Ген, що кодує інсектицидний білок cry1c

УКРАЇНА (19) UA (11) 98108 (13) C2 (51) МПК C07K 14/325 (2006.01) C12N 15/82 (2006.01) ДЕРЖАВНА СЛУЖБА ІНТЕЛЕКТУАЛЬНОЇ ВЛАСНОСТІ УКРАЇНИ ОПИС ДО ПАТЕНТУ НА ВИНАХІД (21) Номер заявки: a 2008 12351 Дата подання заявки: 16.03.2007 (22) (24) Дата, з якої є чинними 25.04.2012 права на винахід: (31) Номер попередньої 06075679.8, 60/784,310 (32) Дата подання 21.03.2006, 21.03.2006 заявки відповідно до Паризької конвенції: попередньої заявки відповідно до Паризької конвенції: (33) Код держави-учасниці EP, Паризької конвенції, US до якої подано попередню заявку: (41) Публікація відомостей 10.02.2009, Бюл.№ 3 про заявку: (46) Публікація відомостей 25.04.2012, Бюл.№ 8 про видачу патенту: (86) Номер та дата подання міжнародної заявки, поданої відповідно до Договору PCT PCT/EP2007/002342, 16.03.2007 (72) Винахідник(и): Ван Рі Ерун (BE), Мелеватер Франк (BE), ван Елдік Гербен (BE) (73) Власник(и): БАЙЄР БІОСАЄНС Н.В., Technologiepark 38, B-9052 Gent, Belgium (BE) (74) Представник: Федорова Iрина Олександрiвна, реєстр. №11 (56) Перелік документів, взятих до уваги експертизою: EP 1099760 A, 16.05.2001 US 2003226171 A, 04.12.2003 TANG WEI ET AL: "Development of insectresistant transgenic indica rice with a synthetic cry1C* gene" MOLECULAR BREEDING, vol. 18, no. 1, August 2006, pages 1-10 SCHUNMANN PETRA H D ET AL: "A suite of novel promoters and terminators for plant biotechnology." FUNCTIONAL PLANT BIOLOGY, vol. 30, no. 4, 2003, Abstract CAO J ET AL: "Broccoli plants with pyramided cry1Ac and cry1C Bt genes control diamondback moths resistant to Cry1A and Cry1C proteins" THEORETICAL AND APPLIED GENETICS, vol. 105, no. 2-3, August 2002, pages 258-264 (54) ГЕН, ЩО КОДУЄ ІНСЕКТИЦИДНИЙ БІЛОК Cry1C (57) Реферат: Винахід належить до інсектицидного Cry1С білка, що продукується штамами Bacillus thuringiensis та нуклеїнової послідовності, що його кодує. Винахід також належить до трансгенних рослин, що містять зазначену нуклеїнову послідовність, яка забезпечують їм стійкість до комах та способів отримання зазначених трансгенних рослин або їх насіння. UA 98108 C2 (12) UA 98108 C2 UA 98108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Цей винахід пов'язаний з послідовностями нових генів, що кодують інсектицидні білки, які продукуються штамами Bacillus thuringiensis. Зокрема, забезпечуються нові гібридні гени, що кодують білок Сrу1С, який можна застосовувати для захисту рослин від шкоди, заподіяної комахами. Також у винахід включено рослинні клітини або рослини, які містять такі гени, способи їх отримання та застосування, а також рослинні клітини або рослини, які несуть такий гібридний ген сry1С і, щонайменше, один інший ген, що кодує інсектицидний білок, такий як послідовності нових генів, які кодують Сrу1В або Cry1D білки. Штами і білки, отримані з Bacillus thuringiensis (у скорочену вигляді "Bt"), є добре відомі своєю специфічною токсичністю щодо комах-шкідників, і вони використовуються понад століття, для того щоб контролювати чисельність комах-шкідників. Деякі види трансгенних рослин, які експресують Bt білок, зараз є доступними, і вони успішно лімітують шкоду, яку можуть заподіяти рослинам комахи. Незважаючи на те, що була ізольована ціла низка інсектицидних Bt білків, лише кілька Bt білків були експресовані у трансгенних рослинах, які були комерціалізовані, і це отримано лише на кількох сільськогосподарських культурах. Більшість комерціалізованих трансгенних Bt рослин належать до головних сільськогосподарських культур, таких як кукурудза і бавовник. У менш важливих ринкових культур, таких як овочеві культури, лише кілька видів рослин були трансформовані за допомогою Bt генів, для того щоб підвищити їх резистентність до більшості шкідників рослин, що належать до ряду лускокрилих (Lepidoptera), однак дотепер жодна Lepidoptera-резистентна овочева Bt-культура або насіння не були розрегульовані і випущені на ринок. Zhao et al. (2003) описали трансгенні рослини капусти брокколі, які експресують Cry 1Ac або Cry1C Bt токсин, а також гібриди між цими рослинами, так що як Сrу1Ас, так і Сrу1С токсин експресуються в одній і тій же рослині, однак ці рослини не були комерціалізовані. NewLeaf ™ картопля, яка містить Сrу3А Coleoptera-активний ген, була протягом нетривалого часу комерціалізована в Північній Америці, однак була вилучена з ринку у 2001 році. Даний винахід забезпечує нові гени, що кодують білки Сrу1С типу Bt білків, які ідеально поєднуються з генами, що кодують білки Сrу1В або Cry1D типу Bt білків. Послідовності ДНК сrу1С, сrу1В або сrу1D генів винаходу і модифіковані транзитні пептиди винаходу (представлені у переліку послідовностей, що додається) являють собою штучні гени, не виявлені в природі, і які відрізняються від будь-якої відомої послідовності ДНК. Дійсно, жодна з ДНК послідовностей SEQ ID Nos 1, 3, 10, 14 або 16 виявляє не менше, ніж 76.6 % ідентичності послідовності з найближчими відомими ДНК послідовностями. У цьому винаході забезпечено кілька нових генів, які походять від Bt, для застосування на рослинах, для того щоб контролювати численність комах. Зокрема, такі гени застосовуються на овочевих сільськогосподарських культурах, зокрема, представниках родини Brassicaceae, таких як цвітна капуста, білокачанна капуста, пекінська капуста, турнепс, гірчиця, олійна редька, брокколі, брюссельска капуста, шпинат, тощо. Зокрема, в одному втіленні цього винаходу рослини наступних видів роду Brassica захищаються від комах за допомогою нових генів даного винаходу: В. carinata, B. elongata, B. fruticulosa, B. juncea, B. napus, B. narinosa, B. nigra, B. oleracea, B. perviridis, B. rapa, B. rupestris, B. septiceps, B. tournefortii, тощо, зокрема рослини видів Brassica oleraceae або Brassica napus. Рослини або насіння, які несуть, щонайменше, один новий ген винаходу, можуть бути отримані шляхом трансформації рослинних клітин або отримання рослин, або їх насіння, які містять гени винаходу. Крім того, тут включені рослини або насіння, отримані за допомогою схрещування з трансформованою рослиною, яка містить, щонайменше, один ген винаходу, а також шляхом застосування загальноприйнятих етапів гібридизації. Очевидно, що, для того щоб захистити будь-який вид рослин від видів комах, яких знищують або контролюють за допомогою Bt білків, закодованих новими генами винаходу, можуть бути трансформовані за допомогою генів винаходу, для того щоб отримати трансгенні рослини або насіння з підвищеною резистентністю до цих комах. В одному втіленні, цей винахід забезпечує комбінацію технологій, що призводить до отримання найоптимальнішого продукту з точки зору управління резистентністю. Дійсно, в одному втіленні винаходу рослини винаходу утворюють, щонайменше, 32 різні Bt білки, і такі білки кодуються cry генами винаходу з високим рівнем експресії, які були стійко інтегровані, як правило, у одному локусі рослинного геному. В одному втіленні, такі, щонайменше, 2 Bt гени включають сrу1С і сrу1В ген, сrу1С і сrу1D ген, або комбінацію сrу1С, сrу1В і сrу1D генів цього винаходу. В одному втіленні цього винаходу ген-маркер, який дає змогу швидко ідентифікувати трансгенні рослини, переважно ген резистентності до гербіциду, локалізований в тій же рослині, зокрема, у тому ж локусі рослинного геному, що й cry ген винаходу. В одному втіленні цього винаходу, ген-маркер являє собою ген, який кодує фосфінотрицинацетилтрансферазу або гліфосат-нечутливий EPSPS. 1 UA 98108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Цей винахід забезпечує також нові сrу1В і cry1D гени, зокрема, сrу1В або сrу1D химерні (гібридні) гени, які можуть експресуватись в рослинах у високих рівнях, такі як сrу1 В1 і cry1 B2 і cry1 D1 і cry1 D2 гени. Також тут забезпечуються рослинні клітини, рослини або насіння, які включають будь-який з цих генів, способи отримання або застосування будь-якого з цих генів поодинці або у комбінації. Крім того, цей винахід забезпечує нові гени, що кодують інсектицидний білок, які включають функціональний інтрон рослини у його кодуючій послідовності. Наявність інтрону також ґарантує, що цей ген не експресує функціональний білок, якщо ген перебуває у середовищі, у якому інтрон не може бути сплайсований, наприклад, такому як бактерії чи інші прокаріоти. Наявність інтрону у генній послідовності також забезпечує високі рівні експресії, що можуть бути отримані у рослинах. Також тут включені варіанти сrу1С білка винаходу, які включають послідовність SEQ ID No. 2 від амінокислоти у положенні 29 до амінокислоти у положенні 627, де одна, декілька або всі наступні амінокислоти в наступних положеннях змінюються, порівняно з положеннями у послідовності SEQ ID No. 2: амінокислота в положенні 125 являє собою Аланін, амінокислота в положенні 184 - Валін, амінокислота в положенні 295 - Аргінін, амінокислота в положенні 454 аспарагінова кислота, або амінокислота в положенні 593 являє собою Аргінін. Також тут забезпечуються варіанти сrу1В білка винаходу, які включають послідовність SEQ ID No. 11 від амінокислоти у положенні 31 до 648, де, однак амінокислота в положенні 151 у SEQ ID No. 11 є тирозин або амінокислота в положенні 353 у SEQ ID No. 11 є аргінін, або білок, у якому амінокислота в положенні 151 у SEQ ID No. 11 являє собою тирозин, а амінокислота в положенні 353 в SEQ ID No. 11 є аргінін. Також у цьому винаході включено нову ДНК, яка кодує хлоропластний транзитний пептид, зокрема, ДНК, яка включає послідовність SEQ ID No. 16: від нуклеотиду у положенні 7 до нуклеотиду в положенні 371, зокрема, послідовність SEQ ID No. 16, а також ДНК, яка кодує варіант білка SEQ ID No. 17, такого як хлоропластний транзитний пептид, який включає послідовність SEQ ID No. 17: від амінокислоти у в положенні 3 до амінокислоти в положенні 124, де цистеїн у положенні 55 заміщується на тирозин і/або де гліцин додається після гліцину в положенні 51. Конкретніше, цей винахід забезпечує химерний ген, який включає наступні функціонально з'єднані послідовності: а) кодуючу ділянку, яка кодує сrу1С білок, що включає ДНК будь-якої з послідовностей SEQ ID Nos. 1, 3, 4 або 6 чи її варіантів, і b) ділянку промотора, здатного спрямовувати експресію в рослинних клітинах. В одному втіленні, такий промотор включає послідовність SEQ ID No. 18 або 19. В іншому втіленні, гібридний ген ще включає ділянку 3' поліаденілювання і ділянку термінації транскрипції, зокрема, з гена НАДФ-малатдегидрогенази з Flaveria bidentis. B іншому втіленні, гібридний ген, крім того, ще включає лідерну послідовність тапетум-специфічного Е1 гена Oryza sativa між ділянкою промотора і кодуючою ділянкою. Даний винахід також забезпечує ДНК, яка включає будь-який із вищезазначених гібридних генів, що включає ще другий гібридний ген, зазначений другий гібридний ген включає наступні функціонально з'єднані послідовності: а) другу кодуючу ділянку, яка кодує сrу1В білок, що містить ДНК SEQ ID No. 8 або 10, і b) другу ділянку промотора, здатного спрямовувати експресію в рослинних клітинах; або ДНК, яка включає будь-який з-поміж вищезазначених гібридних генів, що додатково включає другий гібридний ген, вказаний другий гібридний ген включає наступні функціонально з'єднані послідовності: а) кодуючу ділянку, яка кодує Cry1D білок, що включає ДНК SEQ ID No. 12 або 14, і b) ділянку промотора, здатного спрямовувати експресію в рослинних клітинах. В одному втіленні, забезпечуються вищезазначені ДНК, де вказана ділянка другого промотора включає послідовність SEQ ID No. 18 або 19 і відрізняється від ділянки першого промотора; або де вказаний другий гібридний ген додатково включає ділянку 3' поліаденілювання і ділянку термінації транскрипції, зокрема гена НАДФмалатдегидрогенази з Flaveria bidentis. B одному втіленні, другий гібридний ген в цих ДНК додатково включає лідерну послідовність тапетум-специфічного гена Е1 Oryza sativa між ділянкою промотора і кодуючою ділянкою. Даний винахід також забезпечує зазначені вище ДНК, які, крім того, включають третій гібридний ген; вказаний третій гібридний ген включає наступні функціонально з'єднані послідовності: а) кодуючу ділянку, яка кодує Cry1D білок, що містить ДНК SEQ ID No. 12 або 14, і b) ділянку промотора, здатного спрямовувати експресію у рослинах. Даний винахід також включає трансгенну рослинну клітину або рослину, яка включає будьякий із вищезазначених генів або ДНК, що стійко зв'язані з їх геномом, переважно, коли клітина або рослина є рослиною виду роду Brassica або рослинною клітиною, зокрема, виду Brassica oleraceae, ще конкретніше, капусти або цвітної капусти. 