Спосіб кріоконсервування ядровмісних клітин кордової крові, у тому числі гемопоетичних стовбурових клітин

Спосіб кріоконсервування ядровмісних клітин кордової крові, у тому числі гемопоетичних стовбурових клітин, який включає додавання до клітинної суспензії кріозахисного розчину, що містить ДМСО, виготовлений на поліглюкіні, до концентрації ДМСО у суспензії 5 % і заморожування до температури -196 °С, який відрізняється тим, що після змішування з кріозахисним розчином суспензію клітин поміщують на 20 хвилин у камеру програмного заморожувача, попередньо охолоджену до 0 °С, після чого охолоджують зі швидкістю 3...3,5 °С/хв до температури -60...-65 °С з подальшим зануренням у рідкий азот. Винахід належить до галузі кріобіології та кріомедицини і може бути використаний для низькотемпературного консервування ядровмісних клітин кордової крові (ЯВК) з метою подальшого використання їх як джерела гемопоетичних стовбурових клітин (ГСК) у клінічній медицині. Останнім часом кордова кров визнана повноцінним та рівноправним джерелом гемопоетичних стовбурових клітин поряд з кістковим мозком та периферичною кров'ю. Кордова кров є безпечним, таким, що легко отримати, джерелом стовбурових клітин, які мають високий проліферативний потенціал та ефективно використовуються для лікування цілого ряду захворювань. Існує спосіб кріоконсервування кровотворних клітин кордової крові [1], згідно з яким клітини змішують з непроникаючим кріопротектором декстраном молекулярної маси 60000 у концентрації 1,2%, охолоджують до -27...-28 С зі швидкістю 1-4 С/хв, витримують при цій температурі впродовж 15-20 хвилин і далі занурюють у рідкий азот. Розморожування здійснюють на водяній бані при температурі 41 С. Кількість збережених ядерних клітин, що визначено за методом суправітального забарвлення трипановим синім, після розморожування становить 97,1%, кількість життєздатних кровотво рних клітин-попередників (КУОк) в суспензіях кріоконсервованих клітин, що визначено за методом культивування в агарі, - 79,4%. Суттєвим недоліком даного способу є відносно низький показник життєздатності КУОк в суспензіях кріоконсервованих клітин через використання у кріозахисному розчині лише одного типу кріопротектора - декстрану молекулярної маси 60000. Відомо, що традиційний метод кріоконсервування ГСК передбачає додавання до кріозахисного розчину кріопротектора диметилсульфоксиду (ДМСО) у концентрації 10%. Однак окрім захисної функції ДМСО у високих концентраціях може чинити токсичну дію на клітини крові, яка, у кінцевому рахунку, призводить до зниження життєздатності клітин після процесу заморожування-нагріву. Останнім часом при розробці методів кріоконсервування ядровмісних клітин кордової крові в кріозахисному розчині використовують декілька кріопротекторних речовин у низьких концентраціях, але з різним механізмом дії (інтрацелюлярний розчин ДМСО та екстрацелюлярний розчин гідроксіетиленкрохмалю, альбуміну та ін.). Виходячи з вищесказаного, для кріоконсервування клітин кордової крові необхідно використовувати ДМСО в мінімально можливих концентра (19) UA (11) 92227 (13) C2 (21) a200814009 (22) 05.12.2008 (24) 11.10.2010 (46) 11.10.2010, Бюл.№ 19, 2010 р. (72) БАБІЙЧУК ЛЮБОВ ОЛЕКСАНДРІВНА, ГРИЩЕНКО ВАЛЕНТИН ІВАНОВИЧ, ГУРІНА ТЕТЯНА МИХАЙЛІВНА, ЗУБОВ ПАВЛО МИХАЙЛОВИЧ, РЯЗАНЦЕВ ВОЛОДИМИР ВАСИЛЬОВИЧ, КУДОКОЦЕВА ОЛЬГА ВАЛЕНТИНІВНА, ЗУБОВА ОКСАНА ЛЕОНІДІВНА (73) ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ НАЦІОНАЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ НАУК УКРАЇНИ (56) UA 31847, 15.12.2000 UA 80062, 10.08.2007 UA 58997, 15.08.2003 UA 46673, 15.04.2005 3 ціях (до 5%) у поєднанні з речовиною, яка б не тільки сама по собі була кріопротектором, але була б і найбільш сприятливим середовищем для ядровмісних клітин, а також не