/20
Мітки: штам, захворювання, статевих, бактерій, містить, вакцина, збудником, шляхів, верхніх, курчат, дихальних
Формула / Реферат:
1. Штам бактерій, який є збудником захворювання верхніх дихальних шляхів і статевих шляхів курчат, який вибирають із групи, яка включає Pasteurella trehalosi або Mannheimia haemolytica, та зазначений штам позитивний у відношенні бета-гемолізу, позитивний у відношенні оксидази, позитивний у відношенні каталази, негативний у відношенні уреази, позитивний у відношенні нітратів, негативний у відношенні індолу,...
Спосіб комбінованого лікування хворих на гострі та хронічні захворювання верхніх дихальних шляхів у післяопераційному періоді
Номер патенту: 3910
Опубліковано: 15.12.2004
Автори: Мітін Юрій Володимирович, Науменко Олександр Миколайович, Дєєва Юлія Валеріївна
МПК: A61K 36/49, A61K 31/00, A61K 36/288, A61P 11/00, A61K 135/00, A61K 127/00, A61K 36/11, A61K 36/52, A61K 36/185, A61K 133/00, A61K 36/28, A61K 125/00, A61K 129/00
Мітки: дихальних, шляхів, хронічні, верхніх, спосіб, комбінованого, гострі, захворювання, лікування, періоди, післяопераційному, хворих
Формула / Реферат:
Спосіб комбінованого лікування хворих на гострі та хронічні захворювання верхніх дихальних шляхів у післяопераційному періоді, що включає постільний режим, щадну дієту, антибактеріальну та десенсибілізуючу терапію, полоскання антисептичними розчинами, який відрізняється тим, що додатково призначають препарат Тонзилгон Н по 2 драже (або 25 крапель) 6 разів на добу протягом 14 днів хворим на паротонзилярний абсцес та після тонзилектонії, по 2...
Спосіб лікування мікросудин верхніх дихальних шляхів
Номер патенту: 58035
Опубліковано: 25.03.2011
Автори: Жуков Альберт Васильович, Лищишин Омелян Іванович
МПК: A61M 15/02, A61H 31/02
Мітки: дихальних, верхніх, мікросудин, спосіб, шляхів, лікування
Формула / Реферат:
Спосіб лікування мікросудин верхніх дихальних шляхів, що включає застосування температурного лікування бронхіальної ділянки, який відрізняється тим, що за призначенням лікаря на поверхню бронхів накладають нагріті до температури 36-38 градусів озокеритові аплікації нульового електричного заряду, одночасно з озокеритовим нагрівом поверхні тіла пацієнта вводять озон за допомогою апарата персонального або колективного користування - озонатора....
Спосіб визначення мукоциліарного транспорту дихальних шляхів
Номер патенту: 58185
Опубліковано: 15.07.2003
Автори: Гришун Юлія Анатоліївна, Норейко Борис Вікторович, Норейко Сергій Борисович, Лепшина Світлана Михайлівна
МПК: A61B 5/08, A61B 10/00
Мітки: дихальних, транспорту, визначення, мукоциліарного, спосіб, шляхів
Формула / Реферат:
Спосіб визначення мукоциліарного транспорту дихальних шляхів, що включає аплікацію кристалу сахарину на поверхню слизової оболонки середнього відділу нижнього носового ходу і вимір часу появи першого відчуття солодкого смаку в ротовій порожнині, який відрізняється тим, що мукоциліарний транспорт визначають по загальній тривалості часу транспорту сахарину в носоглоточному відділі слизової оболонки верхніх дихальних шляхів від середнього...
Спосіб лікування дихальних шляхів
Номер патенту: 10457
Опубліковано: 15.11.2005
Автори: Савчук Антоніна Іванівна, Целух Ірина Анатоліївна, Гайдей Віктор Романович, Лаврюкова Світлана Яківна, Сичова Олена Володимирівна
МПК: A61N 7/00, A61P 11/00
Мітки: дихальних, спосіб, шляхів, лікування
Формула / Реферат:
Спосіб лікування дихальних шляхів шляхом введення рідкого біостимулятора "Пеловіт-Р" за допомогою преформованого фактора, який відрізняється тим, що проводять фонофорез 50 % розчину "Пеловіт-Р" у вазеліні на паравертебральні зони CIV-ThX - область проекції легень - за контактним методом та лабільною методикою з потужністю ультразвукового випромінювання 0,2-0,4 Вт/см2, тривалістю 5-6 хв на кожну зону, загальним курсом...
Попередній патент: Багатофункціональне тентове укриття
Наступний патент: Система маршрутизації для сільськогосподарських машин
Випадковий патент: Спосіб прогнозування зрощення перелому