2 UA 98108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Цей винахід також включає застосування будь-якого із вищезгаданих гібридних генів або ДНК, для того щоб контролювати чисельність комах-шкідників, для того щоб отримати рослинні клітини, рослини або насіння із підвищеною резистентністю до комах; застосування будь-якого із вищезазначених гібридних генів або ДНК, для того щоб уповільнити або попередити розвиток резистентності у комах, у трансгенних рослин, що експресують інсектицидний білок за допомогою комах, що намагаються живитись на таких рослинах; або застосування будь-якого із вищезгаданих гібридних генів або ДНК, для того щоб отримати капусту, олійну редьку або цвітну капусту, яка захищена від Plutella xylostella. Також тут включені способи контролю чисельності комах, які включають етап посадки або висіву в полі, рослин, що включають будь-який з вищевказаних гібридних генів або ДНК; а також способи контролю комах на рослинах видів Brassica, які включають етап експресування будьякого з вищевказаних генів або ДНК у рослинах; або способи продукування рослини або насіння, стійких до комах, що включають етапи: а) отримання рослин, трансформованих за допомогою гену за будь-яким і пунктів Формули винаходу від 1 до 5 або ДНК за будь-яким з пунктів Формули винаходу від 6 до 12, і b) селекції потомства вказаної рослини або її насіння, що включають цей ген або ДНК. Також відповідно до даного винаходу включений химерний ген, який містить наступні функціонально-зв'язані послідовності: а) перший фрагмент кодуючої послідовності, який кодує інсектицидний білок, b) послідовність інтрону рослини, с) другий фрагмент зазначеної кодуючої послідовності, d) ділянку промотора, здатного спрямовувати експресію в рослинних клітинах, і де жоден інсектицидний білок не може продукуватись таким химерним геном в даній рослинній клітині, в якій інтрон не сплайсується, зокрема; таким химерним геном, в якому такий інтрон є другим інтроном гену ST-LS1 Solanum tuberosum. У цьому винаході також забезпечуються мікроорганізми, які включають будь-який із вищезазначених химерних генів або ДНК, зокрема, якщо такий мікроорганізм являє собою рід Escherichia, Bacillus або Agrobacterium. Відповідно до цього винаходу, "нуклеотидна послідовність" стосується молекули ДНК або PHK, що мають одно- або двохланцюгову форму, переважно молекули ДНК. "Ізольована ДНК", як тут використовується, стосується ДНК, яка природно не зустрічається або вже не зустрічається у природному середовищі, де вона раніше була присутня, напр., кодуюча послідовність ДНК, пов'язана з іншими регуляторними елементами у гібридному гені, ДНК, перенесена в іншу клітину-господар, таку як рослинна клітина, або штучна, синтетично створена ДНК послідовність, що має іншу нуклеотидну послідовність порівняно з послідовністю будь-якої ДНК, що зустрічається у природі. Відповідно до цього винаходу, були сконструйовані послідовністі нуклеїнової кислоти, зокрема, послідовності ДНК, які кодують Bt Cry токсини або їх варіанти. Нові послідовності ДНК тут позначаються як cry1C1-4, cry1B1, cry1B2, cry1D1, і cry1D2, a закодовані ними білки тут позначаються як сrу1С (напр., сrу1С1, сrу1С3, і сrу1С4), сrу1В (напр., сrу1В1 і сrу1В2) і Cry1D (напр., Cry1D1 і Cry1D2) білки. Також тут забезпечується нова ДНК послідовність, яка кодує модифікований хлоропластний транзитний пептид, напр., ДНК, що включає послідовність SEQ ID No. 16 від положення нуклеотиду 7 до положення нуклеотиду 371, зокрема, послідовність SEQ ID No. 16, яка створена для оптимальної експресії у рослин, зокрема, овочевих культур, таких як рослини, що належать до родини Brassicaceae, особливо капусти і цвітної капусти. Відповідно до цього винаходу, " сrу1С білок" стосується будь-якого інсектицидного білка, який містить найменший фрагмент амінокислотної послідовності SEQ ID No. 2, що зберігає інсектицидну активність (у подальшому називається як "найменший токсичний фрагмент"), зокрема, будь-який білок, який містить амінокислотну послідовність від амінокислоти у положенні 29 до від амінокислоти у положенні 627 у SEQ ID No. 2, переважно будь-який інсектицидний білок, який включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 2 від амінокислоти у положенні 3 до амінокислоти у положенні 627. Також тут включений інсектицидний білок, який містить амінокислотну послідовність SEQ ID No. 2 (далі називається як сrу1С1 білок), SEQ ID No. 5 (далі називається як Сrу1С3 білок) або SEQ ID No. 7 (далі також називається сrу1С4 білок). Сrу1С білок, який включає амінокислотну послідовність від амінокислоти у положенні 29 до амінокислоти у положенні 627 в SEQ ID No. 2, зберігає всю або більшість інсектицидної активності нативного білка, утвореного в природі, і додавання білкової послідовності у N- або Стермінальній його частині не призводить до знищення цієї активності. Відповідно, будь-який білок, який характеризується амінокислотною послідовністю, що містить або включає цю ділянку, може бути використаний і є частиною цього винаходу. Це включає інсектицидні гібридні або химерні білки, які містять найменші токсичні фрагменти білка послідовності SEQ ID No. 2. У 3 UA 98108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 це визначення включені також варіанти білків, які включають амінокислотну послідовність від амінокислоти в положенні 29 до амінокислоти в положенні 627 в SEQ ID No. 2, такі як інсектицидні білки, що містять послідовність, яка має ідентичність послідовності, щонайменше, 95 %, зокрема, щонайменше, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % рівня амінокислотної послідовності стосовно цієї ділянки SEQ ID No.2, обчислюються за допомогою алгоритму глобального вирівнювання Нідельмана-Вунша (Needleman-Wunsch) в EMBOSS (Rice et al., 2000), для того щоб виявити оптимальне вирівнювання уздовж всієї послідовності, використовуючи установочні параметри за замовчуванням (штраф за відкриття гепу 10, штраф за розширення гепу 0.5); для порівняння амінокислотних послідовностей, використовується матриця EBLOSUM62), переважно білки, що мають декілька, переважно 5-10, зокрема, менше, ніж 5, амінокислот, які були заміщені, додані або вилучені без істотної зміни, переважно без зміни, інсектицидної активності білка. Кращі варіанти сrу1С білка винаходу включають білок, який включає послідовність SEQ ID No. 2 від амінокислоти у положенні 29 до амінокислоти у положенні 627, де, однак, одна, декілька або всі серед наступних амінокислот у наступних положеннях, порівняно з положеннями в SEQ ID No. 2, замінюються: амінокислота в положенні 125 являє собою аланін, амінокислота в положенні 184 є аланін, амінокислота в положенні 295 є аргінін, амінокислота в положенні 454 є аспарагінова кислота, або амінокислота в положенні 593 являє собою аргінін. Також тут включені будь-які варіанти, що походять від сrу1С білка, гібриди або мутанти, які головним чином зберігають ту ж інсектицидну активність, що й сrу1С білок винаходу, визначений вище. Термінологія ДНК або білок, "які включають" певну послідовність X, як тут використовується, стосується ДНК або білка, які включають або містять, щонайменше, послідовність X, так що інші нуклеотидні або амінокислотні послідовності можуть бути включені у 5' (або N-термінальному) і/або 3' (або С-термінальному) кінці, напр., (нуклеотидна послідовність) селективний маркерний білок, як розкрито в EP 0 193 259, (нуклеотидна послідовність) транзитний пептид, і/або 5' або 3' лідерна послідовність. Для мети цього винаходу, "ідентичність послідовності" двох споріднених нуклеотидних або амінокислотних послідовностей, що виражається як відсоток, стосується кількості позицій у двох оптимально "вирівняних" послідовностях, які мають ідентичні залишки (х100), розділене на число позицій, які порівнюються. Розрив, тобто положення у вирівнюванні, де залишок присутній у одній послідовності, але відсутній у іншій, вважається положенням з неідентичними залишками. Вирівнювання двох послідовностей проводиться за допомогою алгоритму Нідельмана-Вунша (Needleman and Wunsch 1970) в EMBOSS (Rice et al., 2000), для того щоб виявити оптимальне вирівнювання по всій довжині послідовності, використовуючи установочні параметри за замовчуванням (штраф за відкриття гепу 10, штраф за розширення гепу 0.5). "Найменший токсичний фрагмент" Cry білка винаходу, як тут використовується, являє собою найменший фрагмент або частину Cry білка, яка зберігає інсектицидну активність, що може бути отримана шляхом ензиматичного, таким як трипсин, хемотрипсин, розщеплення непроцесованого Cry білка, або найменший фрагмент або частина Cry білка, що зберігає інсектицидну активність, яка може бути отримана за допомогою нуклеотидних делецій в ДНК, що кодує Cry білок. Такі найменші токсичні фрагменти можуть також бути отримані шляхом обробки Cry білка за допомогою рідини з кишечника комах, переважно соку середнього кишківника, отриманого з виду комах, що є сприйнятливим (тобто, знищує або у інший спосіб негативно впливає на ріст і живлення) до такого Cry білка. Відповідно до цього винаходу, "Cry1D білок" стосується будь-якого інсектицидного білка, який включає найменший токсичний фрагмент амінокислото! послідовності SEQ ID No. 15, зокрема, будь-який інсектицидний білок, що включає амінокислотну послідовність від амінокислоти у положенні 21 або 29 до амінокислоти у положенні 604 послідовності SEQ ID No. 15, переважно будь-який інсектицидний білок, що включає амінокислотну послідовність послідовності SEQ ID No. 15 від амінокислоти у положенні 3 до амінокислоти у положенні 604. Також тут включений інсектицидний білок, який включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 13 (у цьому описі називається Cry1D1 білок) або SEQ ID No. 15 (також називається Cry1D2 білок). Сrу1D білок, який включає амінокислотну послідовність від амінокислоти у положенні 29 до амінокислоти у положенні 604 в SEQ ID No. 15, зберігає всю або переважну частину інсектицидної активності природного білка, додавання білкової послідовності у N- або Стермінальній його частині не порушує цієї активності. Відповідно, будь-який білок, що характеризується амінокислотною послідовністю, яка містить або включає цю ділянку, використовується і складає частину цього винаходу. Це включає інсектицидні гібридні або химерні білки, які включають найменші фрагменти токсичного білка SEQ ID No. 15. Це визначення також включає варіанти білка, які відрізняються амінокислотною послідовністю від 4 UA 98108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 амінокислоти у положенні 29 до амінокислоти у положенні 604 в SEQ ID No. 15, так що білки з ідентичністю послідовності, щонайменше, 95 %, зокрема, щонайменше 97 %, щонайменше 98 % або, щонайменше 99 % рівня амінокислотної послідовності в цій ділянці SEQ ID No. 15, як визначається за допомогою алгоритму глобального вирівнювання Нідельмана-Вунша в EMBOSS (Rice et al., 2000), для того щоб виявити оптимальне вирівнювання уздовж всієї послідовності, використовуючи установочні параметри за замовчуванням (штраф за відкриття гепу 10, штраф за розширення гепу 0.5), для порівняння амінокислотних послідовностей, використовується матриця EBLOSUM62), переважно, білків, що мають декілька, переважно, 510, зокрема, менше, ніж 5 амінокислот, які були вставлені, заміщені або вилучені в ділянці від амінокислоти в положенні 29 до амінокислоти в положенні 604 в SEQ ID No. 15 без істотної зміни, переважно без зміни інсектицидної активності цього білка. Відповідно до цього винаходу, " сrу1В білок" стосується будь-якого інсектицидного білка, який включає найменший токсичний фрагмент амінокислотної послідовності SEQ ID No. 11, зокрема, будь-який інсектицидний білок, що включає амінокислотну послідовність від амінокислоти у положенні 31 до амінокислоти у положенні 648, у SEQ ID No. 11, переважно будь-який інсектицидний білок, що включає амінокислотну послідовність SEQ ID No. 11 від амінокислоти у положенні 3 до амінокислоти у положенні 648. Тут також включений будь-який інсектицидний білок, що містить амінокислотну послідовність SEQ ID No. 11 або SEQ ID No. 9. сrу1В білок, який включає амінокислотну послідовність від амінокислоти в положенні 31 до амінокислоти в положенні 