Трансгенна рослина сої, стійка до інгібуючих ahas гербіцидів
Номер патенту: 107923
Опубліковано: 10.03.2015
Автори: Араган Франсіску Жозе Ліма, Філью Елібіу Леопольду Реш, Ульбріш Адольфу, Луцці Брюс М., Лоузано Луїс, Йотсумото Тадасі, Аріас Карлос Альберту Аррабал, Тань Сиюань, Малефіт Тім, Лінеманн Уте, Карлсон Дейл
Формула / Реферат
1. Спосіб боротьби з бур'янистими рослинами на посівній площі, який включає:
застосування ефективної кількості гербіцидної композиції, яка містить інгібуючий AHAS імідазоліноновий гербіцид, на посівній площі з рослиною сої, яка містить молекулу нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеотидну послідовність, представлену положеннями 1312-6069 SEQ ID NO:1, де ефективна кількість буде інгібувати ріст бур'янистих рослин і рослин сої дикого типу на посівній площі.
2. Спосіб за п. 1, де молекула нуклеїнової кислоти містить молекулу нуклеїнової кислоти, представлену положеннями 1302-6079 SEQ ID NO:1.
3. Спосіб за п. 1, де молекула нуклеїнової кислоти містить нуклеотидну послідовність SEQ ID NO:1.
4. Спосіб за п. 1, де гербіцидна композиція додатково містить один або декілька з інших імідазолінонових гербіцидів, інших інгібуючих AHAS гербіцидів, інгібуючих EPSPS гербіцидів, інгібуючих GS гербіцидів, інгібуючих РРО гербіцидів, гербіцидів з ауксиновою активністю і їх комбінації.
5. Спосіб за п. 1, де інгібуючий AHAS імідазоліноновий гербіцид вибраний з імазапіру, імазапіку або їх комбінації.
6. Спосіб за п. 1, який додатково включає застосування на посівній площі ефективної кількості одного або декількох інших імідазолінонових гербіцидів, інших інгібуючих AHAS гербіцидів, інгібуючих EPSPS гербіцидів, інгібуючих GS гербіцидів, інгібуючих РРО гербіцидів, гербіцидів з ауксиновою активністю і їх комбінації.
7. Спосіб за будь-яким з пп. 4 або 6, де інгібуючі EPSPS гербіциди містять гліфосат, і інгібуючий РРО гербіцид містить сафлуфенацил.
8. Спосіб за п. 1, де бур'янисті рослини є стійкими до гліфосату.
9. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що спосіб додатково включає застосування стробілурину на посівній площі.
10. Спосіб за п. 9, в якому стробілурин містить піраклостробін.
11. Спосіб за п. 1, в якому гербіцидна композиція додатково містить
імазапір;
імазапік;
будь-яке з наступного:
комбінацію імазапіру і імазапіку;
комбінацію імазапіру, імазапіку і бентазону;
комбінацію імазапіру, імазапіку і піраклостробіну;
комбінацію імазапіру, імазапіку і сафлуфенацилу;
комбінацію імазапіру, імазапіку, сафлуфенацилу і гліфосату;
комбінацію імазапіру і бентазону;
комбінацію імазапіру і піраклостробіну;
комбінацію імазапіру і сафлуфенацилу;
комбінацію імазапіру, сафлуфенацилу і гліфосату;
комбінацію імазапіру і гліфосату;
комбінацію імазапіку і гліфосату; і
комбінацію імазапіку, сафлуфенацилу і гліфосату.
12. Спосіб боротьби зі стійкими до гліфосату бур'янистими рослинами на посівній площі, який включає:
застосування ефективної кількості гербіцидної композиції, яка містить інгібуючий AHAS імідазоліноновий гербіцид, на посівній площі з рослиною сої, яка містить молекулу нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеотидну послідовність, представлену положеннями 1312-6069 SEQ ID NO:1.
13. Спосіб за п. 12, де рослина сої містить молекулу нуклеїнової кислоти з нуклеотидною послідовністю SEQ ID NO:1.
14. Спосіб за п. 12, де молекула нуклеїнової кислоти містить нуклеотидну послідовність, представлену положеннями 1302-6079 SEQ ID NO:l.
15. Спосіб за п. 12, де інгібуючий AHAS імідазоліноновий гербіцид вибраний з імазапіру, імазапіку або їх комбінації.
16. Спосіб за п. 12, який відрізняється тим, що спосіб додатково включає застосування стробілурину на посівній площі.
17. Виділена молекула нуклеїнової кислоти, яка кодує модифіковану форму білка AHASL, який містить заміну серина на аспарагін в положенні 653 (S653N), і яка містить нуклеотидну послідовність, представлену в положеннях 1312-6069 SEQ ID NО:1.
18. Виділена молекула нуклеїнової кислоти за п. 17, де молекула нуклеїнової кислоти являє собою рекомбінантну нуклеїновокислотну конструкцію.
19. Трансгенна рослина сої, яка містить виділену молекулу нуклеїнової кислоти за п. 17.
20. Трансгенна рослина сої, яка містить гетерологічну молекулу нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеотидну послідовність, представлену нуклеотидами 1302-6079 SEQ ID NО:1.
21. Трансгенна рослина сої за п. 20, де рослина сої є стійкою до інгібуючого AHAS гербіциду.
22. Виділена пара нуклеїновокислотних праймерів для застосування в ампліфікації цільової молекули нуклеїнової кислоти, яка містить:
першу і другу виділені молекули нуклеїнової кислоти, де перша виділена молекула нуклеїнової кислоти містить нуклеотидну послідовність, вибрану з SEQ ID NО:37, 39, 41, 43 і 67, і друга виділена молекула нуклеїнової кислоти містить нуклеотидну послідовність, вибрану з SEQ ID NО:38, 40, 42, 44 і 68.
23. Виділена пара нуклеїновокислотних праймерів за п. 22, де перша виділена молекула нуклеїнової кислоти містить послідовність SEQ ID NО:41, а друга виділена молекула нуклеїнової кислоти містить послідовність SEQ ID NО:42.
24. Спосіб виявлення наявності молекули нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеотидну послідовність, представлену положеннями 1312-6069 SEQ ID NО:1, в біологічному зразку, який включає:
(a) одержання суміші, яка включає біологічний зразок, що містить ДНК сої, і перший і другий нуклеїновокислотні праймери, де перший нуклеїновокислотний праймер містить нуклеотидну послідовність, вибрану з SEQ ID NO:37, 39, 41, 43 і 67, і другий нуклеїновокислотний праймер містить нуклеотидну послідовність, вибрану з SEQ ID NO:38, 40, 42, 44 і 68;
(b) проведення реакції в суміші в умовах, які дозволяють першому і другому нуклеїновокислотним праймерам забезпечити ампліфікацію молекули нуклеїнової кислоти; і (c) виявлення наявності або відсутності ампліфікованої молекули нуклеїнової кислоти, де наявність ампліфікованої молекули нуклеїнової кислоти вказує на те, що біологічний зразок містить молекулу нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеотидну послідовність, представлену положеннями 1312-6069 SEQ ID NО:1.
25. Спосіб виявлення наявності молекули нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеотидну послідовність, представлену положеннями 1312-6069 SEQ ID NО:1, в біологічному зразку, який включає:
(a) одержання суміші, яка містить біологічний зразок, що містить ДНК сої, і молекулу нуклеїновокислотного зонда, яка здатна гібридизуватися з молекулою нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеїнову послідовність, представлену положеннями 1312-6069 SEQ ID NО:1;
(b) проведення реакції в суміші в умовах, які дозволяють молекулі нуклеїновокислотного зонда гібридизуватися з молекулою нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеотидну послідовність, представлену положеннями 1312-6069 SEQ ID NО:1; і
(c) виявлення гібридизації зонда з ДНК, де наявність гібридизації молекули нуклеїновокислотного зонда з ДНК сої вказує на наявність в біологічному зразку молекули нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеотидну послідовність, представлену положеннями 1312-6069 SEQ ID NO:l.
26. Спосіб за будь-яким з пп. 24 і 25, де вказаний біологічний зразок містить насіння сої.
27. Спосіб за будь-яким з пп. 24 і 25, де вказаний біологічний зразок містить частину рослини сої.
28. Спосіб підвищення врожайності рослини сої на посівній площі, який включає:
застосування ефективної кількості гербіцидної композиції, яка містить інгібуючий AHAS імідазоліноновий гербіцид, на одній або декількох рослинах сої, які містять молекулу нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеотидну послідовність, представлену положеннями 1312-6069 SEQ ID NО:1, і на посівній площі, де інгібуючий AHAS гербіцид зменшує ріст бур'янистих рослин на посівній площі; і
збирання насіння з однієї або декількох рослин сої.
29. Спосіб розведення рослини сої, стійкої до інгібуючого AHAS гербіциду, який включає:
(a) схрещування рослини сої, що містить молекулу нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеотидну послідовність, представлену положеннями 1312-6069 SEQ ID NО:1, з другою рослиною сої;
(b) одержання насіння зі схрещування стадії (а);
(c) одержання з насіння зразка ДНК; і
(d) виявлення наявності молекули нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеотидну послідовність, представлену положеннями 1312-6069 SEQ ID NО:1, в зразку, де наявність молекули нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеотидну послідовність, представлену положеннями 1312-6069 SEQ ID NО:1, вказує на те, що насіння здатне вирости у рослину сої, стійку до інгібуючого AHAS гербіциду.
30. Насіння трансгенної рослини сої, яке містить молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує модифіковану форму білка AHASL, який містить заміну серину у положенні 653 (S653N) на аспарагін, і яка містить нуклеотидну послідовність, представлену положеннями 1312-6069 SEQ ID NO:l.
31. Насіння за п. 30, де молекула нуклеїнової кислоти містить нуклеотидну послідовність SEQ ID NО:1.
32. Насіння за п. 30, де вказане насіння належить рослині або потомку рослини лінії "BPS-CV127-9", типовий зразок насіння вказаної лінії депонований за номером доступу NCIMB № 41603.
33. Насіння за п. 30, де насіння оброблено гербіцидною композицією, яка містить один або декілька інгібуючих AHAS гербіцидів, або комбінацію інгібуючих AHAS гербіцидів.
34. Спосіб боротьби з бур'янистими рослинами на посівній площі, який включає посів насіння за п. 33 на посівній площі.
35. Трансгенна рослина сої, одержана за допомогою пророщування насіння за п. 30.
36. Частина трансгенної рослини, отримана шляхом пророщування насіння за п. 30.
Текст
Реферат: Запропоновано трансгенну рослину сої, стійку до інгібуючих AHAS гербіцидів. Рослина містить молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує модифіковану форму білка AHASL, який містить заміну серина на аспарагін в положенні 653 (S653N), і яка містить нуклеотидну послідовність, UA 107923 C2 (12) UA 107923 C2 представлену в положеннях 1312-6069 SEQ ID NО:1. Запропоновано також спосіб підвищення врожайності рослин сої та спосіб боротьби з бур'янистими рослинами на посівній площі, які включають застосування гербіцидної композиції, яка містить інгібуючий AHAS гербіцид на посівній площі з вказаною трансгенною рослиною сої. UA 107923 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Перехресні посилання на споріднені заявки За даною заявкою вимагається пріоритет по попередній заявці США № 61/143049, поданій 7 січня 2009 року, яка включена в даний опис як посилання в повному обсязі. Галузь винаходу Винахід стосується, в основному, молекулярної біології, композицій і способів для збільшення стійкості рослин до гербіцидів, інгібуючих синтазу ацетогідроксикислот, і композицій і способів для боротьби з бур’янистими рослинами. Передумови винаходу Соя (Glycine max) є важливою сільськогосподарською культурою, яка виростає на багатьох посівних площах світу. До сої вже застосовували біотехнологічні способи з метою поліпшення агротехнічних характеристик і якості продукту. Однією з таких агротехнічних характеристик, важливою при одержанні сої, є стійкість до гербіцидів, зокрема стійкість до гербіциду гліфосату. Оскільки зросло застосування стійкої до гліфосату сої, з'являлися бур'яни, які є стійкими до гліфосату. Таким чином, при боротьбі з бур’янистими рослинами існує необхідність в рослинах сої, які мають стійкість до гербіцидів, відмінних від гліфосату. Фенотипічну експресію трансгена (такого як ті, які забезпечують стійкість до гербіцидів) в рослині, такій як соя, зачіпають як за допомогою структури самого гена, так і за допомогою ділянки його інтеграції в геном рослини. Нарівні з цим присутність трансгена (в чужорідній ДНК) в різних ділянках геному буде різними способами впливати на фенотип рослини загалом. Агротехнічно або промислово успішне введення в рослину ознаки, що представляє комерційний інтерес, за допомогою генетичного впливу може являти собою тривалу процедуру, яка залежить від різних факторів. Існуючі способи трансформації і регенерації генетично трансформованих рослин є першими в серії стадій селекції, де стадії включають інтенсивну генетичну характеризацію, розведення і оцінку в польових умовах, що приводить в результаті до відбору елітного об'єкта. Можливість однозначно визначати і/або розпізнавати конкретні трансгенні події стає все більш важливою внаслідок збільшеного застосування генетичної модифікації для підвищення врожайності культури, для поліпшення інтрогресії трансгенів в комерційні сорти, для розділення продуктів з ГМО і без ГМО і ідентифікації запатентованого матеріалу. Для визначення конкретних трансгенних подій зберігається необхідність в розробці способів, які є як швидкими, так і простими, не потребують великої кількості лабораторного обладнання. Крім того, способи визначення конкретної події були б корисними для узгодження з нормативними актами, що необхідно для перевірки продукції до випуску на ринок збуту і маркування продуктів, одержаних з рекомбінантних сільськогосподарських культур або для застосування при контролі за станом навколишнього середовища, контролі ознак сільськогосподарських культур, що ростуть в полі, або контролі продуктів, одержаних із зібраного урожаю сільськогосподарських культур, а також для застосування з метою забезпечення відповідності партій згідно з регуляторними або договірними умовами. Суть винаходу У одному з варіантів здійснення даний винахід стосується способів боротьби з бур'янами на посівній площі, де способи включають застосування ефективної кількості неселективного гербіциду на посівній площі з рослиною сої, що містить молекулу нуклеїнової кислоти події 127. У іншому варіанті здійснення даний винахід стосується способів боротьби на посівних площах з бур'янами, стійкими до гліфосату, де способи включають застосування ефективної кількості інгібуючого AHAS гербіциду на посівних площах з рослиною сої, що містить молекулу нуклеїнової кислоти події 127. У іншому варіанті здійснення даний винахід стосується виділеної молекули нуклеїнової кислоти з послідовністю нуклеїнових кислот від положення 1312 до положення 6069 в SEQ ID NO:1. У іншому варіанті здійснення данийвинахід також стосується трансгенних рослин сої, що мають гетерологічну молекулу нуклеїнової кислоти з послідовністю нуклеотидів від положення 1302 до положення 6079 в SEQ ID NO:1. Даний винахід також стосується виділеної пари нуклеїновокислотних праймерів, що містять першу і другу виділені молекули нуклеїнової кислоти, які забезпечують ампліфікацію молекули нуклеїнової кислоти події 127. У іншому варіанті здійснення даний винахід стосується набору для ідентифікації молекули нуклеїнової кислоти події 127 в біологічному зразку, що містить перший і другий нуклеїновокислотні праймери, де перший і другий нуклеїновокислотні праймери забезпечують ампліфікацію молекули нуклеїнової кислоти події 127. Даний винахід також стосується способів ідентифікації рослини сої події 127, де способи 1 UA 107923 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 включають: (a) одержання суміші, що включає біологічний зразок, який містить ДНК сої, і перший і другий нуклеїновокислотні праймери, що забезпечують ампліфікацію молекули нуклеїнової кислоти, специфічну для події 127; (b) проведення реакції в суміші в умовах, які дозволяють першому і другому нуклеїновокислотним праймерам забезпечувати ампліфікацію молекули нуклеїнової кислоти, специфічної для події 127; і (с) визначення наявності ампліфікованого фрагмента молекули нуклеїнової кислоти, де наявність молекули нуклеїнової кислоти, специфічної для події 127 сої, показує, що рослина сої являє собою рослину сої події 127. У іншому додатковому варіанті здійснення винаходу, даний винахід стосується способів ідентифікації рослини сої з молекулою нуклеїнової кислоти події 127, де способи включають: (a) одержання суміші, що включає біологічний зразок, який містить ДНК сої, і молекулу нуклеїновокислотного зонда, який здатний гібридизуватися з молекулою нуклеїнової кислоти, специфічною для події 127; (b) проведення реакції в суміші в умовах, які дозволяють молекулі нуклеїновокислотного зонда гібридизуватися з молекулою нуклеїнової кислоти, специфічною для події 127; і (с) детекцію гібридизації зонда з ДНК, де наявність гібридизації молекули нуклеїновокислотного зонда з ДНК сої показує наявність молекули нуклеїнової кислоти події 127. Даний винахід додатково стосується способів підвищення урожаю рослин сої, що містять молекулу нуклеїнової кислоти події 127, де спосіб включає: застосування ефективної кількості інгібуючого AHAS гербіциду на одній або декількох рослинах сої, що містять молекулу нуклеїнової кислоти події 127, і на навколишніх площах, де інгібуючий AHAS гербіцид зменшує ріст бур'янів на навколишній площі; і збирання насіння від однієї або декількох рослин сої. У іншому варіанті здійснення даний винахід стосується способів розведення рослин сої, стійких до інгібуючого AHAS гербіциду, де спосіб включає: (a) схрещування рослини сої, що містить молекулу нуклеїнової кислоти події 127, з другою рослиною сої; (b) одержання насіння з рослини, одержаної в результаті схрещування на стадії (a); (с) одержання зразка ДНК з насіння; і (d) детекцію наявності молекули нуклеїнової кислоти події 127 в зразку, де наявність молекули нуклеїнової кислоти події 127 показує, що насіння здатне виробляти рослину сої, стійку до інгібуючого AHAS гербіциду. Даний винахід також стосується насіння рослини сої, що містить молекулу нуклеїнової кислоти події 127. У іншому варіанті здійснення даний винахід стосується способів детекції наявності молекули нуклеїнової кислоти події 127 в біологічному зразку, де способи включають: (a) одержання суміші, що включає біологічний зразок, який містить ДНК, і перший і другий нуклеїновокислотні праймери, що забезпечують ампліфікацію молекули нуклеїнової кислоти, специфічної для події 127; (b) проведення реакції в суміші в умовах, які дозволяють першому і другому нуклеїновокислотним праймерам забезпечувати ампліфікацію молекули нуклеїнової кислоти, що містить молекулу нуклеїнової кислоти, специфічну для події 127; і (с) детекцію наявності ампліфікованої молекули нуклеїнової кислоти, де присутність молекули нуклеїнової кислоти, специфічної для події 127, показує, що зразок містить молекулу нуклеїнової кислоти події 127. У іншому варіанті здійснення даний винахід стосується способів детекції молекули нуклеїнової кислоти події 127 в біологічному зразку, де способи включають: (a) одержання суміші, що включає біологічний зразок, який містить ДНК, і нуклеїновокислотний зонд, здатний гібридизуватися з молекулою нуклеїнової кислоти, специфічною для події 127; (b) проведення реакції в суміші в умовах, які дозволяють зонду гібридизуватися з молекулою нуклеїнової кислоти, специфічною для події 127; і (с) детекцію наявності гібридизованої молекули нуклеїнової кислоти, де