Спосіб виділення гемопоетичних прогеніторних/стовбурових клітин

Реферат: Спосіб виділення гемопоетичних прогеніторних/стовбурових клітин, що включає почергове проминання та механічне подрібнення тканини зрілої плаценти, кріоконсервування тканини, тестування на наявність патогенних агентів, розмороження тканини та виділення клітин шляхом ферментативної обробки. При цьому тестують кров донора плаценти на наявність антитіл проти HIV-1/2, РНК HIV-1/2, антитіл проти HCV, РНК HCV, антитіл проти HBcor, HBsAg, та антитіл проти Treponema pallidum, попередньо з амніотичної оболонки фето-плацентарного комплексу проводять відбір проб для дослідження на наявність ДНК Chlamidium trachomatis, Mycoplasma genitalis, Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum, фрагмент тканини плаценти після видалення амніотичної оболонки інкубують у стерильному розчині Хенкса з антибіотиками та антимікотиком, проводять почергово механічне подрібнення тканини та промивання у розчині Хенкса з додаванням антибіотиків до досягання розмірів фрагментів в межах 1-20×120×1-20 мм та знебарвлення розчину для проминання, фрагментовану тканину переносять у більші ємності та додають розчин Хенкса, подрібнену тканину плаценти відбирають на дослідження методом ПЛР ДНК HSV-1/2, до тканини у розчині Хенкса повільно додають 1020 % розчин диметилсульфоксиду (ДМСО), що приготовлений на розчині Хенкса та містить людський альбумін, до кінцевої концентрації ДМСО 5-10 % переносять у кріоампули, здійснюють мікробіологічний посів, проводять заморожування, кріоконсервовані зразки зберігають у рідкому азоті при температурі 196 °C, фрагменти кріоконсервованої тканини зрілої плаценти розморожують на водяній бані +38-40 °C, виводять ДМСО із тканини шляхом повільного додавання розчину Хенкса, що містить людський альбумін, виділяють клітини шляхом швидкої ферментативної обробки, розводять отриману суспензію клітин буферним ++ розчином, що містить Са , та людську сироватку (або інші інгібітори колагенази), суспензію клітин відділяють від залишків тканини шляхом фільтрування крізь фільтр із розміром пор 70 мкм та центрифугують при 300 g протягом 5 хв. осад клітин ресуспендують у 0,9 % NaCl. UA 103053 U (12) UA 103053 U UA 103053 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі клітинної біології, зокрема до виділення гемопоетичних прогеніторних/стовбурових клітин з тканин людини, і може знайти застосування в медицині для лікування широкого кола захворювань. Нині в сучасній біомедицині формується новий розділ - клітинна терапія, яка дозволяє за допомогою трансплантації клітин долати недостатню функціональну активність тканин і регенерувати пошкоджені органи. Функцію оновлення і відновлення тканин in vivo виконують стовбурові клітини, які є пулом запасних недиференційованих попередників клітин різних типів. У зв'язку з цим застосування стовбурових клітин є найбільш перспективним напрямом клітинної терапії, і найбільшу актуальність мають роботи по виділенню стовбурових клітин з тканин людини. Відомо значна кількість методів отримання різних видів стовбурових клітин з тканин людини, зокрема з фетальної тканини, кісткового мозку, тимусу, дерми, жирової тканини, нервової тканини, пуповинної крові, мобілізованої периферичної крові, плаценти та інших джерел. Значною проблемою гематології донині залишається дефіцит донорів гемопоетичних прогеніторних/стовбурових клітин для трансплантації при онкогематологічних захворюваннях і вроджених порушеннях кровотворення. Хоча трансплантація HLA-ідентичних (human leukocyte antigen) гемопоетичних прогеніторних/стовбурових клітин кісткового мозку широко використовується для відновлення гемопоезу, їх