648 в SEQ ID No. 11, зберігає всю або переважну частину інсектицидної активності нативного білка, як він був створений в природі, і додавання білкової послідовності в N- або С-термінальній його частині не порушує цієї активності. Відповідно, будьякий білок, який характеризується амінокислотною послідовністю, що містить або включає цю ділянку, є корисною і становить частину цього винаходу. Це включає інсектицидні гібридні або химерні білки, які включають найменші фрагменти токсичного білка SEQ ID No. 11. Це визначення включає також інсектицидні білки, які несуть варіанти амінокислотної послідовності від амінокислоти в положенні 31 до амінокислоти в положенні 648 в SEQ ID No. 11, такі як інсектицидні білки, що мають ідентичність послідовності, щонайменше, 80 %, зокрема, щонайменше, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, або, щонайменше, 99 % в рівні амінокислотної послідовності в цій ділянці SEQ ID No. 11, як визначено за допомогою попарного вирівнювання з використанням алгоритму глобального вирівнювання Нідельмана-Вунша в EMBOSS (Rice et al., 2000), для того щоб виявити оптимальне вирівнювання по всій довжині послідовності, за допомогою установки, яка вибирається по замовчуванню (штраф за відкриття гепу 10, штраф за розширення гепу 0.5), для порівняння амінокислотної послідовності використовується матриця EBLOSUM62), переважно білки, які мають, переважно 5-Ю, зокрема, менше, ніж 5, амінокислот, вводили заміщували або видаляли в амінокислотній послідовності від амінокислоти в положенні 31 до амінокислоти в положенні 648 в SEQ ID No. 11 без істотних змін, переважно, без змін, інсектицидної активності білка. Кращі варіанти сrу1В білка винаходу включають інсектицидний білок, який включає послідовність SEQ ID No. 11 від амінокислоти 31 до 648, однак, де амінокислота в положенні 151 в SEQ ID No. 11 являє собою тирозин або амінокислота в положенні 353 in SEQ ID No. 11 є аргінін, або білок, в якому амінокислота в положенні 151 в SEQ ID No. 11 являє собою Тирозин і амінокислота в положенні 353 в SEQ IDNo. 11 аргінін. Як тут використовується, терміни ДНК або ген, як в " сrу1С1 ДНК", стосуються будь-якої послідовності ДНК, що кодує сrу1С, сrу1В або Cry1D білки, відповідно, як було визначено вище. Це включає природні, штучні чи синтетичні послідовності ДНК, що кодують сrу1С, сrу1В або Cry1D білки, визначені вище, як, наприклад, будь-яка з-поміж послідовностей SEQ ID Nos. 2, 5, 7, 9, 11, 13, 15. Також тут включені послідовності ДНК, які кодують інсектицидні білки, що достатньо подібні до будь-якої послідовності ДНК SEQ ID Nos. 1, 3, 4, 6, 8, 10, 12, або 14, внаслідок чого вони можуть (тобто, мають здатність) гібридизувати ці ДНК послідовності за строгих умов гібридизації. Строгі умови гібридизації, як тут використовується, стосуються, зокрема, наступних умов: !мобілізація відповідної ДНК послідовності на фільтрі, "передгібридизація" фільтрів протягом від 1 до 2 годин в 50 % формаміді, 5 % SSPE, 2х реактиві Денхардта і 0.1 % SDS при 42° C, або від 1 до 2 годин в 6х SSC, 2х реактиві Денхардта і 0.1 % SDS при 68°С. Після цього додаються денатуровані dig- або радіо-мічені зонди безпосередньо до передгібридизаційної рідини. Інкубування проводиться протягом від 16 до 24 годин при відповідній температурі, зазначеній вище. Після інкубування, фільтри промивали протягом 30 хвилин при кімнатній температурі 2х SSC, 0.1 % SDS, після чого ще двічі промивали протягом 30 хвилин при 68C в 0.5 χ SSC і 0.1 % SDS. Авторадіографічний знімок отримують, розташовуючи фільтри протягом від 24 до 48 годин на рентгенівській плівці (Kodak XAR-2 або 5 UA 98108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 аналогічній) при -70°С з використанням підсвічуючого екрану. Звичайно, у цьому процесі можуть застосовуватись аналогічні умови або параметри, за умови, що бажані строгі умови гібридизації зберігаються. Кращі варіанти ДНК сrу1С, сrу1В або сrу1D цього винаходу являють собою ДНК, що кодує інсектицидний сrу1С, сrу1В або Cry1D варіанти білка, описані вище. Включені тут також сrу1С ДНК або ген, як тут визначено, являють собою: а) ДНК, яка включає нуклеотидну послідовність SEQ ID No. 1 від нуклеотиду в положенні 85 до нуклеотиду у положенні 2073, b) ДНК, яка включає нуклеотидну послідовність SEQ ID No. 3 від нуклеотиду в положенні 85 до нуклеотиду у положенні 2073, с) ДНК, яка включає нуклеотидну послідовність SEQ ID No. 1 від нуклеотиду в положенні 85 до нуклеотиду у положенні 2073, "злиту" з послідовністю ДНК SEQ ID No. 16, d) ДНК, яка включає нуклеотидну послідовність SEQ ID No. 4 від нуклеотиду в положенні 7 до нуклеотиду у положенні 2439, e) ДНК, яка включає нуклеотидну послідовність SEQ ID No. 3 від нуклеотиду в положенні 85 до нуклеотиду у положенні 2073, "злиту" з послідовністю ДНК SEQ ID No. 16, або f) ДНК, яка включає нуклеотидну послідовність SEQ ID No. 6 від нуклеотиду в положенні 7 до нуклеотиду у положенні 2439. Включені тут також Cry1D ДНК або ген, як тут визначено, являють собою: а) ДНК, яка включає нуклеотидну послідовність SEQ ID No. 14 від нуклеотиду в положенні 85 до нуклеотиду у положенні 1812, або b) ДНК, яка включає нуклеотидну послідовність SEQ ID No. 12 від нуклеотиду в положенні 7 до нуклеотиду в положенні 2178. Включені тут також сrу1В ДНК або ген, як тут визначено, являють собою: а) ДНК, яка включає нуклеотидну послідовність SEQ ID No. 8 від нуклеотиду в положенні 7 до нуклеотиду у положенні 2310, або b) ДНК, яка включає нуклеотидну послідовність SEQ ID No. 10 від нуклеотиду в положенні 91 до нуклеотиду у положенні 1944. ДНК послідовності сrу1С, сrу1В або cry1D генів цього винаходу (як показано у переліку послідовностей, без послідовності транзитного пептиду) виявляють не більше, ніж лише 76.6 % ідентичності послідовності з найближчою відомою до цього послідовністю ДНК, відомою з баз даних. Бази даних доступних послідовностей були перевірені для пошуку послідовностей з ідентичністю найближчої послідовності за допомогою загальновідомого BLAST алгоритму, потім за допомогою алгоритму глобального вирівнювання Нідельмана-Вунша в EMBOSS (Rice et al., 2000) було використано, для того щоб виявити оптимальне вирівнювання між найближчими послідовностями винаходу (беручи до уваги їх повну довжину, використовуючи установки по замовчуванню (штраф за відкриття гепу 10, штраф за розширення гепу 0.5). Для ДНК Cry1D, фрагмент попередньої відомої послідовності (однакової довжини) був обраний, для того щоб гарантувати оптимальне вирівнювання, однак навіть тоді лише 72.5 % ідентичності послідовності становила ідентичність найближчої послідовності з будь-якою відомою послідовністю ДНК, що є доступною з бази даних. Відповідно, включені тут також як сrу1С, сrу1В або cry1D гени являють собою ДНК послідовності, які кодують інсектицидний білок з, щонайменше, 80 %, 90 %, переважно, щонайменше від 93 до 97 %, зокрема, щонайменше 98 % або щонайменше 99 %, ідентичності послідовності з будь-якою кодуючою послідовністю SEQ ID No. 1, 3, 4, 6, 8, 10, 12, або 14 або ДНК послідовністю, яка кодує інсектицидний білок, гібридизуючись з будь-якою з-поміж SEQ ID No. 1, 3, 4, 6, 8, 10, 12, або 14 за умов строгої гібридизації, переважно, гібридизуючись з частиною ДНК послідовності з будь-якої SEQ ID No.No. 1, 3, 4, 6, 8, 10, 12, або 14, яка потрібна для кодування найменшого фрагменту токсичного білка білка цього винаходу. Ідентичності послідовності ДНК, вказані тут, обчислюються за допомогою алгоритму глобального вирівнювання Нідельмана-Вунша в EMBOSS (Rice et al., 2000), для того щоб виявити оптимальне вирівнювання уздовж всієї послідовності, використовуючи установочні параметри по замовчуванню (штраф за відкриття гепу 10, штраф за розширення гепу 0.5); для порівняння послідовностей ДНК, використовується EDNAFULL матриця), за умов строгої гібридизації, як було визначено вище. "Інсектицидна активність" білка, як тут використовується, означає здатність білка вбивати комах, інгібувати їх ріст або призводити до зменшення живлення комах, якщо такий білок поглинається комахами, переважно, шляхом експресії у рекомбінантного господаря, такого як рослинна клітина. Є зрозумілим, що активність щодо комах одного виду, переважно, його личинок, є достатньою, для того щоб білок мав інсектицидну активність як тут використовується, хоча часто білками цього винаходу вражаються комахи різних видів. Рекомбінантні господарі, які експресують, щонайменше, один з-поміж сrу1С, сrу1В або Сrу1D білків винаходу зазвичай створюються або призначені для конкретної більшості видів комах-шкідників для певної сільськогосподарської культури або певного регіону, де ці види комах є шкідниками, напр., міль капустяна для рослин видів Brassica, однак інші види комах також можуть контролюватись за допомогою рекомбінантних господарів цього винаходу, таких як трансгенні рослинні клітини або 6 UA 98108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 4550 55 рослини, напр., як приклад можна навести трансгенні рослини цвітної капусти (Brassica) або рослинні клітини чи рослини капусти винаходу, які включають ген сrу1D і/або сrу1В відповідно до цього винаходу. "Кількості, які контролюють чисельність комах" або "контролювання чисельності" за допомогою білка або рекомбінантного господаря, який експресує білок цього винаходу, як тут використовується, стосується кількості білка, що є достатньою, для того щоб обмежити шкоду, яку можуть заподіяти рослинам шкідники, що живляться на цих рослинах, напр., шляхом знищення комах або інгібування розвитку комах, плодовитості або росту, чи у інший спосіб, що забезпечує зменшення шкоди, заподіяної видом комах, рослині. Це не означає, що обробка рослин хімічними інсектицидами більше непотрібна (напр., для того щоб контролювати чисельність видів комах, на які не впливають білки винаходу, такі як (вторинні) комахи-шкідники із рядів жорсткокрилих (Coleoptera) або двокрилих (Diptera), однак це означає, що обробка хімічними інсектицидами комах, щодо яких застосовуються білки винаходу, може бути істотно зменшена, або застосування хімічних інсектицидів можна взагалі уникнути, якщо отримати прийнятну продуктивність рослин в польових умовах і прийнятний врожай. Відповідно до цього винаходу, комахи, сприйнятливі до нових Cry білків винаходу, контактують з цими білками у кількості, що дозволяє контролювати численність комах, зокрема, у кількостях, що вбивають комах. В одному втіленні цього винаходу, рекомбінтні господарі винаходу, такі як трансгенні рослинні клітини або рослини винаходу, експресують білок або комбінацію білків винаходу у високих рівнях, що дає змогу забезпечити рівень "високої дози". Вислів "високий рівень дози", "висока доза резистентності у комах" або "висока доза", як тут використовується, коли йдеться про рекомбінантні рослинні клітини або рослини, стосується концентрації інсектицидного білка у рослинній клітині або рослині (визначається за допомогою ELISA-тесту як відсоток загального розчинного білка, який визначається після екстракції розчинних білків у екстракційному буфері (напр., екстракційному буфері, описаному у Jansens et al., 1997) за допомогою Bradford аналізу (Bio-Rad, Richmond, CA; Bradford, 1976)), яка вбиває комаху-мішень на такій стадії розвитку, яка є істотно менш сприйнятливою, переважно, у від 25 до 100 разів менше сприйнятливою до токсину, ніж стадія першої личинки комахи, У такий спосіб можна очікувати, що забезпечено повний контроль чисельності комах. У одному втіленні це стосується отримання, принаймні, 97 відсотків, переважно, принаймні, 99 відсотків, ще найкраще, 100 відсотків смертності личинки четвертої вікової групи (для комах, що мають 5 вікових станів) або личинки останньої вікової групи (для комах, що мають 4 або менше вікових станів личинок) комахи-мішені, що становить від 10 до 14 днів після зараження такої рослинної клітини або рослини, як було визначено у звичайних біотестах, переважно на біотестах із застосуванням цілих рослин, використовуючи прийнятний контроль. Наявність одного дослідного виду комахи-мішені (тобто, виду комах, переважно її личинки, яка може завдати істотних пошкоджень виду рослин чи різновидностей, і яким є, як правило, комаха, для якої трансгенна Bt рослина конструюється і створюється), для якого трансформовані рослинні клітини або рослини відповідно до цього винаходу, забезпечують рівень "високої дози" резистентності комах, є