присутність молекули нуклеїнової кислоти, специфічної для події 127, показує, що зразок містить молекулу нуклеїнової кислоти події 127. Даний винахід також стосується способів детекції наявності вбудованої молекули нуклеїнової кислоти події 127 в біологічному зразку, де способи включають: (a) одержання суміші, що включає біологічний зразок, який містить ДНК, і перший і другий праймери, сприяючі ампліфікації вбудованої молекули нуклеїнової кислоти події 127; (b) проведення реакції в суміші в умовах, які дозволяють першому і другому нуклеїновокислотним праймерам забезпечувати ампліфікацію молекули нуклеїнової кислоти, що містить вбудовану молекулу нуклеїнової кислоти події 127; і (с) детекцію наявності ампліфікованої молекули нуклеїнової кислоти, де присутність вбудованої молекули нуклеїнової кислоти події 127 показує, що зразок містить вбудовану ДНК події 127. У ще одному варіанті здійснення даний винахід стосується способів детекції наявності вбудованої молекули нуклеїнової кислоти події 127 в біологічному зразку, де способи включають: (a) одержання суміші, що включає біологічний зразок, який містить ДНК, і перший 2 UA 107923 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 праймер, здатний до відпалу з ділянкою вбудованої молекули нуклеїнової кислоти події 127, і другого праймер, здатний до відпалу з фланкуючою молекулою нуклеїнової кислоти в геномі клітини-хазяїна; (b) проведення реакції в суміші в умовах, які дозволяють першому і другому нуклеїновокислотним праймерам виробляти ампліфіковану молекулу нуклеїнової кислоти, що містить фрагмент вбудованої молекули нуклеїнової кислоти події 127; і (с) детекцію наявності молекули нуклеїнової кислоти, де присутність фрагмента вбудованої молекули нуклеїнової кислоти події 127 показує, що зразок містить вбудовану ДНК події 127. У іншому варіанті здійснення даний винахід стосується способів вирощування рослин сої, де способи включають: (a) одержання насіння сої, що містить молекулу нуклеїнової кислоти події 127; (b) посів насіння для одержання сої в середовищі для вирощування в умовах, які забезпечують проростання насіння, для вирощування рослини сої, що містить молекулу нуклеїнової кислоти події 127; і (с) взаємодію середовища для вирощування, насіння або рослин з гербіцидною композицією, яка містить щонайменше один компонент, вибраний з групи, що складається з гербіцидів на основі імідазолінону, сульфонілкарбаміду, їх комбінації одного з одним, і їх комбінації щонайменше з одним іншим активним інгредієнтом. У іншому варіанті здійснення даний винахід стосується способів детекції поліпептиду події 127 в зразку, де способи включають: одержання біологічного зразка з рослини сої; і проведення щонайменше одного імунологічного аналізу зразка, де в результаті проведення аналізу можлива детекція поліпептиду події 127. Даний винахід також стосується пристроїв для застосування в детекції біологічних молекул, де пристрої включають: тверду підкладку з поверхнею; і щонайменше одну діагностичну молекулу для події 127, приєднану до поверхні твердої підкладки. Короткий опис креслень На Фіг. 1A представлене схематичне зображення плазміди pAC321. На Фіг. 1B представлене схематичне зображення фрагмента PvuII pAC321, який містить AHASL 5’-UTR, кодуючу послідовність csr1-2 і AHASL 3’-UTR, який використаний для трансформації. Показані ділянки рестрикції ферментів (NcoI, XbaI, SpeI), використовувані для аналізу блотинг по Саузерну для визначення числа копій, перевірки відсутності векторної конструкції і стабільності в поколіннях. На Фіг. 2 надане схематичне зображення історії розведення на прикладі однієї рослини сої події 127. На Фіг. 3 надане схематичне зображення вирівнювання фрагмента трансформації PvuII pAC321 зі вставкою події 127 сої. На Фіг. 4A-4C представлені результати блот-гібридизації по Саузерну для визначення числа копій вставки на одному прикладі для рослини сої події 127, як описано в прикладі 3. На Фіг. 4D представлене схематичне зображення взаємного розташування зондів, використовуваних в експериментах по гібридизації. На Фіг. 5 надані результати блот-гібридизації по Саузерну, що показують відсутність послідовності векторної конструкції в одному прикладі рослини сої події 127, як описано в прикладі 3. На Фіг. 5A представлені результати з використанням зонда VP1, а на Фіг. 5B представлені результати з використанням зонда VP2. На Фіг. 5C представлене схематичне зображення взаємного розташування ділянок гібридизації на послідовності події 127. На Фіг. 6 надані результати блот-гібридизації по Саузерну аналізу стабільності успадкування в поколіннях послідовності події 127. На Фіг. 6A представлені результати з використанням зонда 5’-UTR. На Фіг. 6B представлені результати з використанням зонда AHAS. На Фіг. 6C представлені результати з використанням зонда 3’-UTR. На Фіг. 6D представлене схематичне зображення ділянок гібридизації відповідних зондів на послідовності події 127. На Фіг. 7 надана схема вставки і фланкуючої послідовності на одному прикладі рослини сої події 127. Також показано шість ампліконів, використовуваних для секвенування, як описано в прикладі 3. На Фіг. 8 надані повнорозмірні послідовності нуклеїновокислотної вставки події 127 і фланкуючої області в геномі сої (SEQ ID NO:1). Положення 1-1311 відповідають 5’-фланкуючій ДНК, положення 1312-6069 відповідають кодуючій модифікований білок AHASL вставці ДНК, а положення 6070-10656 відповідають 3’-фланкуючій ДНК. На Фіг. 9 представлений електрофорез в гелі з результатами транскрипції за допомогою аналізу ЗТ-ПЛР γ субодиниці AtSec61 в одному прикладі рослини сої події 127, як описано в прикладі 3. На Фіг. 10 представлений електрофорез в гелі з результатами транскрипції за допомогою аналізу ЗТ-ПЛР відкритої рамки зчитування (ORF) розміром 501 п.н., утвореної за допомогою вбудовування дуплікації кодуючої послідовності csr1-2 розміром 376 п.н. в ділянку з'єднання з 3’-фланкуючою послідовністю, на одному прикладі рослини сої події 127, як описано в прикладі 3 UA 107923 C2 3. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 На Фіг. 11 представлений електрофорез в гелі з результатами прикладів способів ПЛРдетекції, специфічної до події 127, як описано в прикладі 3. На Фіг. 12 надана ДНК, використовувана для одержання події 127, тобто фрагмент PvuII розміром 6156 п.н. з конструкта pAC321 (SEQ ID NO:4). Докладний опис Даний винахід стосується рослин сої, які демонструють стійкість до інгібуючих AHAS гербіцидів, таких як гербіциди на основі імідазолінону, сульфонілкарбаміду, триазолопіримідинсульфоаніліду і/або піримідилоксибензоату. Рослини сої за даним винаходом містять вбудовану молекулу нуклеїнової кислоти, яка розташовується в охарактеризованій ділянці в геномі сої. Також представлені способи і композиції для застосування відносно описаних рослин сої. До більш докладного опису винаходу попередньо буде надане визначення термінів. I. Визначення Як застосовують в цьому документі, терміни "соя" і "рослини сої" означають рослини Glycine max і включають всі сорти рослин, які можна схрещувати з соєю. Термін "рослина сої" включає частини рослини. Як застосовують в цьому документі, термін "частина рослини" включає рослинні клітини, органи рослини, протопласти рослини, культуру тканини рослинної клітини, з якої можна регенерувати рослини, калюси рослин, рослинну масу і рослинні клітини, які є інтактними в рослинах або частинах рослин, таких як зародки, пилок, насінні зачатки, насіння, сім’янки, листя, квітки, гілки, плід, стебла, коріння, кінці коріння, пиляки, сім’ядолі, гіпокотилі і т. п. Зерно призначене для позначення зрілої насінини, одержуваної овочівниками для цілей, відмінних від мети розведення або відтворення сорту. Потомство, похідні, варіанти і мутанти регенерованих рослин також включені в межі обсягу винаходу, за умови, що ці частини включають молекулу нуклеїнової кислоти події 127. "Молекула нуклеїнової кислоти події 127" стосується молекули нуклеїнової кислоти, яка містить послідовність нуклеїнової кислоти в положеннях від 1312 до 6069 в SEQ ID NO:1; її варіант, одержаний загальноприйнятою селекцією рослин, який призначений для забезпечення експресії модифікованої форми ферменту AHAS, що має білок AHASL, який містить замість природного серину (S653N) аспарагін у відповідному положенні 653, де модифікована форма ферменту AHAS демонструє стійкість до інгібітору AHAS, який в нормі інгібує ферментативну активність ферменту AHAS дикого типу; або доповнення будь-якого з них. Молекула нуклеїнової кислоти події 127 може містити додаткові послідовності, які фланкують положення 1312-6069 SEQ ID NO:1 (або, для варіантів, додаткові послідовності, які фланкують 5’- і 3’-положення). "Ділянка події 127" стосується молекули нуклеїнової кислоти, яка включає щонайменше фрагмент молекули нуклеїнової кислоти події 127 і яка є показником рослини події 127. Ділянка події 127 може включати одну або декілька з 5’- і/або 3’-ділянок з'єднання, вставку ДНК або ділянку з'єднання дуплікації csr1-2 вставки ДНК з іншою послідовністю вставки ДНК. Також, 5’і/або 3’-фланкуючі послідовності ДНК можуть бути додатково включені в цей документ. Як застосовують в цьому документі, термін "молекула нуклеїнової кислоти, специфічна для події 127", стосується послідовності молекул нуклеїнової кислоти, яка відмітно ідентифікує або яка допускає відмітну ідентифікацію молекули нуклеїнової кислоти події 127 в зразку. Молекула нуклеїнової кислоти, специфічна для події 127, може включати ділянки з'єднання і унікальні мутації або дуплікації у вставці ДНК, одержаній в результаті процесу трансформації. Наприклад, застосування в реакції ПЛР праймерів для ПЛР з послідовністю нуклеїнових кислот, представлених в SEQ ID NO:37 і 38, приводить до ампліфікації амплікона, який є показником молекули нуклеїнової кислоти події 127. Термін "молекула події 127" стосується молекули нуклеїнової кислоти, молекул поліпептиду і інших біологічних молекул, які походять з молекули нуклеїнової кислоти події 127, одержані з молекули нуклеїнової кислоти події 127 або кодуються молекулою нуклеїнової кислоти події 127. Термін "діагностична молекула події 127" стосується молекул, які можна використовувати для детекції, як прямої так і непрямої, молекули нуклеїнової кислоти події 127. Діагностична молекула події 127 включає молекули нуклеїнової кислоти, такі як праймери і зонди, антитіла і їх фрагменти із збереженою ділянкою зв’язування (наприклад, Fv, Fab, Fab', F(ab') і антитіла з делетованим доменом Н), поліпептиди і їх похідні, аналоги нуклеїнових кислот, аптамери і т. п., які можна використовувати в способах детекції молекули нуклеїнової кислоти події 127 або поліпептидів, експресованих з такої молекули нуклеїнової кислоти. Як застосовують в цьому документі, "вставка ДНК" стосується гетерологічної ДНК, яка вбудована в матеріал рослини за допомогою процесу трансформації і включає ДНК, яка 4 UA 107923 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 відрізняється від вихідної ДНК, використовуваної для такої трансформації, як пояснено в цьому документі. "Вставка нуклеїнової кислоти події 127" і "вставка ДНК події 127" стосуються молекули нуклеїнової кислоти з послідовністю нуклеїнових кислот в положеннях 1312-6069 SEQ ID NO:1 (яка відрізняється від ДНК, використовуваної для створення події 127, тобто фрагмента PvuII довжиною 6156 п.о. з конструкта pAC321, представленого на Фіг. 12 (SEQ ID NO:4)). "Подія 127" рослини, клітини, насіння, частини рослини або тканини рослини стосується будь-якої рослини, клітини, насіння, частини рослини або тканини рослини, які містять молекулу нуклеїнової кислоти події 127 і переважно містять щонайменше одну нуклеїнову кислоту, специфічну для події 127. Подія 127 рослин включає Подію 127-9 рослин сої, що містить молекулу нуклеїнової кислоти з послідовністю SEQ ID NO:1, як, наприклад, ту, яку позначають як BPS-CV127-9. Термін "фланкуюча ДНК" стосується геномної ДНК, природно існуючої в організмі, такому як рослина, яка розташовується безпосередньо проти ходу транскрипції або по ходу транскрипції і суміжно з вбудованою молекулою нуклеїнової кислоти. "Фланкуюча область" або "фланкуюча послідовність", як застосовують в цьому документі, стосується послідовності щонайменше з 10, 20, 50, 100, 200, 300, 400, 1000, 1500, 2000, 2500 або 5000 пар нуклеотидів або більше, яка розташовується або безпосередньо проти ходу транскрипції (5’) і суміжна з молекулою вихідної чужорідної ДНК-вставки або безпосередньо по ходу транскрипції (3’) і суміжна з молекулою вихідної чужорідної ДНК-вставки. Необмежувальні приклади фланкуючих областей події 127 представлені в SEQ ID NO:2 і 3, і варіанти і їх фрагменти, де SEQ ID NO:2 відповідає положенням 1-1311 в SEQ ID NO:1, а SEQ ID NO:3 відповідає положенням 6070-10656 в SEQ ID NO:1. Способи трансформації, які приводять до вбудовування чужорідної ДНК-вставки випадковим чином, приведуть в результаті до утворення індивідуальних трансформантів, що містять різні фланкуючі області, характерні і унікальні для кожного трансформанта. Якщо рекомбінантну ДНК вбудовують в рослину за допомогою загальноприйнятого схрещування, її фланкуючі області не будуть, як правило, відрізнятися від фланкуючих областей вихідного трансформанта. Індивідуальні трансформанти будуть також містити унікальні з'єднання між ділянкою гетерологічної ДНК-вставки і геномної ДНК або двома ділянками геномної ДНК, або двома ділянками гетерологічної ДНК. "Точка з'єднання" являє собою точку, де сполучаються два специфічних фрагменти ДНК, наприклад, де ДНК-вставка сполучається з фланкуючою ДНК. Точка з'єднання також присутня в трансформованому організмі, де два фрагменти ДНК сполучаються разом способом, що представляє модифікацію того способу, який виявлений в природному організмі. Як застосовують в цьому документі, "ДНК-з'єднання" або "ділянка з'єднання" стосується ДНК, яка містить точку з'єднання. Необмежувальні приклади точок з'єднання в ДНК сої події 127 включають послідовності, такі, як представлені, наприклад, в SEQ ID NO:5 і 6, де SEQ ID NO:5 являє собою положення 1311-1312 в SEQ ID NO:1 і SEQ ID NO:6 являє собою положення 60696070 в SEQ ID NO:1. Потрібно розуміти, що термін "трансгенний", як застосовують в цьому документі, включає будь-яку клітину, клітинну лінію, калюс, тканину, частину рослини або рослину, генотип яких змінений внаслідок присутності гетерологічної нуклеїнової кислоти, що включає початково змінені трансгенні події, а також ті, які одержали за допомогою статевого або безстатевого розмноження від початково регенерованої події. Як застосовують в цьому документі термін "трансгенний" не включає зміну геному (хромосомного або позахромосомного) за допомогою загальноприйнятих способів розведення рослин або за допомогою природних процесів, таких як перехресне запилення випадковим чином, нерекомбінантна вірусна інфекція, нерекомбінантна бактеріальна трансформація, нерекомбінантна транспозиція або спонтанна мутація. "Трансформація" стосується перенесення фрагмента нуклеїнової кислоти в геном організму хазяїна, що приводить до стабільного генетичного успадкування. Організми хазяїнів, що містять трансформовані фрагменти нуклеїнової кислоти, позначають як "трансгенні" організми. Приклади способів трансформації рослин включають ті, які відомі в даній галузі і описані нижче. "Трансгенну подію" одержують за допомогою трансформації рослинних клітин гетерологічним ДНК-конструктом(ами), що включає нуклеїновокислотну експресуючу касету, яка містить трансген, що представляє інтерес, регенерацією популяції рослин, одержаних внаслідок вбудовування трансгена в геном рослини, і селекцією конкретної регенерованої рослини, що характеризується наявністю вставки в конкретній ділянці геному. Подію характеризують фенотипічно за допомогою експресії трансгена(ів). На генетичному рівні, подія є частиною геному рослини. Як застосовують в цьому документі, "зразок" включає будь-який зразок, який містить 5 UA 107923 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 молекули нуклеїнової кислоти або поліпептиди і одержаний з рослин, рослинного матеріалу або з продуктів, таких як, але не обмежуючись цим, харчові продукти або корми (свіжі або піддані обробці), які містять рослинний матеріал або одержані з рослинного матеріалу. Терміном "вбудовування" або "вбудований" в контексті трансформації позначають надання рослині гетерологічної конструкції ДНК таким чином, що конструкт одержує доступ до внутрішнього вмісту клітин рослини. Рослини і способи за винаходом не залежать від конкретного способу вбудовування нуклеїновокислотного конструкта в рослину, за винятком тільки того, що нуклеїновокислотний конструкт одержує доступ до внутрішнього вмісту щонайменше однієї клітини рослини. Способи вбудовування нуклеїновокислотних конструктів в рослини відомі в даній галузі, включаючи, як необмежувальні приклади, способи для стійкої трансформації, тимчасової трансформації і способи, які опосередковані вірусами. Термін "потомство" стосується рослин, одержаних за допомогою статевого розмноження (наприклад, аутокросинг, самозапилення або поворотне схрещування) між рослиною події 127 і іншим сортом. Навіть після повторних поворотних схрещувань з рекурентним батьком, вбудована ДНК і/або фланкуюча ДНК з батька події 127 присутня в потомстві після схрещування в тому ж положенні на хромосомі і її можна ідентифікувати, наприклад, скринінгом ділянок, специфічних для події 127. Як застосовують в цьому документі, "гетерологічна" відносно молекули нуклеїнової кислоти означає молекулу нуклеїнової кислоти, яка походить з чужорідних видів або, якщо з тих же самих видів, внаслідок навмисного втручання людини в композиції і/або в геномний локус, являє собою модифікацію своєї природної форми. "Виділена" або "очищена" молекула нуклеїнової кислоти або її біологічно активна частина, являє собою молекулу по суті або в основному вільну від компонентів, які, як показано, супроводжують молекулу нуклеїнової кислоти в її природному оточенні в нормі або взаємодіють з молекулою нуклеїнової кислоти. Таким чином, виділена або очищена молекула нуклеїнової кислоти є по суті вільною від іншого клітинного матеріалу або, у випадку одержання рекомбінантними способами, від середовища для культивування, або, будучи хімічно синтезованою, по суті вільною від хімічно синтезованих попередників або інших хімічних реагентів. "Зонд" стосується виділеної молекули нуклеїнової кислоти, до якої приєднують детектовану мітку або репортерну молекулу, наприклад радіоактивний ізотоп, ліганд, хемілюмінесцентний засіб, фермент і т. д. Такий зонд комплементарний до ланцюга цільової молекули нуклеїнової кислоти, а у випадку, що розглядається, до ланцюга ДНК, виділеного з біологічного матеріалу сої події 127, або з рослини сої, або із зразка, який включає ДНК події. Зонди включають не тільки дезоксирибонуклеїнові або рибонуклеїнові кислоти, але також поліаміди і інші матеріали для зонда, які можуть специфічно визначати наявність цільової