нестача все ще обмежує широке впровадження клітинних технологій для лікування гематологічних захворювань. Також використовуються гемопоетичні прогеніторні/стовбурові клітини, мобілізовані в периферичну кров із кісткового мозку після внутрішньовенного введення гранулоцитарного колонієстимулюючого фактора. Однак дуже критичним є те, що термін від початку пошуку зразку гемопоетичних прогеніторних/стовбурових клітин кісткового мозку або "мобілізованої" периферичної крові до моменту проведення трансплантації складає від 3 до 6 місяців, а процедура отримання трансплантату має ускладнення для донорів. Пуповинна кров сьогодні широко застосовується при таких патологіях. Однак недоліками її використання є недостатня кількість зібраних клітин, більш тривалий час відновлення нормального рівня нейтрофілів, тромбоцитів та лімфоцитів у реципієнтів після трансплантації, та менша вірогідність приживлення трансплантата. Фетальна печінка людини є багатим джерелом гемопоетичних прогеніторних/стовбурових клітин. Однак її недоліками є відносно незначний об'єм клітин, отримання яких не є простою процедурою, до того застосування клітин фетальної печінки є проблемним із етичних міркувань. Прерогативою отримання гемопоетичних стовбурових/прогеніторних клітин з плаценти є те, що гемопоетичні стовбурові/прогеніторні клітини плаценти мають ще одну перевагу порівняно з гемопоетичними стовбуровими клітинами, отриманими з інших джерел. За нашими даними, які показали, що плацентарні гемопоетичні стовбурові/прогеніторні клітини in situ є більш комітовані в мієлоїдному та еритроїдному напрямках, ніж гемопоетичні стовбурові/прогеніторні клітини пуповинної крові, варто очікувати, що використання таких клітин зрілої плаценти як додаткових до гемопоетичних стовбурових/прогеніторних клітин пуповинної крові дозволить усунути недоліки трансплантації клітин, пов'язані із малим їх вмістом та незрілістю прогеніторів. Також, варто звернути увагу на те, що використання для трансплантації плацентарних гемопоетичних стовбурових/прогеніторних клітин, які локалізовані безпосередньо у власній ніші разом із циркулюючими гемопоетичними стовбуровими/прогеніторними клітинами пуповинної крові може мати велике значення в онкогематології. Відомий спосіб відділення мезенхімальних стовбурових клітин від плаценти (CN102676451, МПК: C12N5/0735, C12N5/0775, G06F19/28, дата публікації 2012-09-19), в якому плацентарну тканину промивають, використовуючи фосфорнокислий буферний розчин, щоб видалити залишкову кров з плаценти; відбирають проби для тестування на наявність патогенних агентів, розрізають плаценту на фрагменти, додаючи розчин, що містить фермент, що руйнує тканину, і витримують в розчині при 37 °C; потім фільтрують фрагменти тканини плаценти, використовуючи мідну сітку, і розмелюючи, якщо необхідно, щоб забезпечити фільтрацію; центрифугують зібраний фільтрат, виділяють мононуклеарні клітини, виділяють отримані клітини із використанням поживного середовища для мезенхімальних стовбурових клітин, і застосовують додаткову інкубацію вказаних клітин в середовищі для диференціювання в інкубаторі при 37 °C. Недоліком такого способу є те, що всі дії не забезпечують довгострокове зберігання плаценти, що є необхідним для належного скринінгу матеріалу, оскільки тестування на наявність бактеріальної та грибкової флори триває близько 10 діб. Другим недоліком є неможливість створити банк тканини, який буде доступним для використання в будь-який момент часу. За таким способом передбачено отримання мезенхімальних стовбурових клітин, 1 UA 103053 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 але не гемопоетичних стовбурових/прогеніторних клітин, що