потребувала відмивання клітинної суспензії при використанні її після кріоконсервування. Найбільш перспективним з цієї точки зору на сьогоднішній день є використання кріопротектора поліглюкіну. Для приготування кріозахисних розчинів використовують фармацевтичну форму, яка являє собою 6% розчин поліглюкіну, виготовлений на фізіологічному розчині. Відомий спосіб консервування кровотворних клітин кордової крові людини із застосуванням кріозахисного розчину, що містить ДМСО, приготований на поліглюкіні [2]. Згідно зі способом до сконцентрованої суспензії клітин загальним об'ємом 25-30мл додають, при постійному перемішуванні, рівний об'єм попередньо приготовленого кріозахисного розчину до кінцевої концентрації ДМСО у суспензії клітин 5-6%. Як контейнер використовують кріомішок «Hemofreeze DF2005». Для заморожування кріомішок з клітинною суспензією приміщують горизонтально в кріобокс, виконаний з багатошарової фанери загальною товщиною 10мм. Далі кріобокс переносять в пари рідкого азоту з температурою – 167 2 С і охолоджують з середньою швидкістю 1,53 0,9 С/хв від 0 С до 40 С. Через 1-2 години від початку заморожування кріомішок з біоматеріалом переносять у сховище з рідким азотом, де заморожують до -196 С для подальшого довгострокового зберігання. Розморожують біоматеріал на водяній бані при температурі 38 С до моменту переходу замороженого матеріалу у рідку фазу. Кількість життєздатних клітин після процедури заморожування-нагріву, визначена шляхом суправітального забарвлення трипановим синім, становить 92,81 3,2%. Абсолютна кількість клітин з імунофенотипом CD34+ (ГСК), яку визначали в проточному цитометрі FAC Scan (Becton Dickinson USA), складає 2,74 2,67 107 (від 0,13 107 до 16,37 107). Недоліком цього способу є те, що абсолютна кількість ГСК у відігрітих зразках коливається у дуже великих межах - від 0,13 107 до 16,37 107, що вказує на значну нестабільність якості кінцевого біологічного матеріалу. Окрім того, спосіб передбачає використання кріобоксу, який пристосований для заморожування зразків лише в упаковці конкретного типу і розміру, з певним об'ємом зразка, що значно звужує можливості використання даного способу. В основу винаходу поставлено задачу створити такий спосіб кріоконсервування ядровмісних клітин кордової крові, у тому числі гемопоетичних стовбурових клітин, в якому би, шляхом зміни режиму охолодження, забезпечувалась можливість одержувати більш високі та стабільні показники життєздатності ГСК у розмороженому зразку. Ця задача вирішується тим, що у способі кріоконсервування кровотворних клітин кордової крові, який включає додавання до клітинної суспензії кріозахисного розчину, що містить ДМСО, виготовлений на поліглюкіні, до концентрації ДМСО у 92227 4 суспензії 5% і заморожування до температури – 196 С, згідно з винаходом, після змішування з кріозахисним розчином суспензію клітин поміщують на 20 хвилин у камеру програмного заморожувана, попередньо охолоджену до 0 С, після чого охолоджують зі швидкістю 3...3,5 С/хв до температури 60...-65 С з подальшим зануренням у рідкий азот (196 С). Заявлений спосіб кріоконсервування ядровмісних клітин кордової крові, у тому числі гемопоетичних стовбурових клітин, забезпечує високу життєздатність ядровмісних клітин кордової крові і гарантує стабільність показників життєздатності ГСК за рахунок того, що насичення клітин розчином кріопротекторів відбувається при постійній температурі 0 С, яка сприяє стабілізації плазматичних мембран і білків цитоскелету клітин. Підтримка постійної температури 0 С допомагає також одержувати однаковий рівень проникнення кріопротектора у клітини та компенсує підвищення температури суспензії клітин, яке відбувається при змішуванні під час додавання кріозахисного розчину. Охолодження зразків з постійною швидкістю 