послідовності ДНК. Як застосовують в цьому документі, "праймери" являють собою виділені молекули нуклеїнової кислоти, які здатні до відпалу з комплементарним ланцюгом цільової ДНК за допомогою гібридизації нуклеїнових кислот, з утворенням гібриду між праймером і ланцюгом цільової ДНК, який потім може подовжуватися вздовж ланцюга цільової ДНК за допомогою полімерази, наприклад ДНК-полімерази. "Пари праймерів" стосується пари праймерів для застосування в ампліфікації цільової молекули нуклеїнової кислоти, наприклад, за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) або іншими загальноприйнятими способами нуклеїновокислотної ампліфікації. "Полімеразна ланцюгова реакція" або "ПЛР" являє собою спосіб, який використовують для ампліфікації специфічних відрізків ДНК. "Лінія" або "штам" являє собою групу індивідуумів однакового походження, які, як правило, до деякої міри інбредні і які, як правило, є ізогенними або близькоізогенними. Термін "схрещений" або "схрещування" в контексті за даним винаходом означає злиття гамет, наприклад у випадку рослин, за допомогою запилення для одержання потомства (тобто клітин, насіння або рослин). Термін включає як статеве схрещування (запилення однієї рослини іншою) і у випадку рослин самозапліднення (самозапилення, тобто у випадку, якщо пилок і насінний зачаток представлені на одній і тій же рослині). Термін "інтрогресія" стосується передачі бажаного алеля генетичного локусу з одного генетичного фону в інший. У одному способі, бажані алелі можна піддавати інтрогресії за допомогою статевого схрещування двох батьків, де щонайменше один з батьків має в своєму геномі бажаний алель. II. Рослини сої події 127 Надані композиції і способи, що стосуються трансгенних рослин сої, стійких до інгібітору AHAS. Такі композиції включають рослини сої події 127. Рослину сої події 127 одержують модифікацією дикого типу або нетрасформованої рослини сої за допомогою вбудовування або 6 UA 107923 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 інтрогресії гена великої субодиниці синтази ацетогідроксикислот, який відповідає за стійкість до імідазолінону, з Arabidopsis thaliana (csr1-2) в геном сої, як визначено в цьому документі. У деяких варіантах здійснення вбудовування гена csr1-2 в геном сої забезпечує експресію модифікованої форми ферменту синтази ацетогідроксикислот (AHAS), з білком AHASL, що містить, замість природного серину, аспарагін у відповідному положенні 653 (S653N). Фермент AHAS являє собою фермент, важливий для біосинтезу амінокислот з розгалуженим ланцюгом, і інгібується деякими гербіцидами (інгібуючі AHAS гербіциди). Модифікація в гені AHAS дозволяє подолати це інгібування і, таким чином, забезпечує стійкість до широкого діапазону інгібуючих AHAS гербіцидів. Таким чином, рослина сої події 127 є стійкою щонайменше до одного інгібуючого AHAS гербіциду або є стійкою до більш широкої кількості щонайменше одного інгібуючого AHAS гербіциду, в порівнянні з рослиною сої, що не має молекули нуклеїнової кислоти події 127. Показано, що молекулу нуклеїнової кислоти, яка забезпечує стійкість до інгібітору AHAS, можна вбудовувати в охарактеризоване положення в геномі сої і одержувати, тим самим, подію 127. Рослина сої події 127, що містить молекулу нуклеїнової кислоти події 127, в описаному хромосомному положенні містить, в одному з варіантів здійснення, одну або декілька геномних/трансгенних сполук з щонайменше послідовністю молекул нуклеїнових кислот з SEQ ID NO:5 і/або 6. Характеристика геномної ділянки вбудовування події 127 забезпечує підвищену ефективність розведення і дає можливість застосування молекулярних маркерів для стеження за вбудованим трансгеном в популяції для розведення і їх потомстві. У цьому документі представлені різні способи і композиції для ідентифікації, детекції і застосування рослин сої події 127. Експресуюча касета csr1-2, фрагмент PvuII з плазміди pAC321, інтегрували в один охарактеризований генетичний локус в геномі сої для одержання події 127. У одному з варіантів здійснення в події 127 вбудована касета csr1-2 містить три точкові мутації відносно вихідного фрагмента трансформації з плазміди pAC321, з однією мутацією в кодуючій AHAS послідовності і двома іншими мутаціями по ходу транскрипції в 3’-нетрансльованій області AHASL (UTR). Такі мутації включають мутацію G на А в кодуючій послідовності, яка приводить до експресії поліпептиду AHAS із заміною амінокислоти R272 на K272. Аналіз Саузерн-блотинг і верифікація послідовності на наявність точкової мутації показують, що вставка є стабільною протягом щонайменше восьми поколінь. У події 127 вбудована ДНК також містить дуплікацію частини кодуючої послідовності csr1-2 розміром 376 пар нуклеотидів (п.н.) безпосередньо перед 3’-ділянкою вбудовування (дуплікація відповідає положенням 5694-6069 в SEQ ID NO:1). Цей дуплікований сегмент розміром 376 п.н. приводить до утворення відкритої рамки зчитування (ORF) розміром 501 п.н., яка поширюється на 3’-фланкуючу послідовність. Результати зворотної транскрипції і полімеразної ланцюгової реакції (ЗТ-ПЛР) дозволяють передбачити, що дана ORF розміром 501 п.н. не піддається транскрипції. У деяких варіантах здійснення молекула нуклеїнової кислоти події 127 також містить велику частину генного локусу γ субодиниці SEC61 Arabidopsis (At3g48570), яка є компонентом фрагмента ДНК, використовуваного для трансформації. В інших варіантах здійснення ген γ субодиниці SEC61 можна експресувати в рослині сої події 127. Наприклад, як описано більш детально в прикладах нижче, результати експериментів ЗТ-ПЛР показали, що ген γ субодиниці SEC61 Arabidopsis слабо транскрибується в тканині листа рослини події 127. Загалом, секвенували приблизно 1,3 тисяч пар нуклеотидів (т.п.н.) 5’-фланкуючої ДНК сої разом з приблизно 4,6 т.п.н. 3’-фланкуючої ДНК сої. Інформацію про фланкуючу послідовність можна використовувати в розробці способу детекції на основі якісної ПЛР, специфічної до події 127, відповідно до даного винаходу. Інші характеристики молекули нуклеїнової кислоти події 127, такі як ідентифіковані точкові мутації і дуплікації, також можна використовувати в способах, наданих в цьому документі, для детекції рослин події 127, включаючи потомство і його похідні. Рослини події 127 за даним винаходом є стійкими до застосування інгібуючих AHAS гербіцидів. Рослини події 127 виявляють стійкість або підвищену стійкість до інгібуючих AHAS гербіцидів, рівні застосування яких включають кількості, еквівалентні кількості застосування гербіцидів між 50 г д.р./га і приблизно 500 г д.р./га, між 70 г д.р./га і приблизно 400 г д.р./га і між 70 г д.р./га і приблизно 300 г д.р./га. Така стійкість може також включати стійкість до інгібуючих AHAS гербіцидів, які застосовуються на рівнях кількостей в 1, 2, 3, 4, 5 разів або більших, ніж комерційні рівні застосування гербіциду. Стійкість до інгібуючого AHAS гербіциду можна визначати будь-яким способом визначення стійкості до гербіцидів. Наприклад, рослина сої події 127 може демонструвати стійкість до інгібуючого AHAS гербіциду або іншого хімічного засобу, якщо у рослини спостерігають пошкодження, яке, в порівнянні з відповідною контрольною рослиною, представлене менше, ніж 7 UA 107923 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 пошкодження, що спостерігається у контрольної рослини щонайменше на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900% або 1000% або більше. Таким чином, рослина, яка є стійкою до інгібуючого AHAS гербіциду або іншого хімічного засобу, демонструє, в порівнянні з відповідною контрольною рослиною, "підвищену стійкість". Пошкодження, одержане внаслідок дії гербіциду або іншого хімічного впливу, визначає фахівець в даній галузі, за допомогою оцінки будь-якого параметра росту рослини або життєздатності, який вважається придатним. Пошкодження можна оцінювати візуальним оглядом і/або статистичним аналізом придатних параметрів, одержаних від індивідуальних рослин або групи рослин. Таким чином, пошкодження можна визначати оцінкою параметрів, наприклад, таких як висота рослини, маса рослини, колір листа, цвітіння, фертильність, врожайність, продукція насіння і т. п. Пошкодження можна також визначати оцінкою часу, який затрачений на конкретну стадію розвитку (наприклад, зрілість або цвітіння), або оцінкою часу, який пройшов до того моменту, як рослина відновилася після обробки конкретним хімічним засобом і/або гербіцидом. Пошкодження, викликане інгібуючим AHAS гербіцидом або іншим хімічним засобом, можна визначати в різні періоди часу після обробки або взаємодії рослини події 127 з гербіцидом. Пошкодження можна оцінювати приблизно в момент часу, в якому у контрольної рослини спостерігають максимальне пошкодження або пізніше того моменту часу, за який контрольна рослина, не оброблена гербіцидом або іншим хімічним засобом, значно виросла і/або розвинулася, в порівнянні з розміром або стадією розвитку, в якій проводили обробку. Крім того, пошкодження можна визначати в різні періоди часу, наприклад в 12 годин або на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 добу або через три тижні, чотири тижні або більше, після того, як тестовану рослину обробили гербіцидом. Будь-який часовий період є придатним для оцінки, за умови, що він дозволяє визначати відмінність в реакції на обробку у тестованої і контрольної рослин. Даний винахід додатково включає насіння лінії сої CV603 (також відомої як "BPS-CV127-9"), яка містить молекулу нуклеїнової кислоти події 127 і яку депонували як патентний депозит № 41603 NCIMB, і рослини, рослинні клітини і насіння, одержані від цієї лінії. Заявник(и) депонував щонайменше 2500 насінин рослин сої, що містять молекулу нуклеїнової кислоти події 127, в Національних колекціях промислових, харчових і морських бактерій (NCIMB), 23 St. Machar Drive, Aberdeen AB2 1RY, Шотландія, Великобританія, 22 грудня 2008 року, і депозиту наданий вхідний номер № 41603 в NCIMB. Ці депозити будуть підтримуватися відповідно до умов Будапештського договору про міжнародне визнання депонування мікроорганізмів для цілей патентної процедури. Цей депозит надається виключно як послуга для фахівців в даній галузі і не допускає того, щоб депозит запитувався по 35 U.S.C. § 112. Насіння, депоноване в NCIMB 22 грудня 2008 року, було взяте з депозиту, що підтримується Embrapa (Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuaria). Доступ до депозиту буде можливий, по запиту, протягом знаходження заявки на розгляді, для комісарів по патентних відомствах і товарних знаках і для осіб, визначених комісаром уповноваженими для цієї мети. При схваленні пунктів формули винаходу в заявці, заявник(и) забезпечить публічну доступність, згідно з 37 C.F.R. § 1808, зразка(ів) депозиту щонайменше 2500 насінин рослин сої, що містять молекулу нуклеїнової кислоти події 127, в Національних колекціях промислових, харчових і морських бактерій (NCIMB), 23 St. Machar Drive, Aberdeen AB2 1RY, Шотландія, Великобританія. Депозит насіння лінії сої CV603 буде підтримуватися в депозитарії NCIMB, який є загальнодоступним депозитарієм, протягом періоду часу 30 років або 5 років після останнього запиту, або протягом встановленого терміну дії патенту, залежно від того, який термін більш довгий, і буде замінений, якщо стане нежиттєздатним протягом вказаного періоду. Додатково, заявник(и) виконує всі вимоги 37 C.F.R. §§ 1801-1809, включаючи забезпечення умови життєздатності зразка при депонуванні. Заявник(и) не має права відмовлятися від будь-яких обмежень, встановлених законом на передачу біологічного матеріалу або його перевезення в комерційних цілях. Заявник(и) не відмовляється від будь-якого порушення своїх прав, що надаються даним патентом, або прав в області лінії сої CV603 відповідно до Закону про охорону сорту рослин (7 USC 2321 et seq.). Незаконне розмноження насіння заборонене. Насіння може бути адаптоване. Рослини сої події 127 за даним винаходом також включають потомство, похідні, варіанти і мутанти вихідної події трансформації, що є джерелом виникнення рослин сої події 127. Такі рослини можна ідентифікувати з використанням будь-якого способу ідентифікації таких рослин, включаючи, як необмежувальні приклади, врахування родоводу, способи визначення стійкості до гербіцидів, способи молекулярної детекції, способи, описувані в цьому документі, і їх комбінації. Рослини сої події 127 за даним винаходом є стійкими щонайменше до одного гербіциду, 8 UA 107923 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 який зачіпає активність ендогенного ферменту AHAS (інгібуючі AHAS гербіциди), що не має мутацію S653N. Гербіциди, які зачіпають активність ферменту AHAS, включають гербіциди на основі імідазолінону, сульфонілкарбаміду, триазолопіримідину, піримідинілоксибензоату, сульфоніламінокарбонілтриазолінону або їх суміші, або їх комбінації. У одному з варіантів здійснення такі гербіциди являють собою гербіциди на основі імідазолінону, сульфонілкарбаміду або їх суміші. Гербіциди на основі імідазолінону включають, але не обмежуються ними, PURSUIT® (імазетапір), CADRE® (імазапік), RAPTOR® (імазамокс), SCEPTER® (імазаквін), ASSERT® (імезатабенз), ARSENAL® (імазапір), похідне будь-яких вказаних вище гербіцидів і суміш або комбінацію двох або більше вказаних вище гербіцидів, наприклад імазапір/імазамокс (ODYSSEY®). Гербіцид на основі імідазолінону можна також вибрати, але не обмежуючись ними, з 2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідіазолін-2іл)нікотинової кислоти, 2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-3-хінолінкарбонової кислоти, 5-етил-2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)нікотинової кислоти, 2-(4ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-5-(метоксиметил)нікотинової кислоти, 2-(4-ізопропіл4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-5-метилнікотинової кислоти і суміші метил-6-(4-ізопропіл-4метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-м-толуату і метил-2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2іл)-п-толуату. В одному з варіантів здійснення з 5-етил-2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2імідазолін-2-іл)нікотинової кислоти і 2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-)іл-5(метоксиметил)нікотинової кислоти. В іншому варіанті здійснення використовують 2-(4ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-5-(метоксиметил)нікотинову кислоту. Гербіциди на основі сульфонілкарбаміду, які можна використовувати в даному винаході, включають, але не обмежуються ними, хлорсульфурон, метсульфуронметил, сульфометуронметил, хлоримуронетил, тифенсульфуронметил, трибенуронметил, бенсульфуронметил, нікосульфурон, етаметсульфуронметил, римсульфурон, трифлюсульфуронметил, триасульфурон, примісульфуронметил, циносульфурон, амідосульфурон, флузасульфурон, імазосульфурон, піразосульфуронетил, галогенсульфурон, азимсульфурон, циклосульфурон, етоксисульфурон, флазасульфурон, флупірсульфуронметил, форамсульфурон, йодсульфурон, оксасульфурон, мезосульфурон, просульфурон, сульфосульфурон, трифлоксисульфурон, тритосульфурон, похідне будь-якого з вказаних вище гербіцидів і суміш двох або більше вказаних вище гербіцидів. Гербіциди на основі триазолопіримідину за винаходом включають, але не обмежуються ними, хлорансулам, диклосулам, флорасулам, флуметсулам, метосулам і пеноксулам. Гербіциди на основі піримідинілоксибензоату (або піримідинілкарбокси) за винаходом включають, але не обмежуються ними, біспірибак, піритіобак, піримінобак, пірибензоксим і пірифталід. Гербіциди на основі сульфоніламінокарбонілтриазолінону включають, але не обмежуються ними, флукарбазон і пропоксикарбазон. Встановлено, що гербіциди на основі піримідинілоксибензоату стосуються гербіцидів на основі піримідинілтіобензоату і можуть розповсюджуватися під назвою гербіцидів на основі піримідинілтіобензоату, за допомогою американського товариства дослідників бур’янистих рослин. Таким чином, гербіциди за даним винаходом додатково включають гербіциди на основі піримідинілтіобензоату, включаючи, як необмежувальні приклади, гербіциди на основі піримідинілоксибензоату, описані вище. III. Молекули нуклеїнової кислоти Даний винахід також стосується виділеної молекули нуклеїнової кислоти події 127. Як застосовують в цьому документі, застосування терміна "молекула нуклеїнової кислоти" не призначене для обмеження молекули нуклеїновою кислотою включенням тільки ДНК, але також включає будь-які нуклеотиди, такі як рибонуклеотиди і комбінації рибонуклеотидів і дезоксирибонуклеотидів. Такі дезоксирибонуклеотиди і рибонуклеотиди включають як природні молекули, так і синтетичні аналоги. Молекули нуклеїнової кислоти також включають всі форми послідовності, включаючи, як необмежувальні приклади, одноланцюжкові форми, дволанцюжкові форми, шпильки, структури вигляду стебло-петля і т. п. В одному з варіантів здійснення молекула нуклеїнової кислоти події 127 включає молекулу нуклеїнової кислоти з послідовністю нуклеїнових кислот, розташованих в положеннях від 1312 до 6069 в SEQ ID NO:1. У іншому варіанті здійснення молекула нуклеїнової кислоти події 127 включає молекулу нуклеїнової кислоти з послідовністю нуклеотидів, розташованих в положеннях від 1302 до 6079 в SEQ ID NO:1. Молекула нуклеїнової кислоти події 127 також включає фрагменти SEQ ID NO:1. "Фрагменти" нуклеотидної послідовності можуть являти собою фрагменти будь-якої довжини, такої як, наприклад, щонайменше 7, 15, 20, 25, 30, 40, 60, 80, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 550, 650, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 2000, 2200, 2400, 2600, 2800, 3000, 9 UA 107923 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3500, 4000, 4500 або більше нуклеотидів (нт) в довжину. Ці фрагменти мають широке застосування, яке включає, але не обмежується ними, діагностичні зонди і праймери. Зрозуміло, що більш довгі фрагменти, такі як ті, довжина яких 601-8000 нт, також є придатними за даним винаходом, оскільки являють собою фрагменти, відповідні більшості, якщо не всім, нуклеотидних послідовностей SEQ ID NO:1. Під фрагментами щонайменше 20 нт в довжину мають на увазі, наприклад, фрагменти, які включають 20 або більше суміжних основ, наприклад, з нуклеотидної послідовності SEQ ID NO:1. Рослина події 127 включає трансгенну експресуючу касету з кодуючою послідовністю AHASL, яка має мутацію S653N, що забезпечує несприйнятливість або стійкість до інгібуючих гербіцидів на основі імідазолінону. Касета додатково включає 5’- і 3’-регуляторні послідовності, функціонально зв'язані з кодуючою послідовністю AHASL. "Функціонально зв'язаний" призначений для позначення функціонального зв'язку між двома або більше елементами. Наприклад, функціональний зв'язок між молекулою нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, і регуляторною послідовністю (наприклад, промотором) є функціональним зв'язком, який передбачений для експресії молекули нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес. Функціонально зв'язані елементи можуть бути суміжними або несуміжними. При використанні відносно з'єднання двох кодуючих білок областей, під функціонально зв'язаними потрібно розуміти, що кодуючі області розташовуються в одній і тій же рамці зчитування. Таким чином, експресуюча касета в рослині сої події 127 містить в 5’-3’-напрямі транскрипції область ініціації транскрипції (наприклад, промотор) і область ініціації трансляції, кодуючу область AHASL S653N і області термінації транскрипції і трансляції, що функціонують в рослинах. "Промотор" стосується нуклеотидної послідовності, здатної регулювати експресію кодуючої послідовності або функціональної РНК. В основному, кодуюча послідовність локалізована з 3’-кінця відносно промоторної послідовності. Послідовність промотору може включати проксимальні і більш дистальні елементи, розташовані проти ходу транскрипції, останні елементи часто позначають як енхансери. Таким чином, "енхансер" являє собою нуклеотидну послідовність, яка може стимулювати активність промотору і може бути внутрішнім елементом промотору або гетерологічним елементом, вбудованим для збільшення рівня ефективності або тканиноспецифічності промотору. Промотори можна одержувати в повному об'ємі з природного гена або комбінуванням різних елементів, одержаних з різних промоторів, знайдених в природі, або промотор навіть містить синтетичні нуклеотидні сегменти. Фахівцям в даній галузі буде зрозуміло, що різні промотори можуть керувати експресією гена в різних тканинах або типах клітин або на різних стадіях розвитку, або під дією різних умов навколишнього середовища. Промотори, які обумовлюють експресію фрагмента нуклеїнової кислоти в більшості типів клітин більшу частину часу, звичайно позначають як "конститутивні промотори". У одному з варіантів здійснення експресуюча касета в рослині сої події 127 містить, як функціонально зв'язані компоненти, кодуючу послідовність AHASL з S653N, розташовану під контролем промотору csr1-2 Arabidopsis thaliana, і область термінації транскрипції csr1-2. Експресуючу касету одержують у вигляді фрагмента PvuII з нуклеїновокислотного конструкта pAC321. У одному з варіантів здійснення експресуюча касета має послідовність SEQ ID NO:4. Надають виділені молекули нуклеїнової кислоти, які можна використовувати в різних способах для детекції і/або ідентифікації молекули нуклеїнової кислоти події 127. У одному з варіантів здійснення, "виділена" молекула нуклеїнової кислоти не має послідовностей (наприклад, послідовностей, кодуючих білок), які в природі фланкують молекулу нуклеїнової кислоти (тобто послідовності, розташовані на 5’- і 3’-кінцях нуклеїнової кислоти) в геномній ДНК організму, з якої одержана молекула нуклеїнової кислоти. Наприклад, в різних варіантах здійснення, виділена молекула нуклеїнової кислоти може містити менше ніж приблизно 5 т.