застосовуються для лікування інших патологій. Відомий спосіб виділення мезенхімальних мультипотентних стромальних клітин (UА67620, МПК: C12N 5/0735, C12N 9/48, опубліковано 27.02.2012, бюл. № 4/2012), що включає промивання тканини плаценти, механічне подрібнення, виділення клітини шляхом ферментації та висівання в ростове середовище, що містить розчин фетальної бичачої сироватки, та розчин антибіотиків, культивування при 37 °C в атмосфері 5 % СО2, здійснення пересіву при досягненні культурою граничного значення обсягу моношару, обробку клітин для пересіву розчином трипсину-ЕДТА при 37 °C, центрифугування суспензії, видалення супернатанту, суспендування осаду клітин в ростовому середовищі, за яким попередньо гладкий хоріон плацентарної тканини промивають розчином Хенкса з додаванням 50 од/мл амфотерицину, 100 од/мл пеніциліну, 50 мкг/мл стрептоміцину, тканину переносять в пробірки 50 мл, з додаванням 2-3 мл розчину Хенкса та подрібнюють на фрагменти не більше 3 мм, фрагментовану тканину переносять в кріоампули та додають диметилсульфоксиду (ДМСО) до кінцевої концентрації 0,7-1,4 мол., проводять заморожування, кріоконсервовані зразки зберігають у рідкому азоті при температурі 196 °C, фрагмент кріоконсервованого гладкого хоріона зрілої плаценти розморожують на водяній бані 38-40 °C, виводять ДМСО з тканини шляхом повільного додавання розчину Хенкса, тканину промивають розчином Хенкса та подрібнюють, виділяють клітини шляхом ферментації в розчині колагенази І та диспази та висівають в ростове середовище, що містить 15 % фетальної бичачої сироватки, 2 мМ глютаміну, 5 мМ HEPES, 100 од/мл пеніциліну, 50 мкг/мл стрептоміцину, культивування проводять при 37 °C в 5 % СО2 зі зміною середовища 2 рази на тиждень, пересів здійснюють при досягненні культурою 80 %-90 % моношару в співвідношенні 1:3, клітини для пересіву обробляють 0,05 %-им розчином трипсину-ЕДТА до повного відкріплення протягом 3-5 хв при 37 °C, суспензію центрифугують 5 хв. при 300 g, супернатант видаляють, суспендують осад клітин в ростовому середовищі та переносять у флакони. Проблемою цього способу є те, що за способом використовують ростове середовище, що містить розчин фетальної бичачої сироватки, яке має тваринне походження і негативно впливає на клітини. За таким способом не заявлено отримання гемопоетичних стовбурових/прогеніторних клітин, що застосовуються для лікування інших патологій. Відомий спосіб отримання суспензії клітин плаценти (UA31175, МПК: A01N 1/02, опубліковано 25.03.2008, бюл. № 6/2008), що включає поєднування її з кріоконсервувальним розчином "Пропандюсахароль", еквілібрацію з цим розчином і заморожування до температури рідкого азоту, при цьому поєднування суспензії з кріоконсервувальним розчином здійснюють шляхом поступового її нашаровування на кріоконсервувальний розчин, еквілібрацію з кріоконсервувальним розчином суміщають з програмним охолодженням до 0 °C, а заморожування проводять зі швидкістю 1 град./хв. до температури -40 °C з наступним зануренням у рідкий азот. Недоліком цього методу є те, що таким способом з плаценти отримують суспензію клітин до етапу кріоконсервування, що ускладнює технологію та збільшує її вартість на відміну від способу зберігання самої тканини плаценти та виділення із неї клітин лише за необхідності та після проведення скринінгу тканини на патогенні агенти. При здійсненні такого способу не відомо збереження гемопоетичних стовбурових/прогеніторних клітини після кріоконсервуванння, адже не проведено тестування їх функціональної активності in vitro. Задачею розробки є створення способу виділення гемопоетичних прогеніторних/стовбурових клітин людини, в якому за рахунок