достатньою, для того щоб рослина створювалась як така, що забезпечує високий рівень експресії відповідно до цього винаходу. Переважно комахи-мішені для білків цього винаходу є комахи-шкідники рослин, які спричиняють екомічні збитки. Терміни " сrу1 білок/ДНК" або "Cry білок/ДНК цього винаходу", як тут використовується, стосується будь-якого з сrу1С, сrу1В, або Cry1D білків або будь-якої послідовності ДНК сrу1С, сrу1В або сrу1D, як тут визначається. A Cry або сrу1 білки, як тут використовується, можуть бути нативним білком, який також називається протоксином, або може бути усіченою (процесованою) формою білка, яка має таку довжину, що забезпечує збереження інсектицидної активності, або може бути комбінацією різних білків у гібридному або злитому білку. "Протоксин" стосується непроцесованого (нативного) інсектицидного кристалічного білка, як він кодується природною послідовність ДНК Bt, "токсин" стосується його інсектицидного фрагменту, зокрема, його найменшого токсичного фрагменту, як правило, його молекулярна вага варіює у проміжку, приблизно, 50-65 кД, зокрема, приблизно, 60 кД, як було визначено за допомогою SDS-PAGE електрофорезу шляхом порівняння із загальноприйнятими стандартами молекулярної ваги. "Химерний ген", як тут використовується, використовується, для того щоб посилатись на генну або ДНК послідовність, які включають, щонайменше два різні фрагменти ДНК (такі як промотор, 5' нетрансльовану послідовність, кодон, інтрон, 3' нетрансльований трайлер, і 3' кінець створення транскрипту і ділянку поліаденілювання), які природньо не пов'язані один з іншим або які походять з різних джерел. Як правило, химерний ген, який експресується у рослині, як тут використовується, являє собою ген, що включає промотор, зшитий з 7 UA 98108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 синтетичною, створеною людиною послідовністю, такий як будь-який з-поміж сrу1С, сrу1В або cry1D генів цього винаходу. ДНК послідовності, які кодують сrу1 білки винаходу, можуть бути створені за допомогою хімічного синтезу з використанням загальноприйнятих методик, і можуть бути вставлені у експресувальні вектори, для того щоб отримати великі кількості сrу1 білків. сrу1 білки можуть використовуватися для приготування моноклональних або поліклональних антитіл за допомогою традиційних методик (Hofte et al., 1988), для того щоб провести імунологічний аналіз (напр., ELISA, Вестерн-блоттинг, покриті антитілами вимірювальні стрічки), щоб визначити присутність або відсутність цих білків у будь-якому матеріалі, такому як рослинний матеріал. Засоби, що були створені, для того щоб ідентифікувати трансгенні рослинні клітини, рослини або рослинний матеріал, такий як листки або насіння, який містить будь-який з сrу1 генів винаходу, інтегрований у їхній геном, або продукти, що містять ДНК, які включають чи походять від рослинного матеріалу, який містить сrу1 ген винаходу, ґрунтуються на особливостях специфічних послідовностей нових генів винаходу, таких як, специфічна рестрикційна карта ділянки геному, який містить інтродукований (чужорідний) сrу1 ген, молекулярні маркери або послідовність чужорідної ДНК інтегрованої у геном рослини. Якщо послідовність чужорідної ДНК, такої як гени сrу1 винаходу, відома, можуть бути створені праймери і зонди, які специфічно розпізнають ці послідовності в нуклеїновій амінокислоті (ДНК або PHK) зразка, шляхом застосування молекулярно-біологічної методики. Наприклад, може бути розроблений ПЛР-метод, для того щоб ідентифікувати гени винаходу у біологічних зразках (таких як зразки рослин, рослинний матеріал або продукти, що включають цей рослинний матеріал). Така методика ПЛР ґрунтується на, щонайменше, двох специфічних "праймерах", напр., один з них розпізнає послідовність в межах сrу1 гену, а інший - розпізнає послідовність в межах послідовності зв'язаного транзитного пептиду або в межах регуляторних ділянок, таких як промотор або 3' кінець гібридного гена, яка містить вказаний сrу1 ген винаходу, або обидва з них специфічно розпізнають сrу1 ген винаходу. Праймери переважно мають послідовність між 15 і 35 нуклеотидами, яка за умов оптимізованої полімеразноланцюгової реакції (ПЛР) "специфічно розпізнає" послідовність в межах сrу1 химерного гену винаходу, так що специфічний фрагмент ("фрагмент інтеграції" або розпізнаючий амплікон) ампліфікується із зразка нуклеїнової кислоти, що містить сrу1 ген винаходу. Це означає, що лише визначений фрагмент інтеграції, а не жодна інша послідовність у рослинному геномі або чужорідній ДНК, ампліфікується за умов оптимізованої полімеразно-ланцюгової реакції (ПЛР). ПЛР праймери, прийнятні для винаходу, являють собою олігонуклеотиди, довжина яких варіює від 17 до, приблизно, 200 нуклеотидів, що включають нуклеотидну послідовність з, щонайменше, 17 послідовних нуклеотидів, переважно, 20 послідовних нуклеотидів, відібраних з послідовності химерного гена сrу1С, сrу1В або cry1 D, перенесені у рослинні клітини або рослини винаходу. Праймери, зазвичай, можуть бути довшими, ніж згадані 17 послідовних нуклеотидів, та можуть, наприклад, бути 20, 21, 30, 35, 50, 75, 100, 150, 200 або навіть більше нуклеотидів завдовжки. Праймери можуть повністю складатись з нуклеотидних послідовностей, обраних з нуклеотидних послідовностей сrу1. Однак, нуклеотидна послідовність праймерів на їх 5' кінці (тобто ззовні від 3'-розташованих 17 послідовних нуклеотидів) є менш важливою. Таким чином, 5' послідовність цих праймерів може складатись з нуклеотидної послідовності, обраної з послідовності химерного гена сrу1, як прийнятної, але й може містити декілька (наприклад, 1, 2, 5, 10) помилкових спарювань основ. Така 5' послідовність цих праймерів може навіть бути повністю утворена нуклеотидною послідовністю, не пов'язаною з генами сrу1 цього винаходу, такою як нуклеотидна послідовність, що являє собою один або більше сайтів розпізнавання ферментів рестрикції. Такі неспоріднені послідовності або фланківні ДНК-послідовності з помилковими спарюваннями основ мають бути, як правило, не більше, ніж 100 нуклеотидів завдовжки, краще не більше, ніж 50 або не більше, ніж 25 нуклеотидів завдовжки. Більш того, прийнятні праймери можуть містити або включати нуклеотидну послідовність на їх 3' кінці, який з'єднує прилеглу ділянку між геном сrу1 цього винаходу та асоційованою послідовністю транзитного пептиду або регуляторні елементи у химерному гені сrу1, вбудовані в рослинну ДНК, такі як промоторна послідовність, лідерна послідовність, трейлерна послідовність або 3' термінації транскрипції та послідовність поліаденілювання. Також буде одразу зрозуміло досвідченому фахівцю, що належним чином обрані пари ПЛР праймерів не повинні містити послідовності, які є комплементарними одна до одної. Термін "праймер", як тут використовується, охоплює будь-яку нуклеїнову кислоту, що здатна ініціювати синтез щойно утвореної нуклеїнової кислоти у процесі, такому як ПЛР, який спрямовується матрицею. Зазвичай, праймери - це олігонуклеотиди від 10 до 30 нуклеотидів 8 UA 98108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 завдовжки, але довші послідовності теж можуть бути використані. Праймери можуть бути представлені у двохланцюговому вигляді, але краще, коли вони знаходяться в одноланцюговому вигляді. Зонди можуть використовуватись як праймери, але розроблені для того щоб зв'язувати ДНК- або РНК-мішень, і які не використовуються у процесі ампліфікації. Термін "розпізнавання", як тут використовується, коли є посилання на специфічні праймери, стосується того факту, що специфічні праймери специфічно гібридизуються з послідовністю нуклеїнової кислоти у генах сrу1 цього винаходу в умовах протоколу стандартної ідентифікації ПЛР, відповідно до якої специфічність визначається за наявністю позитивного і негативного контролю, що є загальновідомі у цій галузі. Також тут включений набір реактивів для виявлення генів сrу1 цього винаходу у біологічному матеріалі, а також для скринінгу біологічного матеріалу. Термін "кит", як тут використовується, містить набір реагентів для проведення ідентифікації генів сrу1 цього винаходу у біологічних зразках. Конкретніше, найкраще втілення набору реактивів у цьому винаході містить, принаймні, один або два специфічних праймери, як наведено вище. За вибором, набір реактивів, крім того, може містити будь-який інший реагент, описаний тут у протоколі ПЛР-ідентифікації. У інший спосіб, відповідно до іншого втілення цього винаходу, набір реактивів може містити специфічний зонд, як описано вище, який специфічно гібридизується з нуклеїновою кислотою біологічних зразків, для того щоб ідентифікувати наявність у них генів сrу1. За вибором, набір реактивів може також містити будь-який інший реагент (такий як мітка, що не обмежується лише застосуванням щодо буферу для гібридизації) для ідентифікації генів сrу1 у біологічних зразках за допомогою специфічного зонда. Стандартні ПЛР протоколи описані у сучасних методиках, таких як 'PCR Applications Manual' nd (Roche Molecular Biochemicals, 2 Edition, 1999). Оптимальні умови для ПЛР, включаючи послідовність специфічних праймерів, наведені у протоколі ідентифікації ПЛР для кожного рослинного зразка, що містить ген сrу1. Зрозуміло, що кількість параметрів у ідентифікаційному протоколі ПЛР може встановлюватись відповідно до специфічних лабораторних умов, та можуть бути дещо модифіковані, для того щоб отримати подібні результати. Наприклад, використання іншого методу для підготовки ДНК може потребувати встановлення, наприклад, кількості праймерів, полімерази та використаних умов "відпалювання". Аналогічно, відбір інших праймерів може потребувати застосування інших умов, що є оптимальними для протоколу ідентифікації ПЛР. Однак, необхідність цього узгодження є цілком очевидною для осіб, які є фахівцями у цій галузі, і, до того ж, це детально висвітлено у посібниках із даного застосування ПЛР, на один з яких ми посилались вище. Як приклади комбінацій прийнятних праймерів відповідно до даного винаходу можна навести (послідовність 5' - 3') для сrу1В гену винаходу: Р1В227 (TAC TTC GAA CAG AAA GAA CGA GAA CGA G, SEQ ID No. 20) і Р1В228 (GTC CAG CGA AAG GAA CTC CAA GAA, SEQ ID No. 21), і для сrу1С гену винаходу: Р1С247 (AAC CTT GAG GGA CTT GGA AAC, SEQ ID No. 22) і Р1С252 (AAG ATG AGG GTT TCT GAT AGC AG, SEQ ID No. 23). Відповідно, будь-який ген, що кодує інсектицидний білок сrу1В або rу1С, і специфічно розпізнається цими праймерами, включений тут, як і будь-який спосіб для визначення таких генів за допомогою таких або інших специфічних праймерів. Крім того можуть бути створені специфічні маркери або мічені зонди для визначення послідовностей ДНК цього винаходу, і будь-яке застосування специфічних маркерів або зондів, спрямованих на будь-який з-поміж сrу1С, сrу1В або сrу1D генів винаходу, включені тут. В одному втіленні винаходу специфічні маркери, праймери або мічені зонди не виявляють або не розпізнають будь-яку рослину, переважно будь-яку рослину того ж виду, що й дослідна рослина, яка не містить послідовність ДНК сrу1 білка винаходу, зокрема, будь-які такі маркери, праймери або мічені зонди не виявляють або не розпізнають будь-яку рослину, що експресує Cry1C, Cry1D або Сrу1В білок, де така рослина не містить послідовність ДНК винаходу (таку як ДНК сrу1С, сrу1D або сrу1В, як тут визначено, напр., ДНК, що містить нуклеотидну послідовність з будь-якої однієї SEQ ID No. 1, 3, 4, 6, 8, 10, 12, або 14). Послідовності ДНК цього винаходу можуть бути дещо модифіковані, враховуючи більшість сайтів рестрикції, або також можуть бути внесені незначні зміни, які не призводять до змін ефективності, без істотних змін, переважно без змін білків, які вони кодують. Дійсно, через виродження генетичного коду добре відомо, що кодони більшості амінокислот можуть бути заміщені іншими кодонами, без зміни амінокислотної послідовності білка. Відповідно, деякі амінокислоти можуть бути заміщені іншими еквівалентними амінокислотами, що не призводить до істотних змін, переважно істотних змін інсектицидної активності білка. Крім того, амінокислотна послідовність або склад в ділянці молекули, що відрізняється від тієї, що відповідає за зв'язування або утворення пор, менш очевидно, що викликає різницю в 9 UA 98108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 інсектицидній активності білка (напр., C-термінальна частина сrу1 протоксину може бути видалена або