3...3,5 С/хв у програмному заморожувачі забезпечує однаковість режиму заморожування від зразка к зразку, а, таким чином, і однакові стабільні показники життєздатності. Швидкість охолодження 3...3,5 С/хв є найбільш сприятливою для заморожування ЯВК, особливо ГСК. Охолодження зразків з постійною контрольованою швидкістю до -60...65 С пов'язано з тим, що інтервали температур, в яких найбільш імовірне пошкодження клітин під час заморожування суспензії, знаходяться вище цих значень. Спосіб пояснюється наступними прикладами. Приклад 1. Для виділення ЯВК брали дозу кордової крові об'ємом 60-90мл, яка була заготовлена на консерванті „Глюгіцир" після нормальних пологів. Середня абсолютна кількість ЯВК в 1мл складала (1,7 0,52) 107. Середня абсолютна кількість ЯВК та ГСК в дозі складала (1,0 02,2) 109 та (4,24 1,4) 106, відповідно. До цільної кордової крові у співвідношенні 1:1 додавали 6% розчин поліглюкіну, виготовлений на фізіологічному розчині. Седиментацію еритроцитів проводили в залежності від об'єму цільної кордової крові протягом 30-50 хвилин до утворення чіткої границі між шаром еритроцитів та надосаду, який містить у собі ЯВК та ГСК. Надосад відділяли у окремий флакон та центрифугували 12-18 хвилин при 1500 g. Після центрифугування залишали концентрат клітини об'ємом 10-12мл. Середня абсолютна кількість ЯВК в 1мл складала (6,7 1,3) 107. Середня абсолютна кількість ЯВК та ГСК в дозі складала (8,3 1,6) 10 та (3,7 1,3) 106, відповідно. Схоронність і життєздатність ЯВК та ГСК визначали за допомогою метода проточної цитофлуориметрії на проточному цитометрі FACS Calibur з використанням реагентів Becton Dickinson згідно з міжнародним ISHAGE протоколом. За допомогою цього методу виділення був отриманий середній вміст ЯВК та ГСК, відповідно, 89,0 4,9% та 95,0 3,1%. Життєздатність клітин була на рівні 99,0%. 5 92227 При температурі 0...4 С до отриманої суспензії ЯВК додавали 2,5мл 25% розчину ДМСО, який заздалегідь готували на поліглюкіні. Кінцева концентрація ДМСО у суспензії клітин становила 5%. Отриману завись клітин розливали у кріоампули і приміщали у камеру програмного заморожувача, яка попередньо була охолоджена до 0 С. Протягом наступних 20 хвилин суспензію клітин витримували при цій температурі, після чого зразки охолоджували до температури -60...-65 С зі швидкістю 3...3,5 С/хв і далі занурювали у рідкий азот. Відігрівали на водяній бані при температурі 40...42 С до зникнення кристалів льоду. Середня абсолютна кількість ЯВК в 1мл складала (4,9 0,4) 107. Середня абсолютна кількість ЯВК та ГСК в дозі складала (5,1 0,4) 108 та (2,7 0,68) 106, відповідно.Після розморожування життєздатність ЯВК, яка була визначена за допомогою суправітального барвника трипанового синього, становила 93,6 5,2%. Показники життєздатності, які були визначені таким чином, не можна вважати адекватними, тому що низьке прокрашування клітин трипановим синім не свідчить про їх дійсну життєздатність, а лише віддзеркалює проникність плазматичних мембран клітин для цього барвника. Окрім того, клітинна суспензія, що підлягає заморожуванню, містить у собі високомолекулярну речовину - поліглюкін, який створює навколо клітин захисний каркас і додатково перешкоджає прокрашуванню клітин трипановим синім. Тому показники життєздатності, визначені за таким методом, не є адекватними і не відповідають дійсності. При застосуванні адекватного метода оцінки показників життєздатності - проточного цитофлуориметра з використанням ДНКбарвника 7AAD, життєздатність ЯВК та ГСК були на рівні 85,1 8,6% і 95,4 4,6 %, відповідно. Приклад 2. Спосіб здійснювали аналогічно Прикладу 1, за винятком того, що охолодження до температури -60...