застосування нових дій та режимів їх виконання забезпечується виділення гемопоетичних прогеніторних/стовбурових клітин при здійсненні способу, та забезпечується отримання цільових клітин із кріоконсервованої тканини, що дає можливість створення низькотемпературних банків для отримання гемопоетичних стовбурових/прогеніторних клітин із тканини плаценти, яка тестована на відсутність патогенних агентів та доступна для використання у будь-який момент часу, при цьому за здійснення способу проводиться швидка ферментативна обробка тканини, що зменшує негативний вплив ферментів на клітини та не використовується бичача сироватка, що надає можливість застосовувати клітини без можливих побічних ефектів від компонентів тваринного походження при лікуванні. Для вирішення цього завдання спосіб виділення гемопоетичних прогеніторних/стовбурових клітин, включає почергове промивання та механічне подрібнення тканини зрілої плаценти, кріоконсервування тканини, тестування на наявність патогенних агентів, розмороження тканини та виділення клітин шляхом ферментативної обробки. Новим у способі є те, що тестують кров донора плаценти на наявність антитіл проти HIV-1/2, РНК HIV-1/2, антитіл проти HCV, РНК HCV, антитіл проти HBcor, HBsAg, та антитіл проти 2 UA 103053 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Treponema pallidum, попередньо з амніотичної оболонки фето-плацентарного комплексу проводять відбір проб для дослідження на наявність ДНК Chlamidium trachomatis, Mycoplasma genitalis, Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum, фрагмент тканини плаценти після видалення амніотичної оболонки інкубують у стерильному розчині Хенкса з антибіотиками та антимікотиком, проводять почергове механічне подрібнення тканини та промивання у розчині Хенкса з додаванням антибіотиків до досягання розмірів фрагментів в межах 1-20×1-20×1-20 мм, та знебарвлення розчину для промивання, фрагментовану тканину переносять у більші ємності та додають розчин Хенкса, подрібнену тканину плаценти відбирають на дослідження методом ПЛР ДНК HSV-1/2, до тканини у розчині Хенкса повільно додають 10-20 % розчин диметилсульфоксиду (ДМСО), що приготовлений на розчині Хенкса та містить людський альбумін, до кінцевої концентрації ДМСО 5-10 %, переносять у кріоампули, здійснюють мікробіологічний посів, проводять заморожування, кріонкосервовані зразки зберігають у рідкому азоті при температурі -196 °C, фрагменти кріоконсервованої тканини зрілої плаценти розморожують на водяній бані +38-40 °C, виводять ДМСО із тканини шляхом повільного додавання розчину Хенкса, що містить людський альбумін, виділяють клітини шляхом швидкої ферментативної обробки, розводять отриману суспензію клітин буферним розчином, що містить Са++, та людську сироватку (або інші інгібітори колагенази), суспензію клітин відділяють від залишків тканини шляхом фільтрування крізь фільтр із розміром пор 70 мкм та центрифугують при 300 g протягом 5 хв, осад клітин ресуспендують у 0,9 % NaCI. Внаслідок застосування ознак способу забезпечується отримання функціонально активних, фенотипово-гетерогенних гемопоетичних прогеніторних/стовбурових клітин людини. При цьому забезпечується отримання цільових клітин із кріоконсервованої тканини, що дає можливість створення низькотемпературних банків для отримання гемопоетичних стовбурових/прогеніторних клітин із тканини плаценти, яка тестована на відсутність патогенних агентів та доступна для використання у будь-який момент часу. При цьому при здійсненні способу проводиться швидка ферментативна обробка тканини, що зменшує негативний вплив ферментів на клітини та не використовується бичача сироватка, яка може негативно впливати на