п.н., 4 т.п.н., 3 т.п.н., 2 т.п.н., 1 т.п.н., 0,5 т.п.н. або 0,1 т.п.н. в нуклеотидній послідовності, яка в природі фланкує молекулу нуклеїнової кислоти в геномній ДНК клітини, з якої одержана молекула нуклеїнової кислоти. У деяких варіантах здійснення молекули нуклеїнової кислоти включають з'єднуючу послідовність ДНК, представлену в SEQ ID NO:5 і/або 6. В інших варіантах здійснення молекули нуклеїнової кислоти включають з'єднуючу послідовність ДНК, представлену в SEQ ID NO:5 і/або 6, або її варіанти і фрагменти. Фрагменти і варіанти з'єднуючої послідовності ДНК є придатними для відмітної ідентифікації ДНК події 127. Як обговорювалося в іншому місці цього документа, такі послідовності знаходять застосування як праймери і/або зонди для застосування при детекції в зразку вбудованої ДНК події 127. У інших варіантах здійснення надають молекули нуклеїнової кислоти, за допомогою яких можна детектувати рослини події 127, вбудовану ДНК події 127 або молекулу нуклеїнової 10 UA 107923 C2 5 10 15 кислоти, специфічну для події 127. Такі послідовності включають будь-яку молекулу нуклеїнової кислоти, що містить молекулу нуклеїнової кислоти, представлену в SEQ ID NO:5 і/або 6, або їх варіанти або комплементарні ним. У деяких варіантах здійснення молекула нуклеїнової кислоти, використовувана для детекції молекули нуклеїнової кислоти події 127, включає послідовність, представлену в SEQ ID NO:5 і/або 6 або комплементарну ним. Фрагменти і варіанти молекул нуклеїнової кислоти, які детектують молекулу нуклеїнової кислоти події 127, вбудовану ДНК події 127 або конкретну ділянку події 127, є придатними для відмітної ідентифікації рослин події 127. Як обговорювалося в іншому місці цього документа, такі послідовності знайшли застосування як праймери і/або зонди. Додатково представленими є виділені послідовності ДНК нуклеотидних праймерів, які містять або складаються з послідовності, представленої в SEQ ID NO:35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 47, 67, 68, 69, 70, або комплементарні ним, або варіанти і фрагменти SEQ ID NO:35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 47, 67, 68, 69, 70, або комплементарні ним. У одному з варіантів здійснення специфічна пара праймерів для застосування по цьому документу містить прямі і зворотні праймери, представлені нижче (ідентифіковане взаємне розташування в SEQ ID NO:1). Праймери розраховували для одержання смуги розміром 327 пар основ. Напрямок Послідовність праймера 5’-3’ Прямий Зворотний 20 25 30 35 40 45 50 55 Положення (SEQ ID NO:1) 1108-1131 1411-1434 SEQ ID NO: 69 70 Як застосовують в цьому документі, "варіанти", відносно послідовності нуклеїнової кислоти, стосуються по суті схожих послідовностей. Для молекул нуклеїнової кислоти, варіант містить молекулу нуклеїнової кислоти з делеціями (наприклад, укорочення) з 5’- і/або 3’-кінця; делецію і/або вставку одного або декількох нуклеотидів в одній або декількох внутрішніх ділянках в природній молекулі нуклеїнової кислоти; і/або заміну одного або декількох нуклеотидів в одній або декількох ділянках в природній молекулі нуклеїнової кислоти. У даному винаході можна використовувати будь-яку комбінацію праймерів, таку як ті, які описують в цьому документі, для детекції конкретної області події 127 (наприклад, SEQ ID NO:35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 47, 67, 68, 69 і 70). Необмежувальні приклади пар праймерів включають SEQ ID NO:35 і 36; SEQ ID NO:37 і 38; SEQ ID NO:39 і 40; SEQ ID NO:41 і 42; SEQ ID NO:43 і 44, SEQ ID NO:67 і 68, SEQ ID NO:69 і 70. За даним винаходом можна також конструювати додаткові праймери і пари праймерів для застосування в описаних способах. Зонди і праймери, для застосування в наданих способах, мають достатню нуклеотидну довжину для зв’язування з цільовою послідовністю ДНК і специфічної детекції і/або ідентифікації молекули нуклеїнової кислоти в біологічному зразку, наприклад, зразках, одержаних з тестованої рослини. Встановлено, що для досягнення цього результату умови гібридизації або реакції може визначити оператор. Довжина зондів і праймерів може являти собою будь-яку довжину, яка може бути корисною у виборі способу детекції, таку як 8, 10, 11, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 нуклеотидів або більше або приблизно від 11-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-100, 100-200, 200-300, 300-400, 400-500, 500-600, 600-700, 700-800 або більше нуклеотидів в довжину. Такі зонди і праймери можна специфічно гібридизувати з цільовою послідовністю в сильно "суворих умовах" гібридизації. Зонди і праймери, по варіантах здійснення, можуть мати послідовність ДНК, повністю ідентичну нуклеотидам, суміжним з цільовою послідовністю, хоч загальноприйнятими способами можна конструювати зонди, які відмінні від цільової послідовності ДНК і зберігають здатність специфічно детектувати і/або ідентифікувати цільову послідовність ДНК. Таким чином, зонди і праймери можуть розділяти приблизно 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% або більше ідентичності послідовності або коплементарності до цільової молекули нуклеїнової кислоти (наприклад, SEQ ID NO:35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44) або можуть відрізнятися від цільової послідовності (наприклад, SEQ ID NO:35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44) за рахунок 1, 2, 3, 4, 5, 6 або більше нуклеотидів. Зонди можна використовувати як праймери, але, як правило, їх конструюють для зв’язування з цільовою ДНК або РНК і не використовують в реакції ампліфікації. У деяких варіантах здійснення специфічні праймери можна використовувати для ампліфікації фрагмента ДНК події для одержання амплікона, який можна використовувати як "специфічний зонд", або амплікона, який сам може бути детектований для ідентифікації молекул нуклеїнової кислоти події 127 в біологічних зразках. Альтернативно, зонд можна 11 UA 107923 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 використовувати протягом реакції ПЛР для забезпечення детекції ампліфікованої події (наприклад, зонд Taqman або зонд MGB) (так звана ПЛР в реальному часі). Якщо зонд гібридизують з молекулами нуклеїнової кислоти в біологічному зразку в умовах, які забезпечують зв’язування зонда із зразком, це зв’язування можна детектувати, і це, таким чином, забезпечує наявність показника присутності події 127 в біологічному зразку. Така ідентифікація зв'язаного зонда описана в даній галузі. У одному з варіантів здійснення зонд являє собою послідовність, яка, в оптимальних умовах, специфічно гібридизується з областю, що включає 5’- або 3’-фланкуючу область події, включаючи також частину вбудованої ДНК, суміжної з нею, таким чином, перекриваючи область з'єднання. Специфічний зонд може містити послідовність, щонайменше на 80%, між 80 і 85%, між 85 і 90%, між 90 і 95% і між 95 і 100% ідентичну (або комплементарну) специфічній ділянці молекули нуклеїнової кислоти події 127. Як застосовують в цьому документі, "ампліфікована ДНК" або "амплікон" стосується продукту ампліфікації цільової молекули нуклеїнової кислоти, яка є частиною нуклеїновокислотної матриці. Наприклад, для визначення того, чи містить одержана в результаті статевого схрещування рослина сої молекулу нуклеїнової кислоти події 127, ДНК, одержану з тканини рослини сої, можна піддавати способу ампліфікації молекул нуклеїнових кислот, використовуючи пару праймерів з ДНК, яка включає перший праймер, одержаний до фланкуючої послідовності, розташованої поруч з ділянкою вбудовування вбудованої гетерологічної ДНК, а другий праймер одержаний до вбудованої гетерологічної ДНК, для одержання амплікона, який є діагностичним або є показником наявності молекули нуклеїнової кислоти події 127. За допомогою "діагностичної" для ділянки події 127 позначають застосування будь-якого способу або аналізу, який дозволяє зробити відмінність між наявністю або відсутністю ділянки події 127 в біологічному зразку. Альтернативно, другий праймер можна одержувати до фланкуючої послідовності. У інших варіантах здійснення пари праймерів можна одержувати до фланкуючих послідовностей, які розташовані по обох сторонах вбудованої ДНК, щоб, таким чином, одержати амплікон, який включає повну вбудовану молекулу нуклеїнової кислоти експресуючої конструкції, а також послідовність, фланкуючу трансгенну вставку, наприклад, SEQ ID NO:1. Амплікон має довжину і послідовність, яка також є діагностичною для події (наприклад, містить ДНК-з'єднання з ділянки події 127). Амплікон може варіювати в довжину, від комбінованої довжини пар праймерів і однієї пари нуклеотидних основ до будь-якої довжини амплікона, одержуваної по протоколу ампліфікації ДНК. Представник пари праймерів, одержаний з фланкуючої послідовності, може бути розташований на відстані від вбудованої послідовності ДНК, ця відстань може варіювати від однієї нуклеотидної пари основ аж до граничних величин реакції ампліфікації або приблизно двадцяти тисяч нуклеотидних пар основ. У іншому варіанті здійснення пари праймерів можна конструювати для ампліфікації вбудованої ДНК або фрагмента вбудованої ДНК. Такі пари праймерів придатні для детекції наявності в біологічному зразку вбудованої ДНК події 127. Застосування терміна "амплікон", зокрема, виключає димери праймерів, які можуть утворюватися в залежній від температури реакції ампліфікації ДНК. У певних варіантах здійснення придатні пари праймерів будуть включати один праймер, який перекриває точку з'єднання вбудованої ДНК і фланкуючих 5’-або 3’-послідовностей геномної ДНК. Такі праймери можна конструювати до послідовності, яка розташовується поблизу точки з'єднання 5’-фланкуючої ДНК і вбудованої ДНК (тобто з'єднання між положеннями 1311 і 1312 SEQ ID NO:1), а також поблизу точки з'єднання між вбудованою ДНК і 3’-фланкуючою ДНК (тобто з'єднання між положеннями 6069 і 6070 SEQ ID NO:1). Такі праймери можна конструювати для гібридизації з приблизно 10 нуклеотидами, або з фланкуючої області, або з вбудованої ДНК, і щонайменше з 1 нуклеотидом, що проходить через точку з'єднання у вбудованій ДНК або фланкуючій області. Таким чином, праймери можуть містити, наприклад, нуклеотидні послідовності, сконструйовані для гібридизації з нуклеотидами, представленими щонайменше наступними положеннями в SEQ ID NO:1: 1311-1321, 1302-1312, 6060-6070 і/або 6069-6079. У інших варіантах здійснення придатні пари праймерів будуть включати праймер, який перекриває точку з'єднання 5’-кінця дубльованої частини кодуючої послідовності csr1-2 у вбудованій ДНК (в положенні 5694 SEQ ID NO:1) і суміжній вбудованій ДНК (тобто в положенні 5693 SEQ ID NO:1). Такі праймери можна конструювати для гібридизації з приблизно 10 нуклеотидами, або з дубльованої ділянки, або з суміжної вбудованої ДНК, і з щонайменше 1 нуклеотидом, що проходить через точку з'єднання (наприклад, щонайменше 5693-5703 або щонайменше 5684-5694 в SEQ ID NO:1). Способи одержання і використання зондів і праймерів для застосування в даному винаході є відомими в даній галузі. Пари праймерів для ПЛР можна одержувати з відомої послідовності, 12 UA 107923 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 наприклад, з використанням комп'ютерних програм, призначених для такої мети, таких як аналіз праймерів для ПЛР у версії 6 програми Vector NTI (Informax Inc., Bethesda Md.); PrimerSelect (DNASTAR Inc., Madison, Wis.); і Primer (Version 0,5©, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, Mass.). Додатково, послідовність можна візуально вивчати і ідентифікувати праймери вручну, використовуючи керівництво, відоме фахівцю в даній галузі. IV. Способи розведення Описані рослини сої події 127 можна використовувати в програмі розведення, використовуючи способи розведення для одержання додаткових рослин сої події 127, таких як рослини-нащадки. Такі способи розведення можна використовувати для одержання рослин сої для застосування, наприклад, в комерційному виробництві в різних географічних областях або для одержання додаткових популяцій поколінь сої. Крім того, рослини сої події 127 можна використовувати в програмах розведення, використовуючи способи розведення для одержання рослин сої з додатковими ознаками, що представляють інтерес, комбінованими з ознакою стійкості до інгібітору AHAS (що також позначаються як "об'єднані ознаки" або "об'єднання ознак"), такі як комбінації несприйнятливості до інших гербіцидів, таких як гербіциди на основі гліфосату, глуфосинату і/або гербіцид дикамба. Крім того, рослини сої події 127 можна використовувати в програмі розведення, використовуючи способи розведення для одержання рослин сої, з кодуючими послідовностями, що забезпечують множинну несприйнятливість до інгібуючого AHAS гербіциду. Описані рослини також можна використовувати в програмах розведення, використовуючи способи розведення для одержання рослин з ознакою стійкості до інгібуючого AHAS гербіциду, об'єднаної з іншими агрономічно важливими ознаками, що включають початкові ознаки (такі як несприйнятливість до захворювань і патогенів, такі ознаки, які забезпечуються геном Bt) і кінцеві ознаки( такі як якість і кількість олії і білка). Описані способи розведення рослин сої, несприйнятливих до інгібуючого AHAS гербіциду, включають стадії: (a) схрещування рослини сої події 127 з другою рослиною сої; і (b) одержання, в результаті схрещування, насіння. Одержане насіння можна додатково піддавати скринінгу для ідентифікації насіння, яке містить молекулу нуклеїнової кислоти події 127. У такі способи можна додатково включати одержання зразка ДНК з насіння, одержаного внаслідок схрещування, і аналіз зразка на наявність або відсутність молекули нуклеїнової кислоти події 127. Альтернативно, насіння можна піддавати скринінгу на стійкість до інгібуючого AHAS гербіциду для ідентифікації насіння або нащадків, які містять ДНК події 127. Рослину сої події 127 можна розмножувати, використовуючи будь-які способи розведення, доступні для рослин сої. Наприклад, рослину сої події 127 можна розмножувати за допомогою першого статевого схрещування першої батьківської рослини сої, що виросла від трансгенної рослини сої події 127 (або її потомства, одержаного внаслідок трансформації експресуючими касетами по варіанту здійснення, які додають стійкість до гербіцидів), і другої батьківської рослини сої, яка позбавлена фенотипу стійкості до гербіциду, з одержанням, таким чином, множини рослин-нащадків першого покоління; і подальшого відбору рослин-нащадків першого покоління, які демонструють необхідну стійкість до гербіциду; і самозапилення рослин-нащадків першого покоління, з одержанням, таким чином, множини рослин-нащадків другого покоління; і подальшого відбору рослин-нащадків другого покоління, які демонструють необхідну стійкість до гербіцидів. Ці стадії можуть додатково включати поворотне схрещування рослин-нащадків першого покоління, стійких до гербіцидів, або рослин-нащадків другого покоління, стійких до гербіцидів, з другою батьківською рослиною сої або третьою батьківською рослиною сої, з одержанням, тим самим, рослин сої, які демонструють необхідну несприйнятливість до гербіцидів. Додатково показали, що аналіз фенотипу потомства непотрібний. Різні способи і композиції, які описані в іншому місці цього документа, можна використовувати для детекції і/або ідентифікації вставки події 127. Також буде зрозуміло, що різні трансгенні рослини можна також піддавати статевому схрещуванню для одержання потомства, яке містить два незалежно доданих сегрегуючих екзогенних гени. Самозапиленням придатних нащадків можна одержувати рослини, які є гомозиготними по обох доданих екзогенних генах. Також передбачають поворотне схрещування з батьківською рослиною і аутокросинг з нетрансгеною рослиною, також як і вегетативне розмноження. Однак будь-який спосіб можна використовувати для створення таких рослин. Можна виводити інбредні лінії сої, що містять молекулу нуклеїнової кислоти події 127, для застосування в одержанні сортів сої і як батьківських рослин в програмах розведення, для створення нових і відмітних інбредних ліній сої. Інбредні лінії сої часто використовують як цільові лінії для інтрогресії нових ознак, за допомогою загальноприйнятих способів розведення і/або молекулярних способів інтрогресії. Доступними