заміщена іншою амінокислотною послідовністю без зміни інсектицидної активності сrу1 білків винаходу). Еквівалентні послідовності ДНК послідовностям винаходу включають послідовності ДНК, з менше, ніж 20, переважно 5-10, нуклеотидними відмінностями у порівнянні з сrу1 генами винаходу, як тут визначено, однак які кодують інсектицидний сrу1 білок винаходу, як тут визначено. Незначні модифікації послідовності ДНК, що описані вище, можуть бути легко здійснені, зокрема, за допомогою ПЛР-опосередкованого мутагенезу (Ho et al.,1989, White et al., 1989). Більш глибокі модифікації послідовності ДНК можуть бути здійснені шляхом синтезу de novo ДНК бажаного кодону за допомогою наявних методик. Термін "кодуючий", як тут використовуєтся, при посиланні на ген, що кодує білок, стосується здатності такого гена продукувати білок внаслідок транскрипції і трансляції кодуючої послідовності, яка міститься в такому гені, у клітині господаря-мішені. Відповідно, химерний ген сrу1С1 винаходу кодує сrу1С1 білок винаходу, навіть якщо цей ген містить дві кодуючі послідовності, розділені послідовністю некодуючого інтрону. Термін "істотно той же", при посиланні на амінокислотну послідовність сrу1 білка винаходу, означає амінокислотну посідовність, яка відрізняється не більше ніж на 5 %, переважно, не більше, ніж на на 2 %, від амінокислотної послідовності білка, з яким порівнюється; і при посиланні на токсичність Cry білка, означає, що включений білок, величина LC50 якого за тих же умов біо-тесту (переважно, в тому ж біотесті з використанням комах з тієї ж популяції і прийнятному контролі) відрізняється не більше, ніж у 2 рази, переважно, не більше, ніж на 50 %, значення LC50, отриманого для білка, який порівнюється. "Мікроорганізм", як тут використовується, стосується будь-якого живого організму, якого можна досліджувати лише за допомогою мікроскопа, такого як бактеріальні, дріжджові клітини, рослинні клітини, віруси, гриби. Це, як правило, включає одноклітинні організми, що мають розміри, менші тих, які можна досліджувати візуально неозброєним оком, які можна розмножувати і маніпулювати в лабораторії, як правило, прокаріотичні або одноклітинні еукаріотичні форми життя, включаючи культуру тканин і плазміди. Послідовність ДНК сrу1 винаходу, отримана для загальної ДНК, може бути "вшита" в прийнятні експресувальні вектори і трансформована в прийнятних клітинах-господарях, з подальшим їх скринінгом за допомогою традиційних засобів виявлення наявності і експресії токсину. Пошук у базі даних щодо генів цього винаходу показує, що послідовності ДНК винаходу значно відрізняються від будь-яких описаних раніше генів або ДНК послідовностей, що кодують токсини, які мають активність проти лускокрилих (Lepidoptera) (див., напр., версію ДНК послідовностей від 26 січня, 2006 року, описану у заявках на патент (Geneseq release 200602), Hofte and Whiteley, 1989; Crickmore et al., 1998; та поновлену 2 серпня, 2005 року на вебсайті Bt номенклатури, відповідно до публікації Crickmore et al. (1998), що знаходиться на: http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil Crickmore/Bt/index.html). Найближча ідентичність послідовностей на рівні ДНК (для всієї довжини послідовностей винаходу) у доступних базах даних ДНК послідовностей (з наукових або запатентованих літературних джерел) становила 76.60 % для cry 1С ДНК SEQ ID No. 1 або З, 73 % для сrу1В ДНК SEQ ID No. 10, і 72.5 % для cry1D ДНК SEQ ID No. 14, використовуючи описані вище стандартні установки алгоритму глобального вирівнювання Нідельмана-Вунша в EMBOSS. Тому, припускаючи, що доступні бази даних ДНК послідовностей репрезентують усі відомі послідовності ДНК, у послідовностях ДНК даного винаходу відрізняються, принаймні, 23 % нуклеотидів від нуклеотидів у будь яких відомих раніше ДНК послідовностях. Припускаючи, що доступні бази даних містять найближчі послідовності, це свідчить про відмінність у, приблизно, 485 нуклеотидів для нуклеотидної послідовності SEQ ID No. 1 або 3, відмінність у, приблизно, 524 нуклеотидів для нуклеотидної послідовності SEQ ID No. 10, та відмінність у, приблизно, 498 нуклеотидів для нуклеотидної послідовності SEQ ID No. 14, у порівнянні з їх відповідними найближчими опублікованими послідовностями ДНК. Така відмінність буде навіть ще більшою для послідовностей ДНК SEQ ID No. 4, 6, 8, або 12, що кодують гібридний білок з транзитним пептидом. Також було з'ясовано, що послідовність ДНК цього винаходу оптимізованого транзитного пептиду хлоропласту цього винаходу (SEQ ID No. 16), що була пристосована для експресії у рослинах-мішенях винаходу, містить, приблизно, 76.1 % ідентичності послідовності (для частини, що має таку ж саму довжину, як і послідовність SEQ ID No. 16) у порівнянні з найближчою послідовністю ДНК, встановленою у доступних базах даних послідовностей ДНК і, таким чином, дуже відрізняється. 10 UA 98108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Під "інсектицидно активною частиною (часткою або фрагментом)" послідовності ДНК, що кодує білок сrу1, яка також тут називається "усічений ген" або "усічена ДНК", мається на увазі послідовність ДНК, що кодує поліпептид, який має менше амінокислот, ніж протоксична форма білка сrу1, але також має інсектицидну активність. Для того, щоб експресувати всю або інсектицидно активну частину ДНК послідовності, що кодує Cry білок даного винаходу, у рекомбінантному господарі, такому як E. соlі, в інших штамах Bt або в рослинах, можуть бути впроваджені відповідні сайти рестрикції, що фланкують послідовність ДНК. Це може бути здійснене за допомогою сайт-спрямованого мутагенезу, використовуючи добре відомі методики (Stanssens et al., 1989; White et al., 1989). Для того, щоб отримати кращу експресію в рослинах, гени сrу1 даного винаходу є штучними генами, в яких послідовність була пристосована для оптимальної експресії за допомогою синтезу ДНК. У такій послідовності заміщення ДНК послідовностей, що інгібують оптимальну експресію, досягається шляхом конструювання ДНК послідовностей, що містять кодони, кращі для рослин, головним чином роду або виду рослини-мішені. Для того щоб одержати посилену експресію в рослинах або попередити експресію інсектицидного білка поза рослинною клітиною господарем (наприклад, у бактеріальній клітинігосподарі), в одному із втілень даного винаходу рослинний інтрон інсертують у химерні сrу1 гени винаходу, найкраще у кодуючу послідовність, принаймні, одного з сrу1 генів винаходу. Будь-який з відомих рослинних інтронів (напр., Brown, 1986, Brown and Simpson, 1998, Brown et al., 1996) можуть бути використані тут, оскільки вони оперативно приєднуються до кодуючих фрагментів послідовності, для того, щоб забезпечити необхідний сплайсинг. Оперативне приєднання інтрона та необхідний сплайсинг, одержаний в результаті, зручно перевірити у цільових рослинах-господарях або їх клітинах за допомогою RT-PCR або Нозерн-блоттингу або за допомогою інших загальновідомих методів. В одному втіленні інтрон гену дводольної рослини використовується у генах, що експресуються у клітинах дводольної рослини, а інтрон однодольної рослини застосовується в генах, які повинні бути експресовані у однодольних рослин. В одному втіленні, інтрон винаходу є другим інтроном легкоіндукованого тканиноспецифічного гена ST-LS1 Solarium tuberosum (картопля) як описано Eckes et al. (1986), напр., нуклеотидна послідовність SEQ ID No. 1 між нуклеотидами під номером 672 та 862. В одному втіленні цього винаходу рослинний інтрон впроваджується в будь-яку Bt кодуючу послідовність інсектицидного пептиду, особливо інтрон SEQ ID No. 1 між нуклеотидами під номером 672 та 862, так, що він ефективно сплайсується в рослинних клітинах. Ефективний сплайсинг у рослинних клітинах може бути визначений за допомогою загальноприйнятих методів, таких як РТ-ПЛР (RT-PCR), Нозерн-блоттинг, або виявленням функціональних білків, що продукуються у рослинних клітинах. Звичайно, для ефективного сплайсингу інтрон повинен бути включений у правильну позицію кодуючої послідовності, таким чином, що в послідовності одержуються функціональні 5' та 3’ сайти сплайсингу. За допомогою RT-PCR аналізу було виявлено, що два cry гени винаходу, показані в SEQ ID No. 1 і 3, кожен з яких містить рослинний інтрон у різних місцях, були ефективно сплайсовані в рослинних клітинах Brassica oleraceae, і продукують мРНК-кодуючий очікуваний Cry білок. Згідно з одним втіленням даного винаходу, білки спрямовані на внутрішньоклітинні пластиди, головним чином хлоропласти, мітохондрії, або секретовані з клітини, потенційно оптимізуючи стабільність білка і/або експресію. З цією метою, химерні гени винаходу містять кодуючу ділянку, що кодує сигнальний або цільовий пептид, приєднаний до кодуючої ділянки Cry білка винаходу. Особливо бажані пептиди для включення у білки даного винаходу являють собою транзитні пептиди хлоропласта або інші пластиди-мішені, особливо дупліковані ділянки транзитного пептиду з рослинних генів, продукти яких спрямовані на пластиди, оптимізований транзитний пептид, описаний Lebrun et al. (1996), або Capellades et al. (Патент США № 5,635,618), транзитний пептид феридоксин - НАДФ+оксидоредуктази із шпинату (Oelmuller et al., 1993), транзитний пептид, описаний у Wong et al. (1992) і пептиди-мішені в опублікованій міжнародній заявці PCT № WO 00/26371. В одному втіленні винаходу транзитний пептид хлоропласта включає послідовність SEQ ID No. 17 від амінокислоти у положенні 3 до амінокислоти у положенні 124 або її варіанти, такі як транзитний пептид хлоропласта, що включає послідовність SEQ ID No. 17 від амінокислоти у положенні 3 до амінокислоти у положенні 124, де амінокислота цистеїн у положенні позиції 55 заміщена на тирозин в SEQ ID No. 17 і/або де амінокислота гліцин включена одразу після амінокислоти гліцин у положені 51 в SEQ ID No. 17. Також бажаними є сигнальні пептиди секреції білка, зв'язаного з такими пептидами із зовнішнього боку клітини, як наприклад сигнальний пептид секреції інгібітора Il протеїнази картоплі (Keil et al., 1986), сигнальний пептид секреції гена альфа-амілази 3 рису (Sutliff et al., 1991) і сигнальний пептид секреції білка PR1 тютюну (Comelissen et al., 1986). 11 UA 98108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Особливо корисні сигнальні пептиди, згідно із винаходом, включають транзитний пептид хлоропласта (напр., Van Den Broeck et al. (1985), або оптимізований транзитний пептид хлоропласта за Патентом США № 5, 510,471 та Патентом США № 5,635,618, що спричиняє транспорт білка до хлоропластів, секреторний сигнальний пептид або пептид, що націлює білок до інших пластидів, мітохондрій, ендоплазматичного ретикулуму або інших органел. Сигнальні послідовності для спрямування до внутрішньоклітинних органел або для секреції назовні рослинної клітини або до клітинної стінки, знайдені у природних або секретованих білках, переважно у тих, що описані Klösgen et al. (1989), Klösgen and Weil (1991), Neuhaus & Rogers (1998), Bih et al. (1999), Morris et al. (1999), Hesse et al. (1989), Tavladoraki et al. (1998), Terashima et al. (1999), Park et al. (1997), Shcherban et al. (1995), які повністю включені тут у вигляді посилань, особливо послідовності сигнальних пептидів із виявлених або секретованих білків рослин видів роду Brassica, кукурудзи, бавовника або сої. Кращою ДНК послідовністю, що кодує транзитний пептид винаходу є ДНК, що містить послідовність SEQ ID No. 16 від нуклеотида в положенні 7 до нуклеотида в положенні 371, особливо послідовності SEQ ID No. 16. Крім того, для будь-якої комахи-шкідника, що є мішенню, зв'язуючі властивості Cry білків винаходу можні оцінити за допомогою загальновідомих методів (напр., Van Rie et al., 1990) для того, щоб визначити, чи зв'язуються сrу1 білки винаходу із сайтами на середньому кишківнику комахи-мішені, які не розпізнаються (або конкурують за) іншими Cry або не-Cry білками. Інші Bt токсини, що зв'язуються з різними зв'язуючими сайтами у відповідних чутливих комах, або інші токсини, одержані із штамів Bt або інших джерел (таких як VIP токсини або інгібітори протеїназ комах (кишківника) із різним способом дії, є дуже цінними, оскільки вони експресуються у рослині надодаток до одного з сrу1 генів, тут наведених, з метою попередження або уповільнення розвитку стійкості у комах до рослин, що експресують інсектицидні токсини. Через характеристики нових сrу1 генів, вони