клітини, що надає можливість застосовувати клітини без можливих побічних ефектів від компонентів тваринного походження при лікуванні. Спосіб ілюструється прикладами застосування В загальному вигляді при здійсненні способу для проведення досліджень плаценту отримували після фізіологічних пологів або шляхом кесаревого розтину на 37-41 тижні вагітності жінок з їх інформованої згоди. Плаценту беруть у донорів, в крові яких не міститься антитіл проти HIV-1/2, РНК HIV-1/2, антитіл проти HCV, РНК HCV, антитіл проти HBcor, HBsAg, та антитіл проти Treponema pallidum. Тканина плаценти не містить ДНК Chlamidia trachomatis, Mycoplasma genitalis, Ureaplasma sp. та HSV-1/2, що виявляється NAT методом. Попередньо з амніотичної оболонки фето-плацентарного комплексу проводять відбір проб для дослідження на наявність ДНК Chlamidium trachomatis, Mycoplasma genitalis, Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum, плаценту очищають від амніотичної оболонки та відрізають пуповину. Вирізають фрагмент тканини на відстані та інкубують у стерильному розчині Хенкса з додаванням 50 од/мл амфотерицину, 100 од/мл бензилпеніциліну, 50 мкг/мл стрептоміцину протягом 15 хв, після чого проводять почергове механічне подрібнення тканини та промивання у розчині Хенкса з додаванням, 100 од/мл бензилпеніциліну та 50 мкг/мл стрептоміцину до досягання розмірів фрагментів 1-20×1-20×1-20 мм та знебарвлення розчину для промивання, подрібнену тканину плаценти відбирають на дослідження методом ПЛР ДНК HSV-1/2. Фрагментовану тканину переносять в більші ємності та додають розчин Хенкса. До тканини у розчині Хенкса повільно додають 10 % розчин ДМСО, що приготовлений на розчині Хенкса та містить 2,5 % людського альбуміну, до кінцевої концентрації ДМСО 5 %. Тканину у кріопротекторі розподіляють по кріоампулах, здійснюють мікробіологічний посів, проводять заморожування за допомогою приладу програмного заморожувача, кріокосервовані зразки зберігають у рідкому азоті при температурі -196 °C. В разі присутності вищеперерахованих інфекційних агентів чи бактеріальної та грибкової флори матеріал кріоконсервованої тканини плаценти утилізують. Розморожування фрагментів тканини здійснюють на водяній бані (+38 - +40 °C) до появи в кріоампулі рідкої фази (0 °C). Виводять ДМСО із тканини шляхом повільного додавання розчину Хенкса, що містить людський альбумін. Клітини виділяють шляхом швидкої ферментативної обробки, розводять отриману суспензію ++ клітин у співвідношенні 1:5 буферним розчином, що містить Са , та містить людську сироватку (або інші інгібітори колагенази), піпетують піпеткою Пастера. Плацентарні клітини збирають шляхом фільтрування через клітинний фільтр з діаметром пор 70 мкм і центрифугують при 300 3 UA 103053 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 g протягом 5 хв, осад клітин ресуспендують у 0,9 % NaCl. Клітини можуть бути використанні для їх подальшого нарощування in vitro з метою застосування в медицині. Для перевірки функціональної активності гемопоетичних прогеніторних/стовбурових клітин кріоконсервованої тканини in vitro, отриману фракцію клітин кріоконсервованої плаценти аналізують на здатність утворення колоній різних типів у напівтвердому середовищі із факторами росту. Спосіб виділення гемопоетичних прогеніторних/стовбурових клітин із кріоконсервованої тканини зрілої плаценти, що включає почергове промивання та механічне подрібнення тканини зрілої плаценти, кріоконсервування тканини, розмороження тканини та виділення клітин шляхом швидкої ферментативної обробки дозволяє зберігати функціонально активні гемопоетичні прогеніторні/стовбурові клітини, про що свідчить утворення колоній різних типів при