-65 С проводили з різними швидкостями. Результати по життєздатності ЯВК кордової крові та ГСК наведені у Таблиці 1, з якої видно, що оптимальною швидкістю охолодження є 3...3,5 С/хв. Статистичне достовірної різниці між показниками життєздатності ЯВК та ГСК при швидкості охолодження 1 С/хв та 3...3,5 С/хв немає, але швидкість охолодження 1 С/хв потребує додаткових витрат часу (приблизно 40...45 зайвих хвилин) та рідкого азоту. Однак при швидкості охолодження 5 С/хв життєздатність ГСК значно знижузнижується. Таким чином, для отримання високих показників життєздатності ГСК і гарантії їх стабіль 6 ної повторюваності необхідно охолоджувати зразки від 0 С до -60...-65 С з постійною швидкістю 3...3,5 С/хв. Приклад 3. Спосіб здійснювали аналогічно Прикладу 1, за винятком того, що перед занурюванням у рідкий азот охолодження проводили до різної кінцевої температури. Результати по життєздатності ЯВК та ГСК наведені у Таблиці 2, з якої видно, що зниження кінцевої температури охолодження до -80 С не впливає на кінцеву життєздатність клітин, але вимагає додаткових витрат рідкого азоту, тому оптимальною кінцевою температурою охолодження перед занурюванням у рідкий азот є -60...-65 С. Вибір кінцевої температури охолодження на рівні -60...-65 С обумовлено також тим фактором, що інтервали температур, які найбільш впливають на пошкодження клітин за рахунок механічних та осмотичних чинників, знаходяться вище температури -60...-65 С і пов'язані, в першу чергу, з затвердінням усієї системи при температурі кристалізації та до кристалізаційними процесами у суміші кріопротекторів евтектичної концентрації. Охолодження зразків у цих інтервалах температур з постійною контрольованою швидкістю гарантує стабільність і повторюваність кінцевих результатів життєздатності клітин після кріоконсервування. Приклад 4. Спосіб здійснювали аналогічно Прикладу 1, за винятком того, що насичення клітин розчином кріопротекторів проводили при кімнатній температурі та при температурі 0 С у камері програмного заморожувача. Життєздатність ЯВК та ГСК після заморожування-нагріву у першому випадку була нижчою (ЯВК - 79,8 5,3%, ГСК 87,2 3,9%), ніж у другому (ЯВК - 85,1 8,6%, ГСК 95,4 4,6%). Це пов'язано з тим, що процес насичення клітин кріопротектором в значній мірі залежить від температури. Кімнатна температура коливається в залежності від пори року та мікроклімату у приміщенні, що в значній мірі впливає на швидкість проникнення розчину кріопротектору в клітини. Окрім цього, при додаванні розчинів кріопротекторів з ДМСО до суспензії клітин підвищується температура розчину, що у поєднанні з підвищеною температурою навколишнього середовища призводить до розвитку руйнівних процесів у клітинах. Температура 0 С сприяє гальмуванню таких явищ. Таблиця 1 Життєздатність ЯВК та ГСК кордової крові в залежності від швидкості охолодження Швидкість охолодження, °С/хв Життєздатність ЯВК, % Життєздатність ГСК ,% 1 78,3 4,9 91,2 5,1 3 85,1 8,6 95,4 4,6 3,5 85,1 9,1 95,4 4,8 5 69,3 9,2 77,3 4,9 10 59,0 6,3 65,2 7,2 7 92227 8 Таблиця 2 Життєздатність ЯВК та ГСК кордової крові в залежності від кінцевої температури охолодження перед занурюванням у рідкий азот Кінцева температура охолодження, °С Життєздатність ЯВК,% Життєздатність ГСК,% -40 -50 -60 -65 -80 80,9 9,0 87,7 5,8 83,4 8,8 91,2 5,2 85,1 8,6 95,4 4,6 85,0 9,2 94,9 5,3 85,1 8,9 95,1 3,6 Джерела інформації 1. Цуцаєва А.О., Грищенко B.I., Кудокоцева О.В., Щеглов А.В., Тупчиєнко Г.С., Прокопюк О.С. Спосіб кріоконсервування кровотворних клітин кордової крові. Патент України № 31847 А, АО IN 1/02, публ. 15.12.2000. Комп’ютерна верстка А. Крижанівський 2. Гришина В.В. Разработка оптимальных методов криоконсервирования кроветворных клеток пуповинной крови человека для трансплантации // Клеточная трансплантация и тканевая инженерия.- 2006.- № 1(3).- С. 52-59 (прототип). Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601