є багато які аналітичні способи для 13 UA 107923 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 визначення гомозиготної і фенотипічної стабільності інбредних ліній. У деяких варіантах здійснення молекулу нуклеїнової кислоти, що приводить в результаті до одержання рослини сої події 127 за винаходом, можна конструювати в молекулярному зчепленні з молекулою нуклеїнової кислоти, яка надає властивість несприйнятливості до другого гербіциду, такого як гліфосат. У інших варіантах здійснення молекулярне зчеплення додатково містить щонайменше одну додаткову молекулу нуклеїнової кислоти, яка надає властивість стійкості до третього гербіциду. У одному з варіантів здійснення послідовність надає властивість стійкості до глуфосинату, і в конкретному варіанті здійснення послідовність включає pat. У інших варіантах здійснення рослина сої події 127 за винаходом містить одну або декілька ознак, що представляють інтерес, і, в деяких варіантах здійснення, для створення рослин з необхідною комбінацією ознак, ДНК події 127 об'єднана з будь-якою комбінацією послідовностей молекул нуклеїнової кислоти і/або ознаками, що представляють інтерес. Ознака, як застосовують в цьому документі, стосується фенотипу, одержаного з конкретної послідовності або групи послідовностей. Наприклад, молекулу нуклеїнової кислоти, що забезпечує стійкість до гербіцидів, можна об'єднувати з будь-якими іншими молекулами нуклеїнової кислоти, кодуючими поліпептиди з пестицидною і/або інсектицидною активністю, такі як токсичні білки Bacillus thuringiensis (білки Bt), лектини і т. п. Одержані комбінації можуть також включати множинні копії будь-яких молекул нуклеїнової кислоти, що представляють інтерес. У деяких варіантах здійснення, для створення трансгенної рослини за винаходом з додатковими поліпшеними властивостями, ДНК сої події 127 можна об'єднувати з ДНК, які забезпечують інші ознаки стійкості до гербіцидів. Інші молекули нуклеїнової кислоти, що забезпечують стійкість до гербіцидів, які можна використовувати в таких варіантах здійснення, включають ті, які надають стійкість до гліфосату або до інгібіторів AHAS за допомогою інших способів дії, таких як, наприклад, ген, який кодує фермент гліфосатоксидоредуктазу. Інші ознаки, які можна комбінувати з ДНК сої події 127, включають ті, що одержані з молекули нуклеїнової кислоти, яка надає рослині здатність продукувати на підвищеному рівні 5енолпірувілшикімат-3-фосфатсинтазу (EPSPS). Інші ознаки, які можна комбінувати з подією 127 сої, включають ті ознаки, які надають стійкість до сульфонілкарбаміду і/або імідазолінону. У деяких варіантах здійснення ДНК сої події 127 можна об'єднувати, наприклад, з гідроксифенілпіруватдіоксигеназою, що являє собою фермент, який каталізує реакцію, в якій парагідроксифенілпіруват (HPP) трансформують в гомогентизат. Молекули, які інгібують цей фермент і які зв'язуються з ферментом для інгібування трансформації HPP в гомогентизат, є придатними як гербіциди. Ознаки, що надають рослинам стійкість до таких гербіцидів, є відомими в даній галузі. Інші приклади придатних ознак, що забезпечують стійкість до гербіцидів, які можна об'єднувати з ДНК сої події 127, включають молекули нуклеїнової кислоти, що кодують арилоксіалканоатдіоксигеназу (яка, як повідомляють, надає стійкість до 2,4-D і інших гербіцидів на основі феноксіауксину, а також до гербіцидів на основі арилоксифеноксипропіонату), і молекули нуклеїнової кислоти, що надають стійкість до гербіциду дикамба. Інші приклади ознак, що надають стійкість до гербіцидів, які можна об'єднувати з ДНК сої події 127, включають ті ознаки, які забезпечуються молекулами нуклеїнової кислоти, кодуючими екзогенну фосфінотрицинацетилтрансферазу. Рослини, що містять екзогенну фосфінотрицинацетилтрансферазу, можуть виявляти підвищену стійкість до гербіцидів на основі глуфосинату, які інгібують фермент глутамінсинтазу. Інші приклади ознак, що надають стійкість до гербіцидів, які можна об'єднувати з ДНК сої події 127, включають ті ознаки, які забезпечуються молекулами нуклеїнової кислоти, що змінюють активність протопорфіриногеноксидази (протокс). Рослини, що містять такі молекули нуклеїнової кислоти, можуть виявляти підвищену стійкість до будь-якого різновиду гербіцидів, ціль яких - фермент протокс (що також позначаються як "інгібітори протоксу"). Інші приклади ознак, що надають стійкість до гербіцидів, які можна об'єднувати з ознакою стійкості до гербіцидів, інгібуючих AHAS, включають ознаки, які надають стійкість щонайменше до одного гербіциду у рослини, такої як, наприклад, рослина сої. Рослини сої, стійкі до гербіцидів, відомі в даній галузі, оскільки є рослинами, які розрізнюються по своїй стійкості до конкретних гербіцидів. Для одержання рослини за винаходом, а також для способів її застосування можна комбінувати ознаку(и), відповідальну за стійкість до гербіцидів, за допомогою розведення або за допомогою інших способів, придатних для рослини сої події 127. ДНК сої події 127 також можна комбінувати щонайменше з однією іншою ознакою, для одержання рослин за даним винаходом, які додатково містять ряд комбінацій необхідних ознак, 14 UA 107923 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 включаючи, як необмежувальні приклади, ознаки, необхідні для корму для тварин, такі як високий вміст олії, композиція амінокислот, вміст білка, підвищена засвоюваність або змінена композиція жирних кислот. ДНК сої події 127 також можна комбінувати з іншими необхідними ознаками, такими як, наприклад, авірулентність і наявність генів, що забезпечують ознаки стійкості до захворювань, таких як ознаки несприйнятливості до цистоутворювальної нематоди сої, наприклад SCN, і ознаки, необхідні для переробки або виробництва продуктів, такі як підвищений вміст олії або модифікована композиція жирних кислот (наприклад, гени десатурази жирних кислот; і для полімерів або біопластиків (наприклад, бета-кетотіолаза, полігідроксибутиратсинтаза і ацетоацетил-КоА-редуктаза), що полегшують експресію полігідроксіалканоатів (PHA)). Молекули нуклеїнової кислоти, що забезпечують стійкість до гербіцидів, можна також комбінувати з молекулами нуклеїнової кислоти, що забезпечують будь-які агротехнічні характеристики. Об'єднані комбінації можна створювати будь-яким способом, включаючи, як необмежувальні приклади, розведення рослин будь-яким відомим способом або генетичну трансформацію. Якщо послідовності об'єднують за допомогою генетичної трансформації рослин, послідовності молекул нуклеїнової кислоти, що представляють інтерес, можна комбінувати в будь-який період часу і в будь-якому порядку. Ознаки можуть бути введені одночасно, в протоколі спільної трансформації з молекулами нуклеїнової кислоти, що представляють інтерес, при умові комбінації касет для трансформації. Наприклад, при введенні двох послідовностей, дві послідовності можуть міститися в окремих касетах для трансформації (транс) або в одній і тій же касеті для трансформації (цис). Експресію послідовностей можна одержувати під одним і тим же промотором або під різними промоторами. У деяких випадках, може бути бажаним введення касети для трансформації, яка буде гальмувати експресію молекули нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес. Це можна комбінувати з будь-якою комбінацією інших касет для супресії або надекспресуючих касет для створення необхідної комбінації ознак у рослини. Додатково показано, що молекули нуклеїнової кислоти можна об'єднувати в необхідному положенні в геномі, використовуючи систему сайт-специфічної рекомбінації. Також представлені способи розведення рослин сої з ДНК події 127, де способи включають (a) схрещування рослини сої події 127 або її похідних з другою батьківською рослиною сої; (b) одержання насіння внаслідок схрещування; (с) одержання зразка ДНК з однієї або декількох насінин; і (d) визначення наявності молекули нуклеїнової кислоти події 127. V. Трансформовані рослини Рослини сої, що мають ознаки, комбіновані з ознакою наявності події 127, також можна одержувати за допомогою трансформації рослинного матеріалу або частин рослини, одержаних від рослин сої події 127. Додаткові ознаки можна комбінувати в рослинах сої події 127, використовуючи будь-який спосіб трансформації, доступний для фахівців в даній галузі. Таким чином, рослини сої події 127 можна використовувати як джерело рослинного матеріалу для застосування в способах трансформації для введення додаткових гетерологічних молекул нуклеїнової кислоти в рослину сої події 127. Наприклад, вектори для трансформації можна одержувати для введення генів, що представляють інтерес, в рослини сої події 127 для одержання рослин сої, що мають множинні введені ознаки. Для застосування в таких способах можна використовувати вектори для трансформації для одержання рослин, трансформованих будь-яким геном, що представляє інтерес, включаючи ті, які описані в цьому документі. Вектор для трансформації може включати селективний маркер, і підлягаючий введенню ген, що представляє інтерес, як правило, експресується в трансформованій рослині сої події 127. Такі селективні маркери відомі в даній галузі. Гени, що представляють інтерес, за винаходом варіюють залежно від підлягаючої введенню необхідної ознаки. Наприклад, різні зміни в фенотипі, які можуть представляти інтерес, включають модифіковану композицію жирних кислот в рослині, змінений амінокислотний склад рослини, зміну комахи у рослини і/або механізмів захисту від патогенів і т. п. Цих результатів можна досягнути забезпеченням експресії гетерологічних продуктів або підвищеною експресією ендогенних продуктів в рослинах. Альтернативно, для зниження експресії одного або декількох ендогенних продуктів, конкретно ферментів або кофакторів, результатів можна досягти за допомогою надання рослині ендогенних продуктів. Ці зміни приводять до зміни фенотипу трансформованої рослини. У способах за даним винаходом можна використовувати будь-який вектор для трансформації. Ряд векторів для трансформації рослин і способи трансформації рослин є доступними. Способи трансформації можна використовувати для об'єднання будь-якої ознаки з ознакою, що забезпечує стійкість до інгібуючого AHAS гербіциду, що забезпечується вставкою 15 UA 107923 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 події 127, включаючи ті ознаки, які описують в цьому документі. VI. Способи детекції Також представлені способи і композиції для ідентифікації і/або детекції в біологічному зразку молекул нуклеїнової кислоти події 127, наприклад в зразку, одержаному з рослини сої, включаючи її потомство і похідні. Такі способи знаходять застосування при ідентифікації і/або детекції ділянок події 127 або молекул нуклеїнової кислоти події 127 в будь-якому біологічному матеріалі. Такі способи включають, наприклад, способи, які доводять однорідність насіння, і способи скринінгу насіння в партії насіння на наявність молекули нуклеїнової кислоти події 127. У одному з варіантів здійснення надають спосіб для ідентифікації молекули нуклеїнової кислоти з вбудованою подією 127 в біологічному зразку, де спосіб включає одержання суміші з біологічного зразка і першого і другого нуклеїновокислотних праймерів, що допускають ампліфікацію молекули нуклеїнової кислоти події 127; проведення реакції в суміші в умовах, які дозволяють першому і другому нуклеїновокислотним праймерам ампліфікувати молекулу нуклеїнової кислоти події 127 сої; і детекцію наявності або відсутності ампліфікованої молекули нуклеїнової кислоти події 127. У деяких варіантах здійснення молекула нуклеїнової кислоти події 127 є молекулою нуклеїнової кислоти, специфічною для події 127. Також представлені способи ідентифікації молекули нуклеїнової кислоти події 127 в біологічному зразку, де способи включають одержання суміші, що містить біологічний зразок з ДНК сої і молекулу нуклеїновокислотного зонда, який здатний гібридизуватися з молекулою нуклеїнової кислоти події 127 сої, проведення реакції в суміші в умовах, які дозволяють молекулі нуклеїновокислотного зонда гібридизуватися з молекулою нуклеїнової кислоти події 127, і детекцію того, чи відбулася в зразку гібридизація молекули нуклеїновокислотного зонда з молекулою нуклеїнової кислоти події 127, де наявність гібридизації свідчить про присутність молекули нуклеїнової кислоти події 127. Способи за даним винаходом також можна використовувати для ідентифікації і/або детекції в біологічному зразку молекули нуклеїнової кислоти з вбудованою подією 127. У одному з варіантів здійснення надають спосіб ідентифікації молекули нуклеїнової кислоти події 127 в біологічному зразку, і спосіб включає одержання суміші з біологічного зразка і першого і другого нуклеїновокислотних праймерів, здатних забезпечити ампліфікацію молекули нуклеїнової кислоти з вбудованою подією 127; проведення реакції в суміші в умовах, які дозволяють першому і другому нуклеїновокислотним праймерам забезпечувати ампліфікацію молекули нуклеїнової кислоти з вбудованою подією 127; і детекцію наявності або відсутності ампліфікованої молекули нуклеїнової кислоти з вбудованою подією 127. Також представлені способи ідентифікації в біологічному зразку молекул нуклеїнової кислоти події 127, де способи включають одержання суміші, що містить біологічний зразок з ДНК і молекулу нуклеїновокислотного зонда, який здатний гібридизуватися з молекулою нуклеїнової кислоти події 127, реакцію в суміші в умовах, які дозволяють молекулі нуклеїновокислотного зонда гібридизуватися з молекулою нуклеїнової кислоти події 127, і детекцію того, чи відбулася в зразку гібридизація молекули нуклеїновокислотного зонда з молекулою нуклеїнової кислоти події 127, де наявність гібридизації свідчить про присутність молекули нуклеїнової кислоти події 127. Додатково представлені способи детекції в біологічному зразку ділянок події 127. Ділянки події 127, які можна детектувати, використовуючи способи за даним винаходом, включають ДНК з вбудованою подією 127, 5’-ділянки з'єднання, 3’-ділянки з'єднання, 5’-фланкуючі області, 3’фланкуючі області, специфічні мутації або дуплікації у вбудованій ДНК, зумовлені трансформаційною подією або їх комбінацією і фрагментами будь-яких з них. Біологічний зразок може містити будь-який зразок, в якому бажають визначити присутність молекули нуклеїнової кислоти події 127. Наприклад, біологічний зразок може включати будьякий матеріал рослини або матеріал, що містить матеріал рослини або одержаний з матеріалу рослини, такий як, але не обмежуючись цим, харчові продукти або корма. Як застосовують в цьому документі, "матеріал рослини" стосується матеріалу, який одержують або виробляють з рослини або частини рослини. У конкретних варіантах здійснення, біологічний зразок включає тканину сої. У інших варіантах здійснення біологічний зразок одержують з тканини листя сої. У інших варіантах здійснення біологічний зразок одержують з тканини насіння сої. Будь-яку молекулу нуклеїнової кислоти, зв'язану з подією 127, можна детектувати і/або ідентифікувати, використовуючи способи за даним винаходом. Наприклад, молекули нуклеїнової кислоти, які можна детектувати, включають, як необмежувальні приклади, ДНК, мРНК, кДНК і т. п. В інших варіантах здійснення, використовуючи способи за даним винаходом, можна детектувати і/або ідентифікувати поліпептиди, кодовані молекулою нуклеїнової кислоти події 127. Детектовані і/або ідентифіковані молекули нуклеїнової кислоти можуть включати 16 UA 107923 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 будь-який фрагмент ДНК з вставкою події 127, включаючи ідентифіковані мутації у вставці ДНК, наприклад молекули нуклеїнової кислоти, кодуючі поліпептиди AHAS з S653N або R272K і т. п., послідовності промотору, термінуючі послідовності, фрагменти таких послідовностей і їх комбінації. Праймери і зонди для застосування в способах, описуваних в цьому документі, можна використовувати для підтвердження (і, якщо необхідно, для корекції) описаних послідовностей за допомогою загальноприйнятих способів, наприклад за допомогою повторного клонування і секвенування таких послідовностей. Молекули нуклеїновокислотних зондів і праймерів специфічно детектують цільову послідовність ДНК. Будь-який загальноприйнятий спосіб нуклеїновокислотної гібридизації або ампліфікації можна використовувати для детекції або ідентифікації в зразку наявності молекули нуклеїнової кислоти трансгенної події. Під виразом "специфічно визначати" потрібно розуміти, що молекулу нуклеїнової кислоти можна використовувати або як праймер для ампліфікації специфічної ділянки 127, або як зонд, який гібридизується в "суворих умовах" з молекулою нуклеїновою кислотою, що має специфічну ділянку події 127. Рівень або міра гібридизації, які забезпечують специфічну детекцію події 127 або специфічної ділянки події 127, є достатніми для розпізнавання молекули нуклеїнової кислоти зі специфічною ділянкою 127 і молекули нуклеїнової кислоти без цієї ділянки і забезпечують, тим самим, відмітну ідентифікацію молекули події 127. Під виразом "розділяти достатню ідентичність або комплементарність послідовності для забезпечення ампліфікації молекули нуклеїнової кислоти події 127" мають на увазі послідовність, яка розділяє щонайменше 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% або 100% ідентичності або комплементарності з фрагментом молекули нуклеїнової кислоти, що має молекулу нуклеїнової кислоти події 127, або з повнорозмірною молекулою нуклеїнової кислоти, що має молекулу нуклеїнової кислоти події 127. Відносно ампліфікації цільової молекули нуклеїнової кислоти (наприклад, за допомогою ПЛР) з використанням специфічної пари праймерів для ампліфікації, "суворі умови" являють собою умови, які дозволяють парі праймерів гібридизуватися з цільовою молекулою нуклеїнової кислоти, з якою буде зв'язуватися праймер, що має відповідну послідовність дикого типу (або комплементарну їй), і дозволяють переважно одержувати, в залежній від температури реакції ампліфікації ДНК, продукт ампліфікації (амплікон), що піддається ідентифікації, який має молекулу нуклеїнової кислоти події 127. У способі ПЛР, олігонуклеотидні праймери можна конструювати для застосування в реакціях ПЛР для ампліфікації молекули нуклеїнової кислоти події 127. Способи конструювання праймерів для ПЛР і ПЛР-клонування, як правило, відомі в даній галузі. Зрозуміло, що ряд параметрів в конкретних протоколах ПЛР можна за потреби адаптувати до конкретних лабораторних умов і можна трохи модифікувати, і, проте, забезпечити набір схожих результатів. Ці поправки будуть очевидні фахівцям в даній галузі. Для застосування в описаних способах можна використовувати праймери для ампліфікації будь-якої молекули нуклеїнової кислоти події 127. Наприклад, можна конструювати пари праймерів, що здатні забезпечити апліфікацію ділянок, які є показником рослини, що містить фрагмент молекули нуклеїнової кислоти події 127. У одному з варіантів здійснення такі пари праймерів можуть забезпечити ампліфікацію ділянки, що містить одну ділянку з'єднання, наприклад 5’-ділянку з'єднання або 