культивуванні отриманої фракції клітин у напівтвердому середовищі із факторами росту. Для фенотипування гемопоетичних прогеніторних/стовбурових клітин плаценти кріоконсервовану тканину зрілої плаценти ферментують повністю, для чого застосовують суміш ферментів, яка містить колагеназу І, гіалуронідазу, ДНКазу. До суспензії клітин додають людську сироватку та відмивають шляхом центрифугування при 400 g протягом 5 хв і ресуспендують в тому ж розчині. Тканину, що залишилась, інкубують зі свіжою порцією ферментів, отриману суспензію також відмивають і фракції клітин, що отримують на обох стадіях ферментування, об'єднують. Клітини аналізують методом проточної цитофлуориметрії із використанням антитіл anti-CD34, anti-CD45, anti-CD90, anti-CD31, що кон'юговані із флуорохромами. Фенотипуваня проводять на лазерному проточному цитофлуориметрі із застосовунням протоколу ISHAGE (International Society of Hematotherapy and Graft Engineering). Гемопоетичні прогеніторні/стовбурові клітини із кріоконсервованої тканини мають + low low імунофенотип СD34 СD45 SSD . Гемопоетичні прогенітори кріоконсервованої плаценти +/low low/містять популяції із різним рівнем експресії CD34 та CD45, такі як CD34 CD45 , ++ low/+++ low/+/low hi ++ hi CD34 CD45 , CD34 CD45 , CD34 CD45 , та CD34 CD45 . Гемопоетичні прогеніторні/стовбурові клітини із кріоконсервованої тканини містять + low hi + low low субпопуляції CD34 CD45 CD31 та CD34 CD45 CD31 клітин, а також експресують CD90. Розробку ілюструють наступні приклади. Приклад 1: Для виділення клітин попередньо з амніотичної оболонки фето-плацентарного комплексу проводять відбір проб для дослідження на наявність ДНК Chlamidium trachomatis, Mycoplasma genitalis, Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum, плаценту очищають від амніотичної оболонки та відрізають пуповину. Вирізають фрагмент тканини вагою близько 50 г на відстані близько 4 см від пуповини. Плацентарну тканину переносять в стерильний стакан об'ємом 100 мл та інкубують у розчині Хенкса з додаванням 50 од/мл амфотерицину (Синтез, Україна), 100 од/мл бензилпеніциліну (Артеріум, Україна), 50 мкг/мл стрептоміцину (Артеріум, Україна) протягом 15 хв, після чого переносять тканину в стакан об'ємом 100 мл та проводять почергове механічне подрібнення тканини та промивання у розчині Хенкса з додаванням, 100 од/мл бензилпеніциліну та 50 мкг/мл стрептоміцину до досягання розмірів фрагментів 1-20×1-20×1-20 мм та знебарвлення розчину для промивання, подрібнену тканину плаценти відбирають на дослідження методом ПЛР ДНК HSV-1/2 Фрагментовану тканину вагою 10 г переносять в стакан об'ємом 100 мл та додають 30-35 мл розчину Хенксу. До тканини у розчині Хенкса повільно додають 40 мл 10 % розчину ДМСО (Sigma, США), що приготовлений на розчині Хенкса та містить 2,5 % людського альбуміну (Біофарма, Україна), до кінцевої концентрації ДМСО 5 %. Тканину у кріопротекторі розподіляють у кріоампули об'ємом 2 мл, здійснюють мікробіологічний посів, проводять заморожування за допомогою приладу програмного заморожувача, кріоконсервовані зразки зберігають у рідкому азоті при температурі -196 °C. Кров донора плаценти не містила антитіл проти HIV-1/2, РНК HIV-1/2, антитіл проти HCV, РНК HCV, антитіл проти HBcor, HBsAg та антитіл проти Treponema pallidum. Тканина плаценти не містила ДНК Chlamidia trachomatis, Mycoplasma genitalis, Ureaplasma sp. та HSV-1/2, що виявляється методом ПЛР в реальному часі. Тканина плаценти не містила аеробних, анаеробних бактерій, а також грибкової інфекції. Розморожування фрагментів тканини здійснюють на водяній бані (+38…+40 °C) до появи в кріоампулі рідкої фази (0 °C). Для виведення ДМСО розморожену тканину із кріопротектором переносять у стакан об'ємом 100 мл та повільно додають два об'єми розчину Хенкса, що містить 0,125 % людського альбуміну. Видаляють два об'єми розчину та знову додають розчин Хенкса, що містить 0,125 % людського альбуміну до тих пір, поки концентрація ДМСО в розчині не знизиться до 0,5 %. 