є надзвичайно корисними для трансформації рослин, напр., однодольних рослин, таких як кукурудза або пшениця, і дводольних, таких як бавовник, соя та рослин видів роду Brassica, з метою захисту цих рослин від пошкодження комахами. Особливо для цілей управління стійкістю до комах по відношенню до конкретної комахишкідника, найкраще комбінувати сrу1С ген винаходу з іншим геном, що кодує інший білок контролю чисельності комах, особливо Bt кристалічний білок, який не розпізнає, принаймні, один сайт зв'язування, що розпізнається сrу1С білком у комахи-мішені. Кращими білками для контролю чисельності комах, що можуть бути скомбіновані з сrу1С білками винаходу, насамперед для одночасної експресії в рослинах, головним чином рослинах видів Brassica, особливо в капусті та цвітній капусті, включають сrу1В білок цього винаходу або сrу1D білок цього винаходу, VIP3Aa білок або його токсичний фрагмент, як описано у Estruch et al., 1996 та Патенті США № 6,291,156, або інсектицидні протеїни з штамів видів Xhenorhabdus, Serratia або Photorhabdus (напр., Waterfield et al., 2001; ffrench-Constant and Bowen, 2000). В одному втіленні, така ко-експресія досягається за допомогою трансформації рослини, що вже експресує білок контролю чисельності комах із сrу1 геном цього винаходу, або за допомогою схрещування рослин, трансформованих за допомогою білків, які контролюють чисельність комах, та рослин, трансформованих за допомогою сrу1 гену цього винаходу. Для рослин видів Brassica, переважно сrу1 ген використовується як перший гену, а як другий ген використовується білок сrу1В, сrу1D або VIP3Aa або їх варіанти чи похідні. Способи для одержання експресії різних Bt (або аналогічно, для інших білків, що контролюють чисельність комах) інсектицидних білків в тій же самій рослині, у намаганні мінімізувати або попередити розвиток резистентності до трансгенних, стійких проти комах рослин, описані в європейському Патенті № 0 408 403. В одному втіленні винаходу, сrу1С ген винаходу розташований в одному і тому ж самому локусі, що й другий ген контролю чисельності комах, такий як сrу1В або сrу1D ген, у трансгенних рослинних клітинах або рослинах винаходу, таким чином, що ці гени не роз'єднуються у нащадків таких рослинних клітин або рослин. Найкраще, з метою селекції, а також для підвищення ефективності контролю бур'янів, трансгенні рослини винаходу також трансформують за допомогою ДНК, що кодує білок, який інактивує гербіциди широкого спектру дії, або який кодує білок, що є варіантом білка-мішені для гербіциду, але цей варіант є нечутливим до таких гербіцидів, напр., гербіцидів на основі глюфозинату або гліфосату. Інсектицидно ефективний сrу1 ген, переважно сrу1 химерний ген, який кодує інсектицидно ефективну частину Cry протоксину, може бути стійко інсертований традиційними методами в ядерний геном рослинної клітини, і трансформована таким чином рослинна клітина може традиційно використовуватись, для того щоб одержати трансформовану рослину, яка має стійкість проти комах. В цьому відношенні, disarmed Ті-плазміда, яка містить інсектицидно ефективну частину гену сrу1, у Agrobacterium, напр., Agrobacterium tumefaciens, може 12 UA 98108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 використовуватись для трансформації рослинної клітини, внаслідок чого трансформована рослина може бути регенерована з трансформованої рослинної клітини за допомогою методів, описаних, наприклад, в європейському Патенті № 0 116 718, європейському Патенті № 0 270 822, публікації міжнародної заявки PCT № WO 84/02913 і опублікованій Європейській заявці на патент ("EP") № 0 242 246 і у De Block et al. (1989). Кожен з найкращих Ті-плазмідних векторів містить інсектицидно ефективну частину cry гену між обмеженими послідовностями, або, принаймні, розташовану зліва від правої обмеженої послідовності, Т-ДНК Ті-плазміди. Звичайно, для трансформації рослинної клітини можуть використовуватись інші типи векторів, з використанням таких методів, як пряме перенесення гена (як описано, наприклад, в європейському Патенті № 0 233 247), трансформація за допомогою пилку (як описано, наприклад, в європейському Патенті EP 0 270 356, в публікації міжнародної заявки PCT № WO 85/01856, та Патенті США № 4,684,611), трансформація рослинної PHK за допомогою вірусів (як описано, наприклад, в європейському Патенті № 0 067 553 та Патенті США № 4,407,956), трансформація з використанням ліпосом (як описано, наприклад, в Патенті США № 4,536,475), та інші методи, такі як методи трансформації певних ліній кукурудзи (напр., Патент США № 6,140,553; Fromm et al., 1990; Gordon-Kamm et al., 1990) та методи трансформації загалом однодольних рослин (публікація міжнародної заявки PCT № WO 92/09696). Для трансформації бавовника, особливо доцільним є метод, описаний у публікації міжнародної заявки PCT № WO 00/71733. Для трансформації сої, робляться посилання на загальновідомі методи, напр., Hinchee et al. (1988) та Christou et al. (1990) або метод за публікацією № WO 00/42207. Крім того, окрім трансформації ядерного геному, у винахід включена трансформація геному пластид, головним чином геному хлоропластів. Kota et al. (1999) описали метод експресії Сrу2А білка у хлоропластах тютюну, і Lin et al. (2003) описали експресію сrу1С гена в транспластомних рослинах табаку. Одержана трансформована рослина може бути використана за звичайною схемою гібридизації рослин з метою одержання нових трансформованих рослин із тими ж самими характеристиками, або для впровадження інсектицидно ефективної частини cry гена в інші різновиди тих самих або схожих видів рослин. Насіння, одержане від трансформованих рослин, містить інсектицидно ефективну частину cry гена як стабільний геномний інсерт. Інсектицидно ефективний сrу1 ген, переважно послідовність SEQ ID No. 1, 3, 4 або 6, інсертується в геном рослинної клітини таким чином, що вставлений ген знаходиться нижче (тобто, 3'), і під контролем промотора, що може спрямовувати експресію гена в рослинній клітині (як тут називається "рослинний промотор"). Це, зазвичай, здійснюється шляхом інсерції сrу1 химерного гена, що містить рослинний промотор у геномі рослинної клітини, особливо у ядерному або пластидному (напр., хлоропластному) геномі. Кращі рослинні промотори включають: сильні конститутивні 35S промотори ("35S промотори") вірусу мозаїки цвітної капусти (CaMV) ізолятів CM 1841 (Gardner et al., 1981), CabbB-S (Franck et al., 1980) та CabbB-JI (Hull and Howell, 1987); 35S промотор, описаний Odell et al. (1985), промотори родини убіхітину (напр., промотор убіхітину кукурудзи Christensen et al., 1992, див. також Cornejo et al., 1993), gos2 промотор (de Pater et al., 1992), промотор ему (Last et al., 1990), промотори актину Arabidopsis, такі як промотор, описаний An et al. (1996), промотори актину рису, такі як промотор, описаний Zhang et al. (1991); промотори вірусу мозаїки жилки Cassava (WO 97/48819, Verdaguer et al. (1998)), серія промоторів pPLEX із вірусу карликовості конюшини (WO 96/06932), особливо повторювана промоторна ділянка, вилучена від сегменту геному 4 або 7 вірусу конюшини (які тут називаються "S7S7" або "S4S4" промотори), описані Boevink et al. (1995) або Schunmann et al. (2003), алкогольдегідрогеназний промотор, напр., pAdhiS (інвентарні номери і GenBank X04049, Х00581), та TR1' промотор і TR2' промотор ("TR 1 промотор" і "TR2' промотор", відповідно), які направляють експресію 1' та 2' генів, відповідно, T-DNA (Velten et al., 1984). Альтернативно, може бути використаний промотор, який не є конститутивним, але специфічним для однієї або більше тканин або органів рослини (напр., листків і/або коренів), тому інсертована частина гену cry, експресується лише в клітинах специфічних тканин(и) або органу(ів). Наприклад, інсектицидно ефективна частина гену cry може бути селективно експресована у листі рослини (напр., кукурудза,бавовник) шляхом вміщення інсектицидно ефективної частини гену під контроль легкоіндукованого промотора, такого як промотор малої субодиниці гену рибулози-1,5-біфосфат карбоксилази самої рослини або іншої рослини, такої як горох, що було розкрито в Патенті США № 5,254,799. Іншою альтернативою є використання промотора, експресія якого індукується, найкраще ушкодженням, зумовленим живленням комах, напр., MPI промотор, описаний Cordera et аl. (1994), або Agrobacterium TR2' чи промотор маннопінсинтази (Velten et al., 1984) або промотор, який індукується хімічними факторами. 13 UA 98108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Інсектицидно активний cry ген краще включати у геном рослини таким чином, щоб інсертована частина гену знаходилась вище (тобто, 5') від відповідного 3' кінця сигнальних послідовностей регуляції транскрипції (тобто, сигнальні послідовності формування транскрипту та поліаденилювання). Це найкраще здійснювати шляхом інсерції химерного гена сrу1 у геном рослинної клітини. Найкращі сигнальні послідовності поліаденілювання та утворення транскрипту включають послідовності 3' нетрансльованої ділянки гену НАДФмалатдегидрогенази від Flaveria bidentis (Marshall et al., 1996), гену наполінсинтази (Depicker et al., 1982), гену октопінсинтази (Gielen et al., 1984) і гену 7 Т-ДНК (Velten and Schell, 1985), що працюють як 3'-нетрансльовані ДНК послідовності у трансформованих рослинних клітинах. В одному втіленні цього винаходу, принаймні один з генів винаходу, найкраще, принаймні 2, трансформуються у рослини, вибрані з групи, що складається з: кукурудзи, бавовника, гірчиці польової, хріну, японського хріну, еруки, крес-салату, редиски, каноли, сої, овочів, хрестоцвітих, рослин родини Brassicaceae, таких як цвітна капуста, білокачанна капуста, пекінська капуста, ріпа, гірчиця, олійна редька, капуста, броколі, брюссельська капуста, шпинат тощо. Особливим чином, в одному втіленні цього винаходу рослини видів Brassica захищаються від комах генами цього винаходу: В. carinata, B. elongata, B. fruticulosa, B. juncea, B. napus, B. narinosa, B. hirta, B. rosularis, B. nigra, B. oleracea, B. perviridis, B. rapa, B. rupestris, B. septiceps, B. tournefortii, та інші, особливо рослини виду Brassica oleraceae (такі як підвиди botrytis та capitate) або Brassica napus, a також рослини наступних родів: Raphanus (такі як R. sativus), Armoracia (такі як А. rusticana), Wasabia (такі як W. japonica), Eruca (такі як E. vesicaria), Nastrurtium (такі як N. officinale), та Lepidium (такі як L. sativum). Винахід включає перелічені вище рослини видів роду Brassica, у яких трансформовані принаймні один або два гени винаходу, такі як сrу1В та сrу1С гени винаходу, а також рослини, одержані внаслідок схрещування або вирощування з іншими спорідненими рослинами (включаючи рослини споріднених видів), що містять гени винаходу. Таке схрещування або вирощування може здійснюватись, використовуючи традиційні технології вирощування, що є загальновідомими, але можуть також включати роботи, що проводяться in vitro, такі як спасіння зародка (культура зародків), злиття протопластів, тощо. Винахід, таким чином, також стосується рослин видів родини Brassicaceae, таких як S. napus, B. rapa, B. juncea або В. cahnata, що містять ген або гени винаходу, такі як сrу1В та cry 1С гени винаходу, від схрещування з трансформованою рослиною S. oleracea або її нащадком, або з рослинами В. oleracea, що містять ген або гени винаходу, такі як сrу1В та сrу1С гени винаходу, від схрещування з трансформованою рослиною В. napus plant, а також використання таких рослин. Трансформація рослинних клітин також може застосовуватись для одержання білків винаходу у великих кількостях у культурах рослинних клітин, напр., для одержання сrу1 білка, що може після цього застосовуватись щодо сільськогосподарських культур після застосування відповідної технології. При посиланні тут на трансгенну рослинну клітину, йдеться про рослинну клітину (а також рослинний протопласт), ізольовану або у культурі тканин, або рослинна клітину (або протопласт), що міститься в рослині або в диференційованому органі або тканині, і усі можливості специфічно включені тут. Так, посилання на рослинну клітину в описі або формулі винаходу не відноситься лише до ізольованих клітин в культурі, а відноситься до будь-якої рослинної клітини, де б вона не знаходилась, і в якому б типі рослинної тканини або органі не була б присутня. Весь або частини сrу1 генів винаходу, які кодують