3’-ділянку з'єднання. Такі пари праймерів включають один праймер, який здатний забезпечити подовження праймера від фланкуючої ділянки хромосоми (наприклад, 5’- або 3’-фланкуючі області) в напрямі вставки ДНК, тоді як другий праймер здатний забезпечити подовження праймера від вставки ДНК в напрямі першого праймера у фланкуючій ділянці хромосоми. Такі пари праймерів ампліфікують молекулу нуклеїнової кислоти, яка включає ділянку з'єднання. У деяких варіантах здійснення один з праймерів, використовуваних в ампліфікаційній парі, є здатним до відпалу з ділянкою, яка охоплює одну з ділянок з'єднання (наприклад, 5’- або 3’-ділянка з'єднання) і здатна забезпечувати ампліфікацію в напрямі ділянки хромосоми або в напрямі вставки. Праймери до фланкуючої ділянки хромосоми для застосування в таких способах можуть бути здатними до відпалу або з 5’-, або з 3’-фланкуючими ділянками хромосоми і ініціювати ампліфікацію в напрямі вставки. У інших варіантах здійснення можна конструювати пари праймерів, які здатні забезпечувати апліфікацію двох ділянок з'єднання. Для застосування в таких способах можна конструювати інші приклади придатних праймерів, які здатні до відпалу з 5’- або 3’-фланкуючими областями і можуть включати, наприклад, послідовності праймерів з від приблизно 10 або 12 до приблизно 40 нуклеотидів, здатних до відпалу з молекулою нуклеїнової кислоти, представленою між положеннями 1-1311 SEQ ID NO:1 або положеннями від 6070 до 10656 SEQ ID NO:1. Альтернативно, можна конструювати випадкові праймери, які здатні до відпалу на протязі 17 UA 107923 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 всього геному рослини і які можна використовувати в комбінації зі специфічним до послідовності вставки праймером для ампліфікації молекули нуклеїнової кислоти, яка включає вставку ДНК і фрагмент фланкуючої послідовності. У деяких варіантах здійснення праймер, специфічний до послідовності вставки, можна помітити, що дозволяє здійснювати детекцію ампліфікованого фрагмента, використовуючи праймер, специфічний до послідовності вставки. У інших варіантах здійснення, для ідентифікації або детекції молекул нуклеїнової кислоти події 127 з міченими зондами можна гібридизувати одержані в результаті ампліфіковані молекули нуклеїнової кислоти. У іншому варіанті здійснення можна конструювати пари праймерів, які дозволяють ампліфікувати повну послідовність ДНК-вставки або частину послідовності вставки, яка є показником наявності ДНК події 127. Наприклад, в деяких варіантах здійснення можна конструювати пари праймерів для ампліфікації повної послідовності ДНК-вставки, використовуючи праймери, які розташовуються на початку 5’- і 3’-фланкуючих областей вставки. Альтернативно, можна конструювати пари праймерів, які здатні забезпечувати ампліфікацію тільки ділянки вставки з подією 127 для ідентифікації наявності вставки. Наприклад, для застосування при детекції вставки в біологічному зразку можна конструювати праймери для апліфікації будь-якої ділянки в межах фрагмента PvuII плазміди pAC321. Такі праймери включають праймери, які здатні забезпечувати ампліфікацію будь-яких ділянок ДНКвставки, включаючи ділянку послідовності між положеннями 1312 і 6069 SEQ ID NO:1. У деяких варіантах здійснення можна конструювати пари праймерів, які здатні забезпечувати ампліфікацію кодуючої послідовності ДНК-вставки в Arabidopsis thaliana, мутантної по AHAS (наприклад, від положень 2762 аж до 4774 або їх фрагменти) або будь-якої комбінації кодуючої і регуляторної послідовності вставки. Ампліфікована молекула нуклеїнової кислоти (амплікон) може бути будь-якої довжини, яка дозволяє здійснювати детекцію молекули нуклеїнової кислоти події 127. Наприклад, амплікон може складати в довжину приблизно 10, 50, 100, 200, 300, 500, 700, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 нуклеотидів або більше. У деяких варіантах здійснення можна детектувати одну або декілька специфічних ділянок молекули нуклеїнової кислоти події 127. У способах за даним винаходом можна застосовувати будь-який праймер, який забезпечує ампліфікацію і/або детекцію молекули нуклеїнової кислоти події 127. У одному з варіантів здійснення праймери містять молекулу нуклеїнової кислоти події 127 або є комплементарними молекулі нуклеїнової кислоти події 127, такій як, наприклад, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 або більше суміжних нуклеотидів, відповідних або комплементарних молекулі нуклеїнової кислоти з послідовністю SEQ ID NO:1. Наприклад, в деяких варіантах здійснення перший і другий праймери містять молекулу нуклеїнової кислоти з SEQ ID NO:35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 67, 68, 69 і 70, де перший або другий праймер розділяють достатню ідентичність або комплементарність послідовності з молекулою нуклеїнової кислоти, для ампліфікації молекули нуклеїнової кислоти події 127. У додаткових варіантах здійснення перший і другий праймери можуть містити будь-яку одну або будь-яку комбінацію послідовностей, представлених в SEQ ID NO:35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 67, 68, 69 і 70. Праймери можуть бути будь-якої довжини, достатньої для ампліфікації ділянки події 127 сої, включаючи, наприклад, щонайменше 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 15 або 30 або приблизно 7-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-35, 35-40, 40-45 нуклеотидів або більше. Як описано вище, в певних варіантах здійснення придатні пари праймерів будуть включати один праймер, який перекриває точку з'єднання між ДНК-вставкою і 5’- або 3’-фланкуючими послідовностями геномної ДНК. Такі праймери можна конструювати до ділянки поблизу точки з'єднання між 5’-фланкуючою ДНК і ДНК-вставкою (тобто з'єднання між положеннями 1311 і 1312 SEQ ID NO:1), а також до ділянки поблизу точки з'єднання між ДНК-вставкою і 3’фланкуючою ДНК (тобто до з'єднання між положеннями 6069 і 6070 SEQ ID NO:1). Такі праймери можна конструювати для гібридизації з приблизно 10 нуклеотидами, або з фланкуючої області, або з ДНК-вставки, щонайменше з 1 нуклеотидом, що проходить через точку з'єднання в ДНК-вставці або фланкуючій області. Таким чином, праймери можуть включати, наприклад, нуклеотидні послідовності, сконструйовані для гібридизації з нуклеотидами, представленими наступними положеннями в SEQ ID NO:1: 1311-1321, 13021312, 6060-6070 і/або 6069-6079. У інших варіантах здійснення придатні пари праймерів будуть включати один праймер, який перекриває точку з'єднання між 5’-кінцем дуплікованої ділянки кодуючої послідовності csr1-2 ДНК-вставки (в положенні 5694 SEQ ID NO:1) і 3’-кінцем суміжної ділянки ДНК-вставки (тобто в положенні 5693 SEQ ID NO:1). Такі праймери можна конструювати для гібридизації приблизно з 18 UA 107923 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 10 нуклеотидами, або з дуплікованої ділянки, або з суміжної з нею ДНК-вставки, і з щонайменше 1 нуклеотидом, що проходить через точку з'єднання (наприклад, щонайменше 5693-5703 або щонайменше 5684-5694 SEQ ID NO:1). Як обговорювалося в іншому місці цього документа, можна застосовувати будь-який спосіб ПЛР-ампліфікації молекул нуклеїнової кислоти події 127, включаючи, наприклад, ПЛР в реальному часі. Таким чином, в деяких варіантах здійснення надають спосіб детекції наявності молекул нуклеїнової кислоти події 127 в біологічному зразку. Спосіб включає: (a) виділення зразка ДНК з біологічного зразка; (b) надання пари молекул праймерів до ДНК (наприклад, будь-яка комбінація SEQ ID NO:35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 67, 68, 69 і 70, де комбінація забезпечує ампліфікацію ділянки події 127 сої), включаючи, як необмежувальні приклади, i) послідовності SEQ ID NO:35 і SEQ ID NO:36, ii) SEQ ID NO:37 і SEQ ID NO:38, iii) SEQ ID NO:39 і SEO ID NO:40, iv) SEQ ID NO:41 і SEQ ID NO:42, v) SEQ ID NO:43 і SEQ ID NO:44, vi) SEQ ID NO:67 і SEQ ID NO:68 і vii) SEQ ID NO:69 і SEQ ID NO:70; (с) забезпечення умов, необхідних для реакції ампліфікації ДНК; (d) здійснення реакції ампліфікації ДНК, з одержанням, тим самим, молекули ДНК-амплікона; і (е) детекцію молекули ДНК-амплікона, де присутність молекули ДНКамплікона в реакції ампліфікації ДНК вказує на присутність в зразку молекул нуклеїнової кислоти події 127. Для того, щоб молекула нуклеїнової кислоти служила як праймер або зонд, вона повинна бути тільки комплементарною до послідовності, щоб бути здатною сформувати стабільну дволанцюжкову структуру в конкретно застосовуваних концентраціях розчину і солі. У способах гібридизації можна застосовувати всю або частину молекули нуклеїнової кислоти, яка вибірково гібридизується з цільовою молекулою нуклеїнової кислоти події 127. Під "суворими умовами" або "суворими умовами гібридизації" відносно умов, застосовуваних до молекули нуклеїновокислотного зонда, мають на увазі умови, в яких зонд буде гібридизуватися зі своєю цільовою послідовністю в детектовано більшій мірі, ніж з іншими послідовностями (наприклад, щонайменше з 2-кратним перевищенням фону). Відносно ампліфікації цільової молекули нуклеїнової кислоти (наприклад, за допомогою ПЛР), з використанням конкретної пари праймерів для ампліфікації, "суворі умови" являють собою умови, які дозволяють парі праймерів гібридизуватися з цільовою молекулою нуклеїнової кислоти, праймер для якої має відповідну послідовність дикого типу. Суворі умови залежать від послідовності і будуть різними в різних умовах. За допомогою контролю суворості умов гібридизації і/або промивання, можна ідентифікувати цільові послідовності, які є на 100% комплементарними зонду (гомологічний зонд). Альтернативно, суворість умов можна регулювати, щоб забезпечити в послідовності наявність деякої кількості неправильно спарених основ, з тим, щоб детектувати більш низьку міру ідентичності (гетерологічний зонд). Як правило, зонд являє собою менше ніж приблизно 1000 нуклеотидів в довжину або менше ніж 500 нуклеотидів в довжину. Як застосовують в цьому документі, по суті ідентична або комплементарна послідовність являє собою молекулу нуклеїнової кислоти, яка буде специфічно гібридизуватися з комплементарною молекулою нуклеїнової кислоти, з якою вона порівнюється в умовах з високою суворістю. Придатні "суворі умови", які сприяють гібридизації ДНК, наприклад 6 хлорид натрію/цитрат натрію (SSC) при приблизно 45 °C, з подальшим промиванням 2 SSC при 50 °C, відомі фахівцям в даній галузі. Як правило, суворі умови для гібридизації і детекції будуть являти собою ті, в яких концентрація солі складає менше ніж приблизно 1,5 M іонів Na, як правило від приблизно 0,01 до 1,0 M концентрації іонів N (або інших солей), при pH від 7,0 до 8,3, і температура складає щонайменше приблизно 30 °C для коротких зондів (наприклад, від 10 до 50 нуклеотидів) і щонайменше приблизно 60 °C для довгих зондів (наприклад, більших ніж 50 нуклеотидів). "Суворі умови" можуть також досягатися додаванням дестабілізуючих засобів, таких як формамід. Приклади умов "низької суворості" включають гібридизацію з буферним розчином, що містить від 30 до 35% формаміду, 1 M NaCl, 1% SDS (додецилсульфат натрію), при 37 °C, і промивання в 1-2 SSC (20 SSC=3,0 M NaCl/0,3 M трицитрату натрію) при температурі від 50 до 55 °C. Приклади умов середньої суворості включають гібридизацію в 4045% формаміді, 1,0 M NaCl, 1% SDS при 37 °C, і промивання в 0,5-1 SSC при температурі від 55 до 60 °C. Приклади умов з високою суворістю включають гібридизацію в 50% формаміді, 1 M NaCl, 1% SDS при 37 °C і промивання в 0,1 SSC при температурі від 60 до 65 °C. Необов'язково, буфери для промивання можуть містити приблизно від 0,1% до приблизно 1% SDS. Тривалість гібридизації складає, як правило, менше ніж приблизно 24 години, як правило приблизно від 4 до приблизно 12 годин. Тривалість часу промивання буде складати щонайменше період часу, достатній для досягнення рівноваги. У реакціях гібридизації, специфічність є, як правило, функцією промивання після гібридизації, критичні фактори являють собою іонну силу і температуру кінцевого розчину для 19 UA 107923 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 промивання. Для гібридів ДНК-ДНК, Tm можна вивести з рівняння Meinkoth і Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: Tm = 81,5 °C + 16,6 (log M) + 0,41 (% GC) - 0,61 (% форм.) - 500/л; де M являє собою молярність одновалентних катіонів, % GC являє собою процент нуклеотидів гуанозину і цитозину в ДНК, % форм. являє собою процент формаміду в розчині для гібридизації, і L являє собою довжину гібриду в парах основ. T m являє собою температуру (при певній іонній силі і pH), при якій 50% комплементарної цільової послідовності гібридизується з ідеально підібраним зондом. T m зменшують приблизно на 1 °C для кожного 1% неправильно спарених нуклеотидів; таким чином, T m, гібридизація і/або умови промивання можна відрегулювати для гібридизації з послідовністю бажаної ідентичності. Наприклад, якщо необхідно відшукати послідовності з ідентичністю 90%, Tm можна знизити на 10 °C. Як правило, суворі умови вибираються, щоб бути приблизно на 5 °C нижче, ніж температура точки плавлення (Tm) для специфічної послідовності і комплементарної їй при певній іонній силі і pH. Однак при дуже суворих умовах гібридизацію і/або промивання можна проводити при температурі на 1, 2, 3 або 4 °C нижче, ніж температура точки плавлення (T m); при помірно суворих умовах гібридизацію і/або промивання можна проводити при температурі на 6, 7, 8, 9 або 10 °C нижче, ніж температура плавлення (T m); в умовах низької суворості гібридизацію і/або промивання можна проводити при температурі на 11, 12, 13, 14, 15 або 20 °C нижче, ніж температура точки плавлення (T m). Використовуючи рівняння, гібридизацію, склад промивання і бажану Tm, фахівцям буде зрозуміло, що відмінності в суворості умов гібридизації і/або розчинах для промивання по суті описані. Якщо бажана міра невідповідності приводить до T m менше ніж 45 °C (водний розчин) або 32 °C (розчин формаміду), переважно збільшити концентрацію SSC таким чином, щоб можна було використовувати більш високу температуру. Гібридизацію зонда з цільовою молекулою ДНК можна детектувати рядом способів, відомих фахівцям в даній галузі, ці способи можуть включати, але не обмежуються ними, флуоресцентні мітки, радіоактивні мітки, мітки на основі антитіл і хемілюмінесцентні мітки. Як вказують, молекула нуклеїнової кислоти є "комплементарною" іншій молекулі нуклеїнової кислоти, якщо вони демонструють комплементарність. Як застосовують в цьому документі, молекули, як вказують, демонструють "повну комплементарність", якщо кожний нуклеотид однієї молекули нуклеїнової кислоти є комплементарним нуклеотиду іншої молекули нуклеїнової кислоти. Як вказують, дві молекули є "мінімально комплементарними", якщо молекули можуть гібридизуватися одна з одною з достатньою стабільністю, такою, яка дозволяє їм залишатися гібридизованими в загальноприйнятих умовах "низької суворості". Аналогічно, як вказують, молекули є "комплементарними", якщо молекули можуть гібридизуватися одна з одною з достатньою стабільністю, такою, яка дозволяє їм залишатися гібридизованими в загальноприйнятих умовах "високої суворості". У інших варіантах здійснення рослини події 127 можна детектувати або ідентифікувати детекцією експресованого поліпептиду AHAS Arabidopsis thanliana. У детекції поліпептиду AHAS можна використовувати будь-який спосіб. Наприклад, для детекції наявності експресії поліпептиду AHAS можна використовувати антитіла, індуковані проти вбудованого білка AHAS. Будь-який спосіб можна використовувати для детекції молекули нуклеїнової кислоти події 127 або її амплікона, включаючи, як необмежувальні приклади, генетичний аналіз в бітовому представленні. У одному способі, конструюють ДНК-олігонуклеотид, який перекриває як суміжну фланкуючу послідовність ДНК, так і вбудовану послідовність ДНК. У інших варіантах здійснення конструюють олігонуклеотидні ДНК-праймери для забезпечення одержання амплікона, специфічного для події 127. Олігонуклеотид іммобілізують в ямках планшета для мікротитрування. Після здійснення ПЛР ділянки, що представляє інтерес, одноланцюжковий продукт ПЛР можна гібридизувати з іммобілізованим олігонуклеотидом і використовувати як матрицю в реакції подовження одного нуклеотиду, з використанням ДНК-полімерази і мічених ddNTP, специфічних для наступної передбачуваної основи. Представлення даних може бути основане на флуоресценції або способі ELISA. Сигнал показує наявність вставки/фланкуючої послідовності в результаті успішної ампліфікації, гібридизації і реакції подовження одного нуклеотиду. Інший спосіб детекції для застосування в способах за даним винаходом являє собою спосіб піросеквенування. У цьому способі конструюють олігонуклеотид, який перекриває з'єднання суміжної ДНК і ДНК-вставки, або використовують пару олігонуклеотидів, які можуть ампліфікувати ділянку, специфічну для події 127. Олігонуклеотид гібридизують з одноланцюжковим ПЛР-продуктом з ділянки, що представляє інтерес (один праймер до вбудованої послідовності і один до фланкуючої послідовності), і інкубують в присутності ДНКполімерази, АТФ, сульфурилази, люциферази, апірази, аденозин-5’-фосфосульфату і люциферину. dNTP додають індивідуально і включення приводить до утворення світлового 20 UA 107923 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 сигналу, який вимірюють. Світловий сигнал показує наявність трансгенної вставки/фланкуючої послідовності внаслідок успішної ампліфікації, гібридизації і реакції подовження одного або декількох нуклеотидів. Для детекції амплікона за винаходом також можна використовувати поляризацію флуоресценції. Використовуючи цей спосіб, конструюють олігонуклеотид, який перекриває точку з'єднання фланкуючої і вбудованої ДНК, або використовують пару олігонуклеотидів, які дозволяють ампліфікувати специфічну ділянку події 127. Олігонуклеотид гібридизують з ПЛРпродуктом з ділянки, що представляє інтерес (один праймер до вбудованої ДНК і один до фланкуючої послідовності ДНК), і інкубують в присутності ДНК-полімерази і флуоресцентно мічених ddNTP. В результаті реакції подовження одного нуклеотиду відбувається вбудовування ddNTP. Вбудовування можна вимірювати як зміну в поляризації, використовуючи флуориметр. Зміна поляризації показує наявність трансгенної вставки/фланкуючої послідовності внаслідок успішної апліфікації, гібридизації і реакції подовження одного нуклеотиду. Аналіз експресії генів Taqman® (PE Applied Biosystems, Foster City, Calif.) також можна використовувати для детекції і кількісного визначення наявності молекули нуклеїнової кислоти події 127. У короткому викладі, конструюють олігонуклеотидний зонд FRET, який перекриває точку з'єднання фланкуючої послідовності і ДНК-вставки, або використовують пару олігонуклеотидів, які забезпечують ампліфікацію молекули нуклеїнової кислоти події 127. Зонд FRET і праймери ПЛР (один праймер у вбудованій послідовності ДНК і один у фланкуючій геномній послідовності) беруть участь в циклах реакції в присутності термостабільної