4 UA 103053 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Клітини виділяють шляхом швидкої ферментативної обробки у розчині колагенази I (Serva, Німеччина) протягом 10-15 хвилин, розводять отриману суспензію клітин середовищем, що містить 1-2 % людської сироватки у співвідношенні 1: (5-10), піпетують піпеткою Пастера. Плацентарні клітини збирають шляхом фільтрування через клітинний фільтр з діаметром пор 70 мкм (Becton Dickinson, США) і центрифугують при 300 g протягом 5 хв, осад клітин ресуспендують у 0,9 % NaCl. Клітини можуть бути використані для їх подальшого нарощування in vitro з метою застосування в медицині. Для перевірки функціональної активності гемопоетичних прогеніторних/стовбурових клітин кріоконсервованої тканини in vitro, отриману 4 фракцію клітин кріоконсервованої плаценти культивують в кількості 5·10 на чашку Петрі діаметром 35 мм у дублікатах в метилцелюлозовмісному середовищі MethoCult (Stem Cell Technologies, Канада). Підрахунок колоній здійснюють на 14 добу росту. Колонії класифікують за визначником колоній, що утворюються після культивування гемопоетичних клітин. Отримана фракція клітин за описаним способом містить функціонально активні гемопоетичні прогеніторні/стовбурові клітини, які зберігають здатність до мультилійнійного диференціювання in vitro після кріоконсервування тканини та дають ріст різним типам колоній, таким як BFU-E (еритроїдні бурстоутворювальні одиниці), CFU-GM (гранулоцитарні та макрофагальні колонієутворювальні одиниці) та CFU-GMEMM (гранулоцитарні, еритроцитарні, моноцитарно/макрофагальні, мегакаріоцитарні колонієутворювальні одиниці). Для фенотипування гемопоетичних прогеніторних/стовбурових клітин плаценти крюконсервовану тканину зрілої плаценти ферментують повністю, для чого застосовують суміш ферментів, яка містить 0,2 % колагенази І (Serva, Німеччина), 0,35 мг/мл гіалуронідази (Sigma, США), 100 од/мл DNase (Sigma, США). До суспензії клітин додають людську сироватку та відмивають шляхом центрифугування при 400д протягом 5 хв і ресуспендують в тому ж розчині. Тканину, що залишилась, інкубують зі свіжою порцією ферментів, отриману суспензію також відмивають і фракції клітин, що отримують на обох стадіях ферментування об'єднують. Клітини аналізують методом проточної цитофлуориметрії із використанням антитіл anti-CD34, anti-CD45, anti-CD90, anti-CD31 (Becton Dickinson, США), що кон'юговані із флуорохромами. Фенотипуваня проводять на лазерному проточному цитофлуориметрі FACSAria (Becton Dickinson, США) із застосовунням протоколу ISHAGE. Результати імунофенотипування порівнюють із результатами імунофенотипування гемопоетичних прогеніторів нативної тканини зрілої плаценти, нативної тканини плаценти першого триместру гестації, пуповинної крові та фетальної печінки. Гемопоетичні прогеніторні/стовбурові клітини із кріоконсервованої тканини, як і гемопоетичні прогеніторні/стовбурові клітини нативної тканини зрілої плаценти, пуповинної крові та + low low фетальної печінки мають імунофенотип CD34 CD45 SSC . Гемопоетичні прогенітори кріоконсервованої плаценти, як і нативної тканини зрілої плаценти та нативної плаценти першого триместру гестації містять популяції із різним рівнем експресії CD34 та CD45, такі як +/low low/++ low/+++ low/+/low hi ++ hi CD34 CD45 , CD34 CD45 , CD34 CD45 , CD34 CD45 та CD34 CD45 . Популяція +++ low/CD34 