білок, спрямований проти лускокрилих (Lepidoptera), також можуть бути використані для трансформації бактерій, таких як β. thuhngiensis, що має інсектицидну активність проти Lepidoptera або Coleoptera. Таким чином, трансформований штам Bt може бути отриманий, що використовується для боротьби з широким спектром комах-шкідників, які належать до рядів лускокрилих (Lepidoptera) і твердокрилих (жуків) (Coleoptera). Трансформація бактерії, такої як бактерія роду Pseudomonas, Agrobacterium, Bacillus або Escherichia, за допомогою сrу1 генів цього винаходу, включених у відповідний клонуючий вектор, може бути проведена традиційно, краще з використанням традиційних методів електропорації, як описано у Mahillon et al. (1989) і в опублікованій заявці на Патент (PCT Patent publication WO 90/06999). Трансформовані штами роду Bacillus, що містять cry ген цього винаходу можуть бути ферментовані за допомогою традиційних методів (Dulmage, 1981; Bernhard and Utz, 1993) для одержання великого виходу клітин. У відповідних умовах, що є добре відомими (Dulmage, 1981), викликають споруляцію кожного з цих штамів, для того щоб одержати кристалічні білки, що містять протоксин Cry у великій кількості. Інсектицидна композиція цього винаходу, зокрема, призначена для регулювання кількості комах-шкідників, що належать до ряду лускокрилих, може бути сформульована традиційним 14 UA 98108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 методом, з використанням мікроорганізмів, трансформованих за допомогою cry гену, або, переважно, їх відповідних Cry білків або Cry протоксину, токсину або інсектицидно ефективної частини протоксину як активного інгредієнту, разом із прийнятними носіями, розчинниками, емульгаторами і/або диспергаторами (напр., як описано Bernhard and Utz, 1993). Ця інсектицидна композиція може бути сформульована у вигляді змочуваної пудри, таблеток, гранул або порошку або у вигляді рідкої форми з водними або безводними розчинниками, такими як піна, гель, суспензія, концентрат тощо. Метод контролю чисельності комах, насамперед представників ряду Lepidoptera, відповідно до цього винаходу може включати нанесення {напр., розпилювання) на місце (ділянку), що підлягає захисту, інсектицидної кількості Cry білків у клітинах-господарях, трансформованих за допомогою cry гену цього винаходу. Місце, що підлягає захисту, може включати, наприклад, місце проживання комах-шкідників або рослинність чи територію, де ця рослинність вирощується. В одному втіленні цього винаходу, комахи, проти яких сrу1 гени або сrу1 білки винаходу можуть використовуватись, включають комах, відібраних з групи, що складається з : Plutella xylostella, Spodoptera exigua, Spodoptera littoralis, Spodoptera frugiperda, Trichoplusia nі, Heliothis virescens, Mamestra brassicae, Pieris brassicae, Manduca sexta, Choristoneura fumiferana, Choristoneura occidentalis, Choristoneura rosaceana, Pandemis pyrusana, Platynota stultana, Lymantria dispar, Orgyia leucostigma, Malacosoma disstria, Lambina fiscellaria, Chilo suppressalis, Chilo partellus, Scirpophaga incertulas, Argyrotaenia citrana, Artogeia rapa, Chrysomela scripta, Ostrinia nubilalis, Pseudoplusia includens, і Thaumetopoea pityocampa. B одному втіленні, Plutella xylostella (капустяна міль) є кращою комахою-мішенню. Це космополітний вид, що спричиняє великі втрати деяких хрестоцвітих рослин, особливо рослин, що належать до родини Brassicaceae. Сrу1С, сrу1В та сrу1D білки, які кодуються генами цього винаходу, є особливо важливими для контролю чисельності цієї комахи, напр., за допомогою експресії генів винаходу в клітинах рослини. Такі комахи можуть бути контрольовані шляхом висаджування або вирощування рослин, які містять один з сrу1С генів винаходу у польових умовах, або забезпечення присутності сrу1С білка, як тут вказано, в або на рослинах, заражених такими комахами (напр., засіванням або вирощуванням рослин роду Brassica, таких як капуста або цвітна капуста, трансформованих за допомогою сrу1С1 або сrу1С2 генів цього винаходу, або розпиленням композиції, що містить сrу1С білок цього винаходу). Винахід також пов'язаний із використанням сrу1 генів цього винаходу, принаймні сrу1С1 або сrу1С2 генів, у рослинах з метою їх захисту від комахшкідників, що належать до ряду Lepidoptera, краще у поєднанні з сrу1В або cry1D геном цього винаходу. В цьому винаході також забезпечується модифікована кодуюча послідовність, що кодує транзитний пептид хлоропласта. Така кодуюча послідовність має кодон, призначений для високих рівнів експресії в рослинах, особливо в рослинах родини Brassicaceae, таких як Brassica oleracea або Brassica napus, особливо капуста, цвітна капуста або олійна редька (канола). В одному втіленні винаходу, модифікований транзитний пептид включає нуклеотидну послідовність SEQ ID No. 16 від нуклеотиду у положенні 7 до нуклеотиду у положенні 371, особливо нуклеотидну послідовність SEQ ID No. 16. У цей винахід також включені рослинні клітини, рослини або насіння, що містять кодуючу послідовність транзитного пептиду винаходу, як і використання кодуючої послідовності транзитного пептиду винаходу для націлення будьякого білка на хлоропласти, зокрема на хлоропласти овочевих культур, зокрема, видів рослин роду Brassica. Ці та/або інші втілення винаходу відображені у формулюваннях формули винаходу, що складає частину опису винаходу. Наступні Приклади ілюструють винахід і представлені не для того, щоб обмежити винахід або пошук способів захисту рослин. Якщо не обумовлено щось інше, всі технології рекомбінантних ДНК проводяться відповідно до стандартних методик, які описані у Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY і в Томах 1 і 2 Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA. Стандартні матеріали та методи молекулярної роботи з рослинами описані у R.D.D. Croy Plant Molecular Biology Labfax (1993), виданих BIOS Scientific Publications Ltd (UK) і Blackwell Scientific Publications, UK. Нижче наведено перелік розкритих послідовностей, вищезгаданих в Прикладах, Формулі винаходу і описі: Перелік послідовностей: 15 UA 98108 C2 SEQ ID No. 1: оптимізована сrу1С1 кодуюча послідовність, що містить інтрон в положенні 672 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 SEQ ID No.2: амінокислотна послідовність білка сrу1С1, що кодується послідовністю SEQ ID No. 1 SEQ ID No.3: оптимізована сrу1С2 кодуюча послідовність, що містить інтрон в положенні 489 SEQ ID No.4: оптимізована сrу1С3 кодуюча послідовність, що містить послідовності SEQ ID No. 1 та SEQ ID No. 16, що кодує химерний білок із транзитним пептидом SEQ ID No.5: сrу1С3 білок, що кодується послідовністю SEQ ID No. 4 SEQ ID No.6: оптимізована сrу1С4 кодуюча послідовність, що включає послідовності SEQ ID No. 3 та SEQ ID No. 16, які кодують химерний білок із транзитним пептидом SEQ ID No.7: сrу1С4 білок, що кодується послідовністю SEQ ID No. 6 SEQ ID No.8: оптимізована сrу1В1 кодуюча послідовність, яка включає послідовність, що кодує транзитний пептид SEQ ID No.9: сrу1В1 білок, що кодується послідовністю SEQ ID No. 8 SEQ ID No. 10: оптимізована сrу1В2 кодуюча послідовність SEQ ID No. 11: сrу1В2 білок, що кодується послідовністю SEQ ID No. 10 SEQ ID No.12: оптимізована cry1D1 кодуюча послідовність, яка включає послідовність, що кодує транзитний пептид SEQ ID No. 13: Cry1D1 білок, що кодується послідовністю SEQ ID No. 12 SEQ ID No. 14: оптимізована cry1D2 кодуюча послідовність SEQ ID No. 15: Cry1D2 білок, що кодується послідовністю SEQ ID No. 14 SEQ ID No. 16: кодуюча послідовність, що кодує оптимізований транзитний пептид хлоропласта SEQ ID No. 17: транзитний пептид хлоропласта, що кодується послідовністю SEQ ID No. 16 SEQ ID No. 18: дуплікована послідовність S7 промотора вірусу карликовості конюшини (S7S7) SEQ ID No. 19: дуплікована послідовність (S4S4) промотора вірусу карликовості конюшини S4 SEQ ID No. 20: праймер Р1В227 гену сrу1В SEQ ID No. 21: праймер Р1В228 гену 1В SEQ ID No. 22: праймер Р1С247 гену сrу1С SEQ ID No. 23: праймер Р1С252 гену сrу1С ПРИКЛАДИ 1. Конструювання химерних генів та векторів трансформації. Деякі сrу1 гени були сконструйовані та зібрані за допомогою поєднання технологій з метою одержання генів з оптимальним проявом у рослинних клітинах. Сrу1С1 ДНК, що був сконструйований для оптимальної експресії у рослинних клітинах, представлений у SEQ ID No. 1. Ця ДНК кодує інсектицидний сrу1С1 білок винаходу (SEQ ID No. 2). Для трансформації рослин перший химерний ген (сrу1С1 химерний ген) сконструйований шляхом включення наступних функціонально приєднаних елементів (5' до 3'): промотора, що містить подвійну промоторну ділянку, одержану від сегменту 7 вірусу карликовості конюшини (S7S7 промотор, Boevink et al., 1995, SEQ ID No. 18), лідерної послідовності тапетум специфічного Е1 гена (GE1) Oryza sativa (Michiels et al., 1992), сrу1С1 ДНК, що містить другий інтрон легко індукованого тканиноспецифічного ST-LS1 гена Solarium tuberosum (Eckes et al., 1986) у позиції 672 (SEQ ID No. 1), і послідовності, що містить 3' нетрансльовану ділянку гена НАДФ-малатдегидрогенази від Flaveria bidentis (3' Ме1, Marshall et al., 1996). Подібний cry1 C химерний ген був створений, де ST-LS1 інтрон 2 знаходиться в положенні 489 сrу1С ДНК (тобто, сrу1С2 ДНК), це є сrу1С2 химерний ген, що також може бути сконструйований аналогічно до сrу1С1 химерного гена. Для забезпечення націлення сrу1С білка на хлоропласт рослинної клітини, варіанти сrу1С1 і сrу1С2 химерних генів є сконструйованими, і включають оптимізований транзитний пептид, що кодує модифіковану послідовність (SEQ ID No.16), як описано Lebrun et аl. (1996), функціонально приєднаний до кодуючої ділянки cry1 C, таким чином, що транзитний пептид гібридного білка експресується у рослинних клітинах. Це є сrу1С3 та сrу1С4 химерні гени, що включають кодуючі послідовності сrу1С3 і сrу1С4, відповідно, кожен з яких містить послідовність модифікованого транзитного пептиду хлоропласту SEQ ID No. 16. Послідовність ДНК сrу1С3 показана у SEQ ID No. 4, це результат з'єднання послідовності cry1C1 SEQ ID No. 1 із послідовністю, що кодує транзитний пептид SEQ ID No. 16. Послідовність ДНК гена сrу1С4 16 UA 98108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 представлена у SEQ ID No. 6, це результат з'єднання послідовності cry1C2 SEQ ID No. 3 із послідовністю, що кодує транзитний пептид SEQ ID No. 16. ДНК сrу1В1, що була сконструйована для оптимальної експресії у рослинних клітинах, представлена у SEQ ID No. 8. Ця ДНК кодує інсектицидний сrу1В1 білок винаходу (SEQ ID No. 9). Для трансформації рослин конструюється химерний ген (химерний ген сrу1В1) із включенням наступних функціонально приєднаних елементів (від 5' до 3'): промотора, що включає дупліковану ділянку промотора, одержаного від 4 сегмента геному вірусу карликовості конюшини (S4S4 промотор, Boevink et al., 1995, SEQ ID No. 19), лідерної послідовності гена Е1 (GE1) Oryza satlva (Michiels et al., 1992), ДНК сrу1В1, яка включає послідовність модифікованого транзитного пептиду хлоропласту SEQ ID No. 16, і послідовності, що включає 3' нетрансльовану ділянку гену НАДФ-малатдегидрогенази від Flaveria bidentis (3' Ме1, Marshall et al., 1996). Друга форма сrу1 В химерного гену також була створена з використанням ДНК сrу1 В2 (SEQ ID No. 10), яка не містить послідовність, що кодує оптимізований транзитний пептид, так що в рослинних клітинах має місце цитоплазматичне накопичення сrу1В білка. Це являє собою химерний ген сrу1В2. ДНК cry1D1, що була сконструйована для оптимальної експресії у рослинних клітинах, представлена на SEQ ID No. 12. Ця ДНК кодує інсектицидний Cry1D1 білок винаходу (SEQ ID No. 13). Для трансформації рослин химерний ген (cry1D1 химерний ген) сконструйований, включаючи наступні функціонально приєднані елементи (від 5' до 3'): S4S4 промотор (SEQ ID No. 19), лідерну послідовність Е1 гену (GE1) Oryza sativa (Michiels et al., 1992), ДНК cry1D1, що включає послідовність модифікованого транзитного пептиду хлоропласту SEQ ID No. 16, і послідовність, що містить 3' нетрансльовану ділянку гена НАДФ-малатдегидрогенази від Flaveria bidentis (3' Ме1, Marshall et al., 1996). Друга форма cry1D химерного гена також була створена, з використанням ДНК cry1D2, що не містить послідовності, яка кодує оптимізований транзитний пептид, такимчином, що в рослинних клітинах має місце цитоплазматична акумуляція білка