полімерази і dNTP. Гібридизація зонда FRET приводить до розщеплення і вивільнення флуоресцентної групи, розташованої на відстані від групи гасіння флуоресценції на зонді FRET. Сигнал флуоресценції показує наявність фланкуючої/трансгенної вбудованої послідовності внаслідок успішної ампліфікації і гібридизації. У описаних способах можна також використовувати спосіб Molecular Beacons. У короткому викладі, конструюють олігонуклеотидний зонд FRET, який перекриває з'єднання фланкуючої ДНК і ДНК-вставки, або використовують пару олігонуклеотидів, які можуть забезпечити ампліфікацію специфічної ділянки 127. Унікальна структура зонда FRET приводить до того, що зонд містить вторинну структуру, яка утримує флуоресцентну групу і групу гасіння флуоресценції в безпосередній близькості. Зонд FRET і праймери ПЛР (один праймер до послідовності ДНК-вставки і один до фланкуючої послідовності) беруть участь в циклах реакції в присутності термостабільної полімерази і dNTP. Подальша успішна ПЛР-ампліфікація, гібридизація зонда FRET з цільовою послідовністю приводить в результаті до руйнування вторинної структури зонда і просторового розділення флуоресцентної групи і групи гасіння флуоресценції. У результаті одержують флуоресцентний сигнал. Флуоресцентний сигнал показує наявність фланкуючої/трансгенної послідовності вставки внаслідок успішної ампліфікації і гібридизації. Реакція гібридизації з використанням зонда, специфічного до послідовності, розташованої в межах амплікона, являє собою ще один спосіб, використовуваний для детекції амплікона, одержуваного реакцією ПЛР за даним винаходом. У іншому варіанті здійснення молекулу нуклеїнової кислоти події 127 можна детектувати або ідентифікувати способами детекції поліпептидів, експресованих молекулами нуклеїнової кислоти події 127. Наприклад, продукт експресії гена csr-1AHAS можна детектувати, використовуючи способи, описувані в цьому документі. Такі способи можуть включати застосування зв'язуючих білків, які є здатними зв'язуватися з поліпептидами, експресованими вбудованою молекулою нуклеїнової кислоти події 127. Такі способи включають, як необмежувальні приклади, імунологічні аналізи, такі як ELISA (твердофазний імуноферментний аналіз), аналізи на основі антигенів, імунозабарвлювання, імуногістохімію, аналізи на основі білкових чипів, радіоімунопреципітаційні аналізи, високочутливі мембранні імунохроматографічні аналізи і високочутливі імунохроматографічні аналізи на основі тестсмужок (латеральні проточні тести). Способи, описувані в цьому документі, можна адаптувати для застосування у високопродуктивних способах, наприклад, за допомогою приєднання діагностичних молекул (таких як праймери і/або зонди) на субстрати, для створення пристрою, наприклад чипа або мікроматриць, або багатоямкових планшетів. Пристрої можна надавати в будь-якому придатному форматі, такому як чипи, предметне скло, планшети, мембрани, волокна, гранули, смужки, тест-смужки, мати, решітки, стрижні, сітки, стінки ємностей і т. п. Крім того, субстрати можна зробити з будь-якого доступного матеріалу, такого як скло, кераміка, гелі (наприклад, гідрогелі, мікрогелі, псевдогелі) і полімерні матеріали (наприклад, пластик, силікон, фторполімери). Таким чином, субстрати для застосування в пристроях і способах за даним 21 UA 107923 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 винаходом включають, але не обмежуються ними, чипи на основі діоксиду кремнію, нейлонові мембрани, оптичні волокна, багатоямкові планшети і т. п. Зонди або іншу діагностичну молекулу до події 127 можна приєднувати до субстрату, використовуючи будь-які доступні способи приєднання, такі як ковалентне зв’язування, координаційне зв’язування і нековалентне зв’язування (наприклад, іонне зв’язування, водневе зв’язування, ліпофільна взаємодія). Спосіб на основі біочипів для високопродуктивної детекції, ідентифікації або контролювання експресії можна використовувати для вимірювання мішеней для гібридизації - молекул нуклеїнової кислоти події 127. Цей спосіб на основі "чипа" включає використання мікроматриць з молекулами нуклеїнової кислоти як геноспецифічними мішенями для гібридизації, для кількісного вимірювання експресії відповідних генів. Одноразово можна встановлювати будьякий нуклеотид у великій послідовності. Гібридизацію можна використовувати для ефективного аналізу нуклеотидних послідовностей. Будь-який доступний спосіб на основі мікроматриць можна використовувати в способах за даним винаходом. Наприклад, способом на основі мікроматриць можна порівнювати аналізовані послідовності, за допомогою гібридизації з набором олігонуклеотидів або молекул кДНК, що представляють всі можливі послідовності. У другому способі гібридизують зразок з біочипом олігонуклеотидів або кДНК-зондів. Біочип, що складається з олігонуклеотидів або молекул кДНК, комплементарних послідовностям цільової послідовності події 127, можна використовувати для визначення ідентичності цільової послідовності, вимірювання її кількості і визначення відмінностей між цільовою і контрольною послідовністю. Мікроматриці з молекулами нуклеїнової кислоти можна також піддавати скринінгу білковими молекулами або їх фрагментами для визначення молекул нуклеїнової кислоти, які специфічно зв'язують білкові молекули або їх фрагменти. Інші діагностичні способи на основі мікроматриць для застосування в способах за даним винаходом включають, наприклад, ті, які описані в публікації США № 2007/0298423. Таким чином, молекули нуклеїнової кислоти події 127 можна ідентифікувати або детектувати в зразку, використовуючи будь-який доступний спосіб. Такі способи включають, як необмежувальні приклади, способи розділення в гелі, детекцію на основі блот-гібридизації нуклеїнових кислот (наприклад, гібридизація по Саузерну, Нозерн-гібридизація), якісну, напівкількісну або кількісну ПЛР, імуноаналізи (наприклад, ELISA, аналізи на основі тест-смужок (наприклад, на основі тест-смужок для латерального проточного імуноаналізу), з використанням будь-яких імуноглобулінів, моноклональних антитіл, одноланцюжкових антитіл або фрагментів антитіл із збереженою ділянкою зв’язування) для детекції експресії модифікованого AHASL і детекції на основі аналізів мікроматриці або "мікрочипа". У інших варіантах здійснення способи можуть включати застосування мас-спектрометрії або ядерного магнітного резонансу (ЯМР) для детекції або ідентифікації наявності молекул нуклеїнової кислоти події 127 в біологічному зразку. Пристрої, придатні в таких способах детекції, також надають в різних варіантах здійснення винаходу пристрої, які включають твердофазну підкладку, що має поверхню, і приєднану до неї щонайменше одну діагностичну молекулу до події 127. Це можуть бути пристрої для гібридизаційного аналізу, пристрої для імуноаналізу, пристрої для аналізу на основі зв’язування рецептора і ліганду або будь-які інші відомі в даній галузі. VII. Набори Даний винахід також стосується наборів для детекції рослини події 127 або молекул нуклеїнової кислоти події 127, де набір включає перший і другий нуклеїновокислотні праймери, які є здатними забезпечувати ампліфікацію молекули нуклеїнової кислоти події 127. Одержані в результаті ампліфіковані молекули нуклеїнової кислоти події 127 можна детектувати напряму або використовувати як зонди для гібридизації в реакціях з біологічними зразками, що містять ДНК. Як застосовують в цьому документі, "набір" стосується комплекту реагентів, підібраного з метою здійснення способу варіантів здійснення, більш конкретно для ідентифікації і/або детекції події 127 в біологічних зразках. Набір можна використовувати і компоненти набору специфічно підбирати з метою контролю якості (наприклад, однорідності партій насіння), детекції молекул нуклеїнової кислоти події 127 в рослинному матеріалі або матеріалі, що містить матеріал рослини або одержаний з матеріалу рослини, такого як, але не обмежуючись ними, харчові продукти або корма. У конкретних варіантах здійснення, надають набір для ідентифікації молекул нуклеїнової кислоти події 127 в біологічному зразку. Набір включає перший і другий праймери, де перший і другий праймери здатні забезпечувати ампліфікацію молекули нуклеїнової кислоти події 127. У додаткових варіантах здійснення набір також включає молекулу нуклеїнової кислоти для 22 UA 107923 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 детекції молекули нуклеїнової кислоти події 127. Набір може включати, наприклад, перший праймер і другий праймер, що містять молекулу нуклеїнової кислоти з послідовностями SEQ ID NO:35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 і 44, де перший або другий праймер розділяє достатню гомологію послідовності або комплементарність з молекулою нуклеїнової кислоти, для ампліфікації молекули нуклеїнової кислоти події 127. Наприклад, в специфічних варіантах здійснення, перший праймер або другий праймер включає фрагмент молекули нуклеїнової кислоти з послідовністю SEQ ID NO:35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 67, 68, 69 і 70, де перший або другий праймер розділяє достатню гомологію послідовності або комплементарність з молекулою нуклеїнової кислоти, для ампліфікації молекули події 127. Пара праймерів може включати фрагмент молекули нуклеїнової кислоти, що має послідовність SEQ ID NO:5, і фрагмент молекули нуклеїнової кислоти з послідовністю SEQ ID NO:6, або, альтернативно, пару праймерів можна вибирати з послідовностей i) SEQ ID NO:35 і SEQ ID NO:36, ii) SEQ ID NO:37 і SEQ ID NO:38, iii) SEQ ID NO:39 і SEQ ID NO:40, iv) SEQ ID NO:41 і SEQ ID NO:42, v) SEQ ID NO:43 і SEQ ID NO:44, vi) SEQ ID NO:67 і SEQ ID NO:68, і vii) SEQ ID NO:69 і SEQ ID NO:70. У додаткових варіантах здійснення перший і другий праймери можуть включати тільки одну послідовність або будь-яку комбінацію послідовностей, представлену в SEQ ID NO:35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 67, 68, 69 і 70. Праймери можуть бути будь-якої довжини, достатньої для ампліфікації молекули події 127, де довжина включає, наприклад, щонайменше 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 15 або 30 або приблизно 7-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-35, 35-40, 40-45 нуклеотидів або більше. Додатково представленими є набори для детекції ДНК, які включають щонайменше одну молекулу нуклеїнової кислоти, яка може специфічно детектувати ділянку події 127, де молекула нуклеїнової кислоти включає щонайменше одну молекулу ДНК достатньої довжини з суміжних нуклеотидів, яка гомологічна або комплементарна SEQ ID NO:5 і/або 6. В деяких варіантах здійснення набір для детекції ДНК включає молекулу нуклеїнової кислоти з SEQ ID NO:5 і/або 6 або включає послідовність, яка гібридизується з послідовностями, що специфічно детектують ділянку події 127, такими як ті, які вибрані з групи, що складається з SEQ ID NO:5 і/або 6. VIII. Способи боротьби з бур'янами Даний винахід також стосується способів і композицій для боротьби з бур'янами або небажаними рослинами. Способи, як правило, включають застосування ефективної кількості одного або декількох неселективних гербіцидів на посівній площі або зайнятому культурою полі, що містить одну або декілька рослин сої події 127. Хоч з будь-якими бур’янистими рослинами можна боротися описаними способами, в деяких варіантах здійснення способи можуть включати первинну ідентифікацію бур'янів або небажаних рослин на площі або полі, чутливих до інгібуючого AHAS гербіциду. Надані способи для боротьби з бур'янами на посівній площі, які запобігають розвитку або появі бур'янів або небажаних рослин на посівній площі, де способи забезпечують сільськогосподарську культуру і підвищене збереження сільськогосподарської культури. Термін "контролювання" і його похідні, як, наприклад, "боротьба з бур'янами", стосується одного або декількох інгібуючих ріст, проростання, розмноження і/або поширення бур'янів; і/або знищення, видалення, ураження або інакше зменшення поширеності і/або активності бур'яну і/або небажаної рослини. Способи за винаходом можуть контролювати бур'яни або небажані рослини на посівній площі на будь-яку вимірювану кількість, таку як зменшення кількості бур'янів або небажаних рослин на посівній площі щонайменше на приблизно 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% в порівнянні з площею, яку не обробляли тією ж кількістю і видом гербіциду. Контролювання бур'янів або небажаних рослин можна вимірювати будь-якими відтворюваними способами вимірювання. У одному з варіантів здійснення контролювання бур'янів або небажаних рослин вимірюють, підраховуючи кількість бур’янистих або небажаних рослин, що виростають на площі, обробленій гербіцидом, і порівнюють з кількістю бур’янистих або небажаних рослин, що виростають на необробленій гербіцидом площі такого ж розміру. Даний винахід також стосується способів боротьби з бур'янами або небажаними рослинами за допомогою підрахунку насінин рослини сої події 127 до посіву і/або після попереднього пророщування в присутності інгібуючого AHAS гербіциду. Спосіб може додатково включати посів насіння, наприклад, у придатне середовище для вирощування, таке як ґрунт поля або в середовище для горщикових рослин в теплиці. Способи знаходять конкретне застосування в боротьбі з бур'янами і/або небажаними рослинами в безпосередній близькості від насіння. Під бур’янистими рослинами маються на увазі, в самому широкому розумінні, всі ті рослини, які ростуть в місцях, де їх зростання небажане. Бур’янисті рослини, які можна контролювати способами за даним винаходом, включають, 23 UA 107923 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 наприклад, дводольні і однодольні бур’янисті рослини. Дводольні бур’янисті рослини, які можна контролювати, використовуючи описані способи, включають, але не обмежуються ними, бур'яни виду: Sinapis, Lepidium, Galium, Stellaria, Matricaria, Anthemis, Galinsoga, Chenopodium, Urtica, Senecio, Amaranthus, Portulaca, Xanthium, Convolvulus, Ipomoea, Poligonum, Sesbania, Ambrosia, Cirsium, Carduus, Sonchus, Solanum, Rorippa, Rotala, Lindernia, Lamium, Veronica, Abutilon, Emex, Datura, Viola, Galeopsis, Papaver, Centaurea, Trifolium, Ranunculus і Taraxacum. Однодольні бур’янисті рослини, які можна контролювати, використовуючи описані способи, включають, але не обмежуються ними, бур'яни виду: Echinochloa, Setaria, Panicum, Digitaria, Phleum, Poa, Festuca, Eleusine, Brachiaria, Lolium, Bromus, Avena, Cyperus, Sorghum, Agropyron, Cynodon, Monochoria, Fimbristyslis, Sagittaria, Eleocharis, Scirpus, Paspalum, Ischaemum, Sphenoclea, Dactyloctenium, Agrostis, Alopecurus і Apera. Конкретні бур’янисті рослини, які можна контролювати способами за даним винаходом, включають, але не обмежуються ними, бур'яни важливих сільськогосподарських культур, такі як Ipomoea spp., Commelina spp., Tridax procumbens, Euphorbia spp., Sida spp., Bidens spp., Galinsoga spp., Solanum spp., Xanthium spp., Chenopodium spp., Spermacoce latifolia, Richardia brasiliensis, Sonchus oleraceous, Conyza spp., Amaranthus spp., Acanthospermum spp., Hyptis spp. Portulaca oleracea, Casia obtusifolia, і також види осокових Cyperus spp., а також види трав, що включають Brachiaria spp., Digitaria spp., Panicum spp., Setaria spp., Sorghum halepense, Echnochloa spp., Eleusine indica і Pennisetum spp. З застосуванням неселективних гербіцидів на основі імідазолінону, описані способи є вигідними для контролю бур’янистих рослин, що важко піддаються контролюванню, таких як Commelina spp., Conyza spp., Chamaesise hirta, Spermacoce latifolia, Richardia brasiliensis, Ipomoea spp., Euphorbia heterophylla, Echnochloa spp. і Casia obtusifolia. Крім того, бур’янисті рослини, з якими можна боротися способами за даним винаходом, включають, наприклад, небажані сільськогосподарські культури, які ростуть в непризначених для них місцях. Наприклад, рослина-самосів кукурудзи, присутня на полі, яке переважно містить рослини сої події 127, може вважатися бур’янистою рослиною, якщо зростання рослини кукурудзи небажане на полі з рослинами сої. Небажані рослини, з якими можна боротися способами за даним винаходом, включають ті рослини, якими раніше засівали конкретне поле в попередньому сезоні або висіювали на прилеглій площі, і включають сільськогосподарські культури, що включають сою, кукурудзу, канолу, бавовну, соняшник і т. п. В деяких аспектах, сільськогосподарські культури можуть бути стійкими до гербіцидів, таких як гербіциди гліфосат або глуфосинат, або можуть бути стійкими до інгібуючих AHAS гербіцидів. Як застосовують в цьому документі, "площа для посівів" або "посівна площа" включають будь-яку область, на якій бажають виростити одну або декілька рослин, таких як рослина сої події 127. Такі площі для посівів включають, як необмежувальні приклади, поле, на якому культивують рослину сої події 127 (таке як поле, зайняте культурою, поле для випробувань і т. д.), теплицю, вегетаційну камеру і т. д. Способи включають засівання посівної площі насінням сої події 127 або рослинами сої і в деяких варіантах здійснення застосування на сільськогосподарських культурах, насінні, бур’янистій рослині, небажаній рослині, ґрунті або їх посівній площі ефективної кількості гербіциду, що представляє інтерес. Гербіцид можна застосовувати в будь-який період культивування рослин сої події 127. Гербіцид можна застосовувати до або після того, як сільськогосподарська культура посіяна на культивованій площі. Такі способи застосування гербіцидів можуть включати застосування інгібуючого AHAS гербіциду або комбінації гербіцидів. Термін "ефективна кількість" означає кількість гербіциду, достатню для контролю, з будьякою величиною, що піддається вимірюванню, бур’янистих або небажаних рослин на посівній площі. Ефективна кількість інгібуючого AHAS гербіциду може бути представлена в діапазоні приблизно від 50 г д.р./га до приблизно 500 г д.р./га, приблизно від 50 г д.р./га і до приблизно 400 г д.р./га або приблизно від 50 г д.р./га до приблизно 300 г д.р./га. Ефективна кількість інгібуючого AHAS гербіциду може також становити приблизно 70 г д.р./га, 140 г д.р./га або 280 г д.р./га. На ефективні рівні застосування інгібуючого AHAS гербіциду в способах за даним винаходом може впливати багато факторів, включаючи навколишнє середовище, і ефективні рівні необхідно визначати в реальних умовах застосування. Контроль над бур’янистими або небажаними рослинами можна здійснювати за допомогою одного або декількох застосувань інгібуючого AHAS гербіциду на рівні, схожому або більшому, ніж використовувана кількість для такого контролю на площах, на яких не виростає соя з подією 127. Такі рівні застосувань включають ті, які складають або еквівалентні 70 г д.р./га, 140 або 280 г д.р./га. Типовий комерційний рівень застосування інгібуючого AHAS гербіциду становить приблизно 70 г д.р./га, також позначуваний як IX рівень застосування. 