CD45 клітин відсутня в пуповинній крові та присутня у фетальній печінці. Клітини плацентарної тканини як кріоконсервованої, нативної, так і плаценти першого триместру гестації містять усі популяції гемопоетичних прогеніторів, що спостерігаються у пуповинній крові та фетальній печінці, однак на відміну від останніх характеризуються наявністю гемопоетичних +/low hi ++ hi прогеніторів більш пізніх етапів диференціювання, таких як CD34 CD45 та CD34 CD45 . + Вміст гемопоетичних прогеніторних/стовбурових клітин серед CD45 клітин із кріоконсервованої зрілої плаценти становить 0,8 % (0,1-2,8 %, n=3), що достовірно не відрізняється у порівнянні із гемопоетичними прогеніторними/стовбуровими клітинами із нативної тканини - 0,56 % (0,39-0,76 %, n=16). Вміст гемопоетичних прогеніторних/стовбурових клітин серед фракції мононуклеарних клітин із кріоконсервованої тканини становить 0,4 % (0,30,6 %, n=3). Вміст гемопоетичних прогеніторних/стовбурових клітин серед популяції + low CD34 CD45 клітин 79,4 % (66,2-90,0 %, n=3), що не відрізняється достовірно у порівнянні із нативною тканиною плаценти та фетальною печінкою, де становить 79,7 % (73,4-85,3 %, n=16) та 78,9 % (58,6-93,6 %, n=6) відповідно. Гемопоетичні прогеніторні/стовбурові клітини із кріоконсервованої тканини, як із нативної, + low hi + low low містять субпопуляції CD34 CD45 CD31 та CD34 CD45 CD31 клітин, а також експресують СD90. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 60 Спосіб виділення гемопоетичних прогеніторних/стовбурових клітин, що включає почергове проминання та механічне подрібнення тканини зрілої плаценти, кріоконсервування тканини, 5 UA 103053 U 5 10 15 20 тестування на наявність патогенних агентів, розмороження тканини та виділення клітин шляхом ферментативної обробки, який відрізняється тим, що тестують кров донора плаценти на наявність антитіл проти HIV-1/2, РНК HIV-1/2, антитіл проти HCV, РНК HCV, антитіл проти HBcor, HBsAg, та антитіл проти Treponema pallidum, попередньо з амніотичної оболонки фетоплацентарного комплексу проводять відбір проб для дослідження на наявність ДНК Chlamidium trachomatis, Mycoplasma genitalis, Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum, фрагмент тканини плаценти після видалення амніотичної оболонки інкубують у стерильному розчині Хенкса з антибіотиками та антимікотиком, проводять почергово механічне подрібнення тканини та промивання у розчині Хенкса з додаванням антибіотиків до досягання розмірів фрагментів в межах 1-20×1-20×1-20 мм та знебарвлення розчину для проминання, фрагментовану тканину переносять у більші ємності та додають розчин Хенкса, подрібнену тканину плаценти відбирають на дослідження методом ПЛР ДНК HSV-1/2, до тканини у розчині Хенкса повільно додають 10-20 % розчин диметилсульфоксиду (ДМСО), що приготовлений на розчині Хенкса та містить людський альбумін, до кінцевої концентрації ДМСО 5-10 % переносять у кріоампули, здійснюють мікробіологічний посів, проводять заморожування, кріоконсервовані зразки зберігають у рідкому азоті при температурі 196 °C, фрагменти кріоконсервованої тканини зрілої плаценти розморожують на водяній бані +38-40 °C, виводять ДМСО із тканини шляхом повільного додавання розчину Хенкса, що містить людський альбумін, виділяють клітини шляхом швидкої ферментативної обробки, розводять отриману суспензію клітин буферним ++ розчином, що містить Са , та людську сироватку (або інші інгібітори колагенази), суспензію клітин відділяють від залишків тканини шляхом фільтрування крізь фільтр із розміром пор 70 мкм та центрифугують при 300 g протягом 5 хв. осад клітин ресуспендують у 0,9 % NaCl. Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6