Cry1D. Це являє собою Cry1D2 химерний ген. Конструюється вектор трансформації ДНК (рТ1С4В1), що містить між межами т-ДНК химерний ген сrу1С4 і химерний ген сrу1В1 у орієнтації від "голови до хвоста" (3’MeI-cry1C4GE1 лідерна послідовність -S7S7 - S4S4-GE1 лідерна послідовність - сrу1 В1-3'Меl), а також вектор перенесення (рТ1С2В2), який включає між межами т-ДНК химерний ген сrу1С2 і химерний ген сrу1В2 у орієнтації "від голови до хвоста" (3'Mel-cry1C2-GE1 лідерна послідовність -S7S7 - S4S4-GE1 лідерна послідовність- сrу1В2-3'Ме1). Таким чином, із обома векторами Т-ДНК, сrу1С та сrу1В гени винаходу будуть ко-трансформовані у рослинну клітину і будуть розташовані в одному локусі після успішної трансформації. Конструюються подібні т-ДНК вектори, які містять вищезгадані химерні гени сrу1С, але які включають у якості другого химерного гена cry1D1 або cry1D2 химерні гени замість вищезгаданий сrу1В химерний ген. Також конструюється вектор потрійної генної трансформації cry гена, що містить сrу1С, сrу1D та сrу1В гени (всі або містять або не містять модифікований транзитний пептид). Вектори трансформації, що містять гени винаходу, були виділені з pGSC1700 (Cornelissen and Vandewiele, 1989). Основа вектора включає наступні генетичні елементи: a) "ядро" плазміди, що включає сайт ініціації реплікації від плазміди pBR322 (Bolivar et al., 1977) для реплікації у Escherichia coli та рестрикційний фрагмент, що містить сайт ініціації реплікації від плазміни Pseudomonas pVS1 (ltoh et al., 1984) для реплікації у Agrobacterium tumefaciens. b) селективний маркерний ген, що спричиняє резистентність до стрептоміцину та спектиноміцину [aadA) для розмноження та відбору плазміди в Escherichia coli та Agrobacterium tumefaciens. c) ділянка ДНК, що складається з фрагменту послідовності, що кодує неоміцин фосфотрансферазу nptl генк від транспозону Tn903 (Oka et al., 1981). Т-ДНК ділянка кожного вектора трансформації також містить химерний bar ген, що слугує як селективний маркерний ген. Експресія bar гену спричинює продукцію ферменту, фосфінотрицин-ацетилтрансферази, що метаболізує гербіцид глюфозинатамонію, що призводить до втрати його гербіцидної активності в клітині. Химерний bar ген містить 35S3 промоторну ділянку від транскрипту вірусу мозаїки цвітної капусти 35S (Odell et аl.,1985), bar кодуючи послідовність гену фосфінотрицин ацетилтрансферази Streptomyces hygroscopicus, як описано Thompson et al. (1987), і послідовність 3' термінації транскрипту і поліаденілювання від 3' нетрансльованої ділянки гену нопалінсинтази від Т-ДНК рТіТ37 (Depickeretal., 1982). 17 UA 98108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Вектори трансформації, подібні до тих, що тут описані, також були сконструйовані, де сrу1С1 або сrу1C3 химерні гени також використовуються (подібні до вищезгаданих сrу1С генів, але мають ST-LS1 інтрон у позиції 489). Також ці вектори містять сrу1В1 або сrу1В2 химерні гени, або cry1D1 або cry1D2 химерні гени, описані вище. Всі плазміди були перевірені на їх відповідність за допомогою рестрикційного аналізу та секвенування ДНК, перед тим, як використовувати їх для трансформації рослин. 2. Трансформація та регенерація рослин. Вищезгадані вектори трансформації рТ1С4В1 і рТ1С2В2, що містять сrу1С та сrу1В гени винаходу, переносяться у штами Agrobacterium tumefaciens для трансформації в рослинах за допомогою загальноприйнятих методів. Рослини цвітної капусти та качанної капусти трансформуються за допомогою Agrobacterium. Насіння Brassica oleracea var. capitata (капуста) або Brassica oleracea var. botrytis (цвітна капуста) стерилізують шляхом занурення у 70% етанол, після чого його занурюють у 6% хлорне вапно. Після цього насіння промивають стерильною водою і переносять у маленькі чашки Петрі, що містять середовище MC (Murashige-Scoog). Чашки Петрі вміщують у скляні контейнери та інкубують 5-8 днів при температурі 24°С. Вирізають гіпокотильні експлантати розміром 0.5-0.7 см та вміщують у рідке середовище з відповідними гормонами. Agrobacterium tumefaciens, що несе гени, які становлять інтерес, додають до середовища, щоб досягти кінцевої концентрації 7 1x10 бактерій/мл. Після періоду сумісного культивування експлантати промивають у рідкому середовищі з відповідними антибіотиками і гормонами та переносять на фільтрувальний папір. Експлантати культивували тиждень на середовищі для індукції калусоутворення, що містить 5 мг/л нітрату срібла та 250 мг/л тріациліну і карбеніциліну, та 10 мг/л фосфінотрицину для селекції явища присутності трансформації. Кожні два тижні експлантати переносять на свіже середовище. Кожного тижня експлантати перевіряють на калусоутворення. Калус видаляють з експлантатів та переносять на середовище, яке стимулює утворення пагонів. Пагони переносять у пластикові контейнери з середовищем для укорінення. Ростки тримають на цьому середовищі до тих пір, поки вони не нормалізуються або не вкоріняться. Коли вони сягають 3-10 см завдовжки і мають добре розвинену кореневу систему, їх переносять у теплицю. Рослини олійної редьки також трансформують за допомогою сrу1С та сrу1В генів, використовуючи Agrobacterium tumefaciens. Експлантати гіпокотиля Brassica napus використовують у звичайній трансформації та регенераційних методах, напр., методі, описаному De Block et al. (1989). 3. Аналіз трансформантів. Після того, як були регенеровані трансформовані рослини, було проведено ПЛР і Саузернблот аналіз для того, щоб переконатись, що відбулася інтеграція трансгенів. Імунологічні дослідження, такі як сrу1С- та сrу1В-специфічні ELISA-тести або Вестернблоттинг, були проведені для селекції цих трансформованих рослин, які виявляють оптимальні рівні експресії сrу1С і сrу1В протеїнів. РТ-ПЛР досліди на зразках PHK, взятих від рослин цвітної капусти, що були трансформовані за допомогою сrу1С генів SEQ ID No. 1 або 3, і містять рослинний інтрон в іншій позиції, підтвердили, що сплайсинг відбувається правильно і що в цих рослинах продукується функціональний Cry 1С білок. Це також було підтверджено Нозерн-блот аналізом цих рослин. Також, дослідження на комахах з використанням личинок Plutella xylostella за умов проведення стандартних біотестів на комахах з використанням відповідного контролю із обраною трансформованою капустою, цвітною капустою та рослинами олійної редьки, що містять сrу1С та сrу1В гени, підтверджують високу інсектицидну активність та високу дозу цих експресованих білків у трансформованих рослинах, обраних для оптимальної експресії. Також, комахи Plutella xylostella, що були відібрані для дослідження їх резистентності до Cry 1С або сrу1В білку, ефективно знищувались рослинами винаходу. Також отримували дочірні рослини та насіння від трансформованих, обраних рослин винаходу; було показано, що гени винаходу розподіляються у нащадків за законами Менделя. Селекція трансгенних рослин в умовах теплиці та в польових умовах на різних ділянках призведе до ідентифікації рослинних ліній, що мають оптимальну стабільність та експресію сrу1 химерних генів, комбінованих з оптимальною агрономічною продуктивністю. Гібридизація обраних найкращих трансгенних рослин із декількома різними комерційними лініями, і повторне їх зворотнє схрещування, призводить до присутності (зв'язаних) сrу1В та сrу1С генів винаходу у різному генетичному середовищі капусти, цвітної капусти або олійної редьки, оптимально адаптованих до різних областей або кліматичних умов. Перелік посилань: 18 UA 98108 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 An et al. (1996) Plant J. 10, 107 Bernhard and Utz (1993) "Production of Bacillus thuringiensis insecticides for experimental and commercial uses", In Bacillus thuringiensis, An Environmental Biopesticide: Theory and Practice, pp.255-267, eds. Entwistle, P.F., Cory, J.S., Bailey, MJ. and Higgs, S., John Wiley and Sons, New York (1993). Bih et al. (1999) J. Biol. Chem. 274, 22884-22894. Boevink et al. (1995) Virology, 207, 354-361. Bolivar et al. (1977) Gene, 2: 95-113. Bradford et al. (1976) Anal. Biochem. 72, 248-254. Brown (1986) Nucleic Acids Res. 1986 14, 9549-9559. Brown and Simpson (1998) Ann. Rev. Plant Physiol. Plant MoI. Biol. 49, 77-95. Brown et al. (1996) Plant MoI Biol. 32, 531-535. Christensen et al. (1992) Plant MoI. Biol. 18, 675-689. Christou et al. (1990). Trends Biotechnology 8, 145. Cordera et al. (1994) The Plant Journal 6, 141. Cornejo et al. (1993) Plant MoI. Biol. 23, 567-581. Cornelissen &Vandewiele (1989) Nucleic Acids Research, 17: 19-25. Cornelissen et al. (1986) EMBO J. 5, 37-40. Crickmore et al. (1998) Microbiol. MoI. Biol Rev. 62(3), 807-13. Datta et al. (1990) BiofTechnology 8, 736-740. De Block etal. (1989) Plant Physiol., 91:694. De Pater et al., 1992, Plant J. 2, 834-844. Depicker et al. (1982) Journal of Molecular and Applied Genetics, 1: 561-573. Dulmage (1981), "Production of Bacteria for Biological Control of Insects" in Biological Control in Crop Production, Ed. Paparizas, D.C, Osmun Publishers, Totowa, N.J., USA, pp. 129-141 (1981). Eckes et al. (1986) Molecular and General Genetics, 205: 14-22. Estruch et al., (1996), Proc Natl Acad Sci USA 93, 5389-94. Ffrench-Constant and Bowen (2000) Cell MoI Life Sci 57, 828-33. Franck et al. (1980) Cell 21, 285-294. Fromm et al. (1990) Bio/Technology 8, 833-839. Gardner et al. (1981) Nucleic Acids Research 9, 2871-2887. Gielen et al. (1984) EMBO J 3, 835-845. Gordon-Kamm et al. (1990) The Plant Cell 2, 603-618. Hesse et al. (1989), EMBO J. 8 2453-2461. Hinchee et al. (1988) Bio/Technology 6, 915. Ho et al. (1989). Gene 77, 51-59. Höfte et al. (1988) Appl. and Environm. Microbiol. 54, 2010-2017. Höfte and Whiteley (1989) Microbiological Review 53, 242-255. Hull and Howell (1987) Virology 86, 482-493. ltoh etal. (1984) Plasmid, 11: 206-220. Jansens et al. (1997) Crop Science 37, 1616-1624. Keil et al. (1986), Nucl. Acids Res. 14, 5641-5650. Klösgen et al. (1989), MoI. Gen. Genet. 217, 155-161. Klösgen and Weil (1991), MoI. Gen. Genet. 225, 297-304. Kota et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 1840-1845. Last et al. (1990) Theor. Appl. Genet. 81, 581-588. Lebrun et al. (1996) US Patent 5,510,471. Lin et al. (2003) Bot. Bull. Acad. Sin. 44: 199-210. Mahillon et al, FEMS Microbiol. Letters 60, 205-210 (1989). Marshall et al. (1996) Plant Physiology, 111: 1251-1261. Michiels et al. (1992) published PCT application WO92/13956. Morris et al. (1999), Biochem. Biophys. Res. Commun. 255, 328-333. Needleman and Wunsch (1970) J. MoI. Biol., 48: 443-53. Neuhaus & Rogers (1998), Plant MoI. Biol. 38, 127-144. Odell et al. (1985) Nature, 313: 810-812. Oelmuller et al., MoI. Gen. Genet. 237, 261-272 (1993). Oka et al. (1981) Journal of Molecular Biology, 147: 217-226. Park et al. (1997), J. Biol. Chem. 272, 6876-6881. Rice et al. (2000) Trends in Genetics, 16: 276-277. Schunmann et al. (2003) Functional Plant Biology 30, 453 - 460. Shcherban et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci USA 92,9245-9249. Shimamoto et al. (1989) Nature 338, 274-276. Stanssens et al. (1989), Nucleic Acids Research 12, 4441-4454. 19 UA 98108 C2 5 10 15 Sutliff etal. (1991) Plant Molec. Biol. 16, 579-591. Tavladoraki et al. (1998), FEBS Lett. 426, 62-66. Terashima et al. (1999), Appl. Microbiol. Biotechnol. 52, 516-523. Thompson et al. (1987) The EMBO Journal, 6: 2519-2523. Van Den Broeck et al., 1985, Nature 313, 358. Van Rie et al. (1990) Science 247, 72. Velten et al. (1984) J., EMBO J 3, 2723-2730. Velten and Schell (1985) Nucleic Acids Research 13, 6981-6998. Verdaguer et al. (1998) Plant MoI. Biol. 37, 1055-1067. Waterfield et al. (2001) Trends Microbiol 9, 185-91. White et al. (1989) Trends in Genet. 5, 185-189. Wong et al. (1992) Plant Molec. Biol.20, 81-93. Zambryski (1988) Annual Review of Genetics, 22: 1-30. Zhang et al. (1991) The Plant Cell 3, 1155-1165. Zhao et al. (2003) Nature Biotechnology, 21: 1493 - 1497. Всі процитовані джерела включені в цьому описі шляхом посилання. Цитування будь-якого з цих посилань не тлумачиться ні як визнання точності кожного ствердження, що міститься у цьому посиланні, ні як визнання того, що таке посилання є прототипом цієї заявки або частиною загальновідомої інформації з рівня техніки на будь-якій території. 20 20 UA 98108 C2 21 UA 98108 C2 22 UA 98108 C2 23 UA 98108 C2 24 UA 98108 C2 25 UA 98108 C2 26 UA 98108 C2 27 UA 98108 C2 28