24 UA 107923 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У деяких варіантах здійснення ефективна кількість може являти собою кількість інгібуючого AHAS гербіциду, більшу ніж кількість, до якої бур’янисті або небажані рослини, що підлягають контролюванню, є стійкими. Наприклад, у варіантах здійснення, в яких бур’янисті або небажані рослини є стійкими до застосування 70 г д.р./га, але є чутливими до застосування 140 г д.р./га, ефективна кількість гербіциду становить 140 г д.р./га. Таким чином, даний винахід стосується способів боротьби з ростом бур'янів або небажаних рослин на посівній площі, які включають застосування ефективної кількості неселективного гербіциду на посівній площі з однією або декількома рослинами сої події 127. Також представлені способи контролювання стійких до гліфосату бур'янів або рослин на посівній площі, де способи включають застосування ефективної кількості інгібуючого AHAS гербіциду на посівній площі з однією або декількома рослинами сої події 127. Також представлений спосіб контролювання на посівній площі стійких до інгібуючого AHAS гербіциду бур'янів або рослин, де спосіб включає застосування ефективної кількості інгібуючого AHAS гербіциду на посівній площі з однією або декількома рослинами сої події 127. У таких варіантах здійснення ефективну кількість інгібуючого AHAS гербіциду застосовують в кількості, достатній для контролю бур'янів, оскільки гербіцид по суті не надає ефекту на рослину сої події 127. У деяких варіантах здійснення бур’янисті рослини можна контролювати до посадки на полі насіння сої події 127. Наприклад, ефективна кількість неселективних гербіцидів, таких як інгібуючі AHAS гербіциди, можна застосовувати на полі до посадки, для зменшення або видалення бур’янистих рослин на полі перед посівом насіння. До посадки таке застосування можна здійснювати в будь-який момент часу, ефективний для боротьби з бур’янистими рослинами, наприклад на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 або більше добу до посадки. Крім того, в таких способах можна застосовувати будь-яку комбінацію сільськогосподарських композицій. У інших варіантах здійснення бур’янисті рослини можна контролювати після посадки насіння сої події 127. Наприклад, в кількості, ефективній для контролювання бур’янистих рослин, інгібуючі AHAS гербіциди можна застосовувати до зростаючих рослин сої, частин рослин, середовища для вирощування (такого як ґрунт), що оточує зростаючу рослину і сусіднє з нею, або до площі, тобто локального оточення, на якому виростає рослина сої події 127 або рослини. Зростаюча рослина сої події 127 може бути на будь-якій стадії розвитку. У деяких таких варіантах здійснення, в момент застосування гербіциду зростаюча соя щонайменше являє собою рослину на стадії першого справжнього листа. Крім того, будь-яку комбінацію сільськогосподарських композицій можна застосовувати в таких способах. Якщо в способах використовують комбінації сільськогосподарських композицій, то такі комбінації можуть включати комбінації гербіцидів, фунгіцидів, бактерицидних засобів, інсектицидів і т. п. Наприклад, інгібуючий AHAS гербіцид можна комбінувати з іншими гербіцидами, такими як гербіциди, інгібуючі 5-енолпірувілшикімат-3-фосфатсинтазу (EPSPS), гербіциди, інгібуючі глутамінсинтазу (GS), гербіциди, інгібуючі протопорфіриноген[IX]оксидазу (PPO), гербіциди з ауксиновою активністю або їх комбінації. IX. Способи підвищення врожайності Також представлені способи підвищення урожаю рослини або рослин сої, де способи включають застосування ефективної кількості інгібуючого AHAS гербіциду на посівній площі з однією або декількома рослинами сої події 127 і збирання насіння рослин сої. У деяких варіантах здійснення підвищення урожаю рослини або рослин сої є результатом зменшення кількості бур’янистих рослин, що виростають на локальній площі з рослиною або рослинами сої, які, як правило, конкурують з рослиною або рослинами сої. Використовуючи такі способи, урожай сої на полі можна збільшити, в порівнянні з аналогічною площею, що не має рослин сої події 127. Урожай соєвих рослин можна збільшувати на будь-яку кількість, включаючи, як необмежувальні приклади, на 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 20%, 25% або більше, в порівнянні з урожаєм, одержаним з аналогічної площі, що не має рослин сої події 127, на якій застосовують інгібуючий AHAS гербіцид. X. Хімічні композиції для сільського господарства Даний винахід також стосується сільськогосподарських композицій для застосування до описаних рослин сої події 127. Такі композиції можуть включати гербіциди, фунгіцидні засоби, бактерицидні засоби, добрива і т. п. В одному з варіантів здійснення сільськогосподарські композиції являють собою гербіцидні композиції, що містять один або декілька гербіцидів або комбінації одного або декількох гербіцидів з іншою сільськогосподарською композицією, такою як фунгіцид, бактерициди, добриво і т. п. 25 UA 107923 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Будь-який гербіцид можна застосовувати до сільськогосподарської культури сої події 127, частини сільськогосподарської культури або посівної площі, що містить рослину сої події 127. Класифікація гербіцидів (тобто групування гербіцидів на класи і підкласи) є добре відомою в даній галузі і включає класифікації HRAC (Herbicide Resistance Action Committee) і WSSA (the Weed Science Society of America). Класифікація HRAC є всесвітньо доступною, наприклад, скорочена версія класифікації HRAC (з примітками відносно відповідної групи WSSA) представлена на веб-сайті hracglobal.com/Publications/Classificationof HerbicideModeofAction/tabid/222/Default.aspx. У деяких варіантах здійснення даний винахід стосується способів, які включають використання щонайменше одного інгібуючого AHAS гербіциду, вибраного з групи, що складається з гербіцидів на основі імідазолінону, гербіцидів на основі сульфонілкарбаміду, гербіцидів на основі триазолопіримідину, гербіцидів на основі піримідинілоксибензоату, гербіцидів на основі сульфоніламінокарбонілтриазолінону і їх суміші. У цих способах, інгібуючий AHAS гербіцид можна застосовувати будь-яким відомим в даній галузі способом, включаючи, як неообмежувальні приклади, обробку насіння, ґрунту і некореневу обробку. У деяких варіантах здійснення інгібуючий AHAS гербіцид можна комбінувати з однією або декількома додатковими сільськогосподарськими композиціями, такими як додаткові гербіциди, фунгіциди, бактерициди, противірусні композиції або їх комбінації. Додаткові гербіциди для використання в комбінації включають будь-який гербіцид, включаючи сульфамідні гербіциди, органофосфатні гербіциди і гербіциди на основі бензотіадіазинону. Сульфамідні гербіциди включають, як необмежувальні приклади, сафлуфенацил. Органофосфатні гербіциди включають, як необмежувальні приклади, гліфосат і глуфосинат. Гербіциди на основі бензотіадіазинону включають, як необмежувальні приклади, бентазон. Фунгіциди для застосування в таких комбінаціях включають, як необмежувальні приклади, піраклостробін. Обробку комбінаціями композицій інгібуючого AHAS гербіциду і/або однією або декількома композиціями інгібуючого AHAS гербіциду і однією або декількома додатковими сільськогосподарськими композиціями можна здійснювати за допомогою застосування суміші таких композицій, одночасного застосування таких композицій, послідовного застосування таких композицій або будь-якої їх комбінації. У деяких варіантах здійснення композиції інгібуючого AHAS гербіциду включають щонайменше один А) інгібуючий AHAS гербіцид і щонайменше одну додаткову активну сполуку, вибрану з В) гербіцидів класів від b1) до b15): b1) інгібітори біосинтезу ліпідів; b2) інгібітори ацетолактатсинтази (AHAS інгібітори); b3) інгібітори фотосинтезу; b4) інгібітори протопорфіриноген[IX]оксидази; b5) відбілювальні гербіциди; b6) інгібітори енолпірувілшикімат-3-фосфатсинтази (EPSP інгібітори); b7) інгібітори глутамінсинтази; b8) інгібітори 7,8-дигідроптероатсинтази (DHP інгібітори); b9) інгібітори мітозу; b10) інгібітори синтезу довголанцюжкових жирних кислот (інгібітори VLCFA); b11) інгібітори біосинтезу целюлози; b12) відокремлювальні гербіциди; b13) ауксинові гербіциди; b14) інгібітори транспорту ауксину; b15) інші гербіциди, вибрані з групи, що складається з бензоїлпропу, флампропу, флампропу-М, бромобутиду, хлорфлуренолу, цинметиліну, метилдимурону, етобензаніду, фосаміну, метаму, пірибутикарбу, оксазикломефону, дазомету, триазифламу і метилброміду, і сільськогосподарсько прийнятні солі активної сполуки В і сільськогосподарсько прийнятні похідні активних сполук В, за умови, що вони мають карбоксильну групу. У інших випадках, таку комбінацію щонайменше одного А) інгібуючого AHAS гербіциду і щонайменше одного гербіциду В можна використовувати в комбінації із засобом захисту С (такі засоби захисту також можна використовувати в комбінації з щонайменше одним інгібуючим AHAS гербіцидом). Засоби захисту С можна вибрати з: беноксакору, клоквінтоцету, ціометринілу, дихлорміду, дициклонону, діетолату, фенхлоразолу, фенклориму, флуразолу, флуксофеніму, фурилазолу, ізоксадифену, мефенпіру, мефенату, нафталевого ангідриду, 2,2,5триметил-1-3-(дихлорацетил)-1,3-оксазолідину (R29148), 4-(дихлорацетил)-1-окса-4азаспіро[4.5]декану (AD-67, MON 4640) і оксабетринілу, сільськогосподарсько прийнятних солей активних сполук С і сільськогосподарсько прийнятних похідних активних сполук С, за умови, що 26 UA 107923 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 вони мають карбоксильну групу. Приклади гербіцидів В, які можна використовувати в комбінації з інгібуючими AHAS сполуками, являють собою: b1) з групи інгібіторів біосинтезу ліпідів: хлоразифоп, клодинафоп, клофоп, цигалофоп, диклофоп, феноксапроп, феноксапроп-П, фентіапроп, флуазифоп, флуазифоп-П, галоксифоп, галоксифоп-П, ізоксапірифоп, метаміфоп, пропаквізафоп, хізалофоп, хізалофоп-П, трифоп, алоксидим, бутроксидим, клетодим, клопроксидим, циклоксидим, профоксидим, сетоксидим, тепралоксидим, тралкоксидим, бутилат, циклоат, діалат, димепіперат, ЕРТС, еспрокарб, етіолат, ізополінат, метіобенкарб, молінат, орбенкарб, пебулат, просульфокарб, сульфалат, тіобенкарб, тіокарбазил, триалат, вернолат, бенфуресат, етофумесат і бенсулід; b2) з групи інгібіторів AHAS: амідосульфурон, азимсульфурон, бенсульфурон, хлоримурон, хлорсульфурон, циносульфурон, циклосульфамурон, етаметсульфурон, етоксисульфурон, флазасульфурон, флупірсульфурон, форамсульфурон, галосульфурон, імазосульфурон, йодосульфурон, мезосульфурон, метсульфурон, нікосульфурон, оксасульфурон, примісульфурон, просульфурон, піразосульфурон, римсульфурон, сульфометурон, сульфосульфурон, тифенсульфурон, триасульфурон, трибенурон, трифлоксисульфурон, трифлусульфурон, тритосульфурон, імазаметабенз, імазамокс, імазапік, імазапір, імазаквін, імазетапір, клорансулам, диклосулам, флорасулам, флуметсулам, метосулам, пеноксулам, біспірибак, піримінобак, пропоксикарбазон, флукарбазон, пірибензоксим, пірифталід і піритіобак; b3) з групи інгібіторів фотосинтезу: атратон, атразин, аметрин, азипротрин, ціаназин, ціанатрин, хлоразин, ципразин, десметрин, диметаметрин, дипропетрин, егліназин, іпазин, мезопразин, метометон, метопротрин, проціазин, прогліназин, прометон, прометрин, пропазин, себутилазин, секбуметон, симазин, симетон, симетрин, тербуметон, тербутилазин, тербутрин, триетазин, аметридіон, амібузин, гексазинон, ізометіозин, метамітрон, метрибузин, бромацил, ізоцил, ленацил, тербацил, бромпіразон, хлоридазон, димідазон, десмедифам, фенісофам, фенмедифам, фенмедифам-етил, бензтіазурон, бутіурон, етидимурон, ізоурон, метабензтіазурон, моноізоурон, тебутіурон, тіазафлурон, анізурон, бутурон, хлорбромурон, хлоретурон, хлоротолурон, хлороксурон, дифеноксурон, димефурон, діурон, фенурон, флуометурон, флуотіурон, ізопротурон, лінурон, метіурон, метобензурон, метобромурон, метоксурон, монолінурон, монурон, небурон, парафлурон, фенобензурон, сидурон, тетрафлурон, тидіазурон, циперкват, діетамкват, дифензокват, дикват, морфамкват, паракват, бромобоніл, бромоксиніл, хлороксиніл, йодобоніл, іоксиніл, амікарбазон, бромофеноксим, флумезин, метазол, бентазон, пропаніл, пентанохлор, піридат і піридафол; b4) з групи інгібіторів протопорфіриноген[IX]оксидази: ацифлуорфен, біфенокс, хлометоксифен, хлорнітрофен, етоксифен, флуородифен, флуороглікофен, флуоронітрофен, фомесафен, фурилоксифен, галосафен, лактофен, нітрофен, нітрофторфен, оксифлуорфен, флуазолат, пірафлуфен, цинідон-етил, флуміклорак, флуміоксазин, флуміпропін, флутіацет, тидіазимін, оксадіазон, оксадіаргіл, азафенідин, карфентразон, сульфентразон, пентоксазон, бензфендизон, бутафенацил, піраклоніл, профлуазол, флуфенпір, флупропацил, ніпіраклофен і етніпромід; b5) з групи відбілювальних гербіцидів: метфлуразон, норфлуразон, флуфенікан, дифлуфенікан, піколінафен, бефлубутамід, флуридон, флурохлоридон, флуртамон, мезотріон, сулкотріон, ізоксахлортол, ізоксафлутол, бензофенап, піразолінат, піразоксифен, бензобіциклон, амітрол, кломазон, аклоніфен, 4-(3-трифторметилфенокси)-2-(4трифторметилфеніл)піримідин і також 3-гетероциклілзаміщені похідні бензоїлу формули I: , (І) 50 8 13 8 10 в якій змінні від R до R такі, як визначено нижче: R , R являють собою водень, галоген, C1-C6-алкіл, C1-C6-галогеналкіл, C1-C6-алкокси, C1-C6-галоалкокси, C1-C6-алкілтіо, C1-C6 27 UA 107923 C2 9 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 алкілсульфініл або C1-C6-алкілсульфоніл; R являє собою гетероциклічний радикал, вибраний з групи, що складається з: тіазол-2-ілу, тіазол-4-ілу, тіазол-5-ілу, ізоксазол-3-ілу, ізоксазол-4-ілу, ізоксазол-5-ілу, 4,5-дигідроізоксазол-3-ілу, 4,5-дигідроізоксазол-4-ілу і 4,5-дигідроізоксазол-5-ілу, де дев'ять згаданих радикалів можуть бути незаміщеними або моно- або полізаміщеними, наприклад моно-, ди-, три- або тетразаміщеними, за допомогою галогену, С1-C4-алкілу, С1-C411 алкокси, С1-C4-галогеналкілу, С1-C4-галоалкокси або С1-C4-алкілтіо; R являє собою водень, 12 13 галоген або C1-C6-алкіл; R являє собою C1-C6-алкіл; R являє собою водень або C1-C6-алкіл; b6) з групи інгібіторів EPSP синтази: гліфосат; b7) з групи інгібіторів глутамінсинтази: глуфозинат і біланафос; b8) з групи інгібіторів DHP синтази: асулам; b9) з групи інгібіторів мітозу: бенфлуралін, бутралін, динітрамін, еталфлуралін, флухлоралін, ізопропалін, металпропалін, нітралін, оризалін, пендиметалін, продіамін, профлуралін, трифлуралін, аміпрофосметил, бутаміфос, дитіопір, триазопір, пропізамід, тебутам, хлортал, карбетамід, хлорбуфам, хлорпрофам і профам; b10) з групи інгібіторів VLCFA: ацетохлор, алахлор, бутахлор, бутенахлор, делахлор, діетатил, диметахлор, диметенамід, диметенамід-П, метазахлор, метолахлор, С-метолахлор, претилахлор, пропахлор, пропізохлор, принахлор, тербухлор, тенілхлор, ксилахлор, алідохлор, CDEA, епроназ, дифенамід, напропамід, напроанілід, петоксамід, флуфенацет, мефенацет, фентразамід, анілофос, піперофос, кафенстрол, інданофан і тридифан; b11) з групи інгібіторів біосинтезу целюлози: дихлобеніл, хлортіамід, ізоксабен і флупоксам; b12) з групи відокремлювальних гербіцидів: динофенат, динопроп, диносам, диносеб, динотерб, DNOC, етинофен і мединотерб; b13) з групи ауксинових гербіцидів: кломепроп, 2,4-D, 2,4,5-Т, МСРА, МСРА тіоетил, дихлорпроп, дихлорпроп-П, мекопроп, мекопроп-П, 2,4-DB, MCPB, хлорамбен, дикамба, 2,3,6ТВА, трикамба, квінклорак, квінмерак, клопіралід, флуроксипір, піклорам, триклопір і беназолін; b14) з групи інгібіторів транспорту ауксинів: напталам, дифлуфензопір; b15) бензоїлпроп, флампроп, флампроп-М, бромобутид, хлорфлуренол, цинметилін, метилдимрон, етобензанід, фосамін, метам, пірибутикарб, оксазикломефон, дазомет, триазифлам і метилбромід. Активні сполуки В груп b1)-b15) і активні сполуки С є відомими гербіцидами і засобами захисту, див., наприклад, The Compendium of Pesticide Common Names (доступний повсюдно в мережі Інтернет на сайті hclrss.demon.co.uk/index.html); Farm Chemicals Handbook 2000 Vol. 86, Meister Publishing Company, 2000; Hock В., Fedtke C., Schmidt R. R., Herbizide, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1995; Ahrens W. H., Herbicide Handbook, 7th Edition, Weed Science Society of America, 1994; і Hatzios K. K., Herbicide Handbook, Supplement to 7th Edition, Weed Science Society of America, 1998. 2,2,5-Триметил-3-(дихлорацетил)-1,3-оксазолідин [CAS № 52836-31-4] також відомий під назвою R-29148. 4-(Дихлорацетил)-1-окса-4-азаспіро[4,5]декан [CAS № 71526-07-03] також відомий під назвою AD-67 і MON 4660. Відбілювальні гербіциди формули II розкриті в WO 96/26202, WO 97/41116, WO 97/41117 і WO 97/41118. Як активну сполуку С, композиції можуть включати щонайменше одну із сполук, перерахованих нижче: беноксакор, клоквінтоцет, дихлормід, фенхлоразол, фенклорим, флуксофенім, фурилазол, ізоксадифен, мефенпір, 2,2,5-триметил-3-(дихлорацетил)-1,3оксазолідин, 4-(дихлорацетил)-1-окса-4-азаспіро[4.5]декан і оксабетриніл і/або їх сільськогосподарсько прийнятна сіль і/або, у випадку сполук, що мають групу COOH, сільськогосподарсько прийнятне похідне. Композиції, які містять комбінації активних інгредієнтів, можуть бути бінарними і тернарними композиціями, які включають щонайменше одну інгібуючу AHAS сполуку як активну сполуку А і щонайменше один гербіцид, вибраний з класів b1)-b15), і, якщо необхідно, один або декілька зберігаючих засобів С. У бінарних композиціях, які включають щонайменше одну інгібуючу AHAS сполуку як компонент А і щонайменше один гербіцид В, масові відношення активних сполук А:В можуть знаходитися в діапазоні від 1:500 до 10:1, в діапазоні від 1:100 до 10:1, в діапазоні від 1:50 до 10:1 або в діапазоні від 1:25 до 5:1. У бінарних композиціях, які містять щонайменше одну інгібуючу AHAS сполуку і щонайменше один зберігаючий засіб С, масові відношення активних сполук А:С представлені, як правило, в діапазоні від 1:100 до 10:1, від 1:50 до 10:1 або в діапазоні від 1:25 до 5:1. У тернарних композиціях, які включають інгібуючу AHAS сполуку як компонент А, щонайменше один гербіцид В і щонайменше один зберігаючий засіб С, відносні масові відношення компонентів А:В:С можуть бути представлені в діапазоні від 10:1:1 до 1:500:10, від 10:1:1 до 1:100:10, від 10:1:1 до 1:50:1 або від 5:1:1 до 1:25:5. 28
ДивитисяДодаткова інформація
Назва патенту англійськоюSoybean event 127 and methods related thereto
Автори російськоюCarlson, Dale, Aragao, Francisco Jose, Lima, Arias, Carlos, Alberto, Arrabal, Louzano, Luiz, Luzzi, Bruce, M., Malefyt, Tim, Filho, Elibio Leopoldo, Rech, Tan, Siyuan, Ulbrich, Adolfo, Yotsumoto, Tadashi, Linemann, Ute
МПК / Мітки
МПК: C12Q 1/68, C12N 15/82, A01H 5/10
Мітки: стійка, трансгенна, сої, гербіцидів, рослина, інгібуючих
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/105-107923-transgenna-roslina-so-stijjka-do-ingibuyuchikh-ahas-gerbicidiv.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Трансгенна рослина сої, стійка до інгібуючих ahas гербіцидів</a>
Попередній патент: Пігментні гранули
Наступний патент: Зернозбиральний комбайн
Випадковий патент: Спосіб та пристрій для спрямованого руйнування визначеної особливостями ведення гірничих робіт ділянки гірського масиву