Спосіб раннього виявлення та прогнозу патологій щитоподібної залози та яєчників людини на підставі мікроелементного складу

Реферат: Спосіб раннього виявлення та прогнозу патологій щитоподібної залози та яєчників людини на підставі мікроелементного складу, який включає діагностику та прогноз небезпеки розвитку патологічних станів щитоподібної залози та яєчників людини, в тому числі йододефіцитного вузлового колоїдного зоба та раку яєчників, причому основі визначення вмісту купруму та цинку, зв'язаних з металотіонеїнами тканини щитоподібної залози, яєчників людини та/або сироватки крові, обраховують частку акумульованого металу у металотіонеїнах як Ζn-ΜΤ/Ζn(т) та Сu-МТ/Сu(т) та класифікують відповідь організму як норму, патологічний процес та декомпенсацію залежно від величини цих співвідношень і варіабельності абсолютних значень рівня його складових відносно запропонованих референтних значень. UA 104078 U (12) UA 104078 U UA 104078 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до області медицини, а саме медичної біохімії, ендокринології, гінекології та хірургії і може бути використана для діагностики гормонально-залежних патологій, вузлового колоїдного зоба, раку яєчників, функціонального стану щитоподібної залози та яєчників, прогнозу небезпеки патологічних станів у щитоподібній залозі та яєчниках людини та їх профілактики. Відомий "Спосіб визначення макро- і мікроелементного балансу в організмі" (RU 2129426) відповідно до якого у біосубстратах (волосся і нігті) визначають вміст макро- і мікроелементів Cu, Fe, Mg, Μn, Ρ, Cd, Co, Mo, Pb, Ca, Se, Cr та встановлюють їх кореляційні зв'язки. При зміні значень відносно норми виявляють кореляцію з різними захворюваннями. Зокрема, при захворюваннях сполучної тканини аутоімунного характеру спостерігається зниження вмісту купруму, цинку, кальцію та селену. При сечокам'яній хворобі - достовірне підвищення вмісту кобальту, магнію і фосфору. При остеопорозах різної етіології - достовірне підвищення вмісту стронцію, зниження вмісту магнію, кальцію, мангану, цинку та купруму. При захворюваннях серцево-судинної системи - вірогідне зменшення вмісту калію, магнію, хрому і купруму. До недоліків запропонованого способу можна віднести відсутність чітких та кількісних критеріїв до визначення патологічних станів, широкий діапазон визначуваних показників та відсутність належного обґрунтування для пошуку "кореляційних зв'язків". Відомі "Спосіб визначення структурних порушень щитоподібної залози" (Потова С.В. та ін., RU № 2302640) та "Спосіб прогнозування захворювань щитоподібної залози у людей, зайнятих на шкідливому виробництві" (Растопчин О. та ін., RU 2305846), згідно з якими для виявлення структурних порушень щитоподібної залози визначають концентрацію йоду або кадмію та меркурію у волоссі людини. Відповідно, за концентрації йоду у волоссі менше ніж 0,27 мкг/г прогнозують дифузні зміни, за концентрації більше ніж 4,2 мкг/г - дифузно-вузлові зміни у щитоподібній залозі, а за вмісту кадмію вище 0,25 мкг/г і меркурію вище 1,0 мкг/г людину відносять до групи ризику по розвитку гіперплазії щитоподібної залози. Використання способів дозволяє підвищити точність визначення структурних порушень щитоподібної залози на донозологічному етапі. Нами був розроблений спосіб визначення субклітинного розподілу йоду у тканині щитоподібної залози (Спосіб визначення концентрації йоду в біосубстраті, №45332, 2009 p., автори: ІШдловський О.В., Шідловський В.О., Столяр О.Б., Осадчук Д.В., Фальфушинська ГЛ.). Дані щодо субклітинного розподілу інтратиреоїдного йоду (збільшення вмісту та частки неорганічного йоду у структурі загального) у поєднанні з аналізом морфологічних змін у тиреоїдній паренхімі дозволяють оцінювати функціональний стан тиреоцитівту визначати стадійність розвитку вузлового колоїдного зоба. Відомий "Спосіб ранньої діагностики порушень функції яєчників мікроелементозної етіології" (Саричев Д.А. та ін., RU 2428694), який може бути використаний для діагностики порушень функції яєчників у дівчат, в тому числі і порушень менструального циклу мікроелементозного генезу. У дівчат, які проживають в екологічно неблагоприємних районах, визначають у сечі рівень амінолевуленової кислоти, і якщо він перевищує значення 53,2 мкМ/добу, то додатково проводять відбір проб волосся, в яких визначають концентрацію міді, цинку, селену та свинцю. Розраховують співвідношення концентрацій пар антагоністів Pb/Zn, Se/Pb, Pb/Cu. При виявленні відхилень перерахованих показників не менше ніж у 2 рази від нормативів, у даної пацієнтки діагностують порушення менструального циклу мікроелементозної етіології. Відомий спосіб діагностики порушень функцій яєчників жінок з груп виробничо-екологічного ризику шляхом вимірювання імпедансу слизової порожнини рота протягом місяця, починаючи з першого дня менструації, і при відмінності між величинами імпедансу, визначених на 5-7 і 15-17 дні, менше 20 % діагностують порушення менструального циклу (патент РФ № 2202277, 2002 p.). Однак цей спосіб, незважаючи на свою інформативність, відрізняється тривалим характером виконання. Окрім того, на точність діагностики впливають можливі хронічні запальні процеси в порожнині рота. Метод не дозволяє судити про етіологію порушень менструального циклу і вибрати адекватно обґрунтовану тактику лікування. Проведений нами пошук у базі деклараційних патентів на винахід та/або корисну модель не виявив більше способів оцінки функціональної активності щитоподібної залози та яєчників людини на підставі визначення мікроелементного складу. Разом з тим, існує декілька прототипів оцінки патологічних станів інших органів та/або їх систем у людини з використанням аналізу концентрації ессенціальних та токсичних елементів, які вважаємо за доречне описати для розширення уявлень щодо існуючих методологічних прийомів в аналізованій галузі. Зокрема, відомий "Спосіб визначення токсичності дії важких металів на організм" (Переслегіна І.А. та ін., RU (11) 2138816 (13) С1, 1999) для реалізації якого визначають рівень важких металів у сироватці крові і активність каталази в еритроцитах. При зниженні активності каталази у 1 UA 104078 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 поєднанні з підвищеним рівнем важких металів дію останніх визначають як токсичну. Спосіб забезпечує можливість виявлення ранньої стадії інтоксикації і забезпечує прогноз виникнення і характер перебігу захворювання. Відомий "Спосіб визначення чутливості мембран еритроцитів до дії важких металів" (Півкіна Т.В. та in., RU 2332668), який використовується для діагностики токсичної дії важких металів, зумовленої забрудненням навколишнього середовища і оцінки стану організму людей, у тому числі вагітних жінок на доклінічному етапі. Для реалізації способу клітинну суспензію еритроцитів інкубують з розчинами ZnSO4, MnSO4, NiSO4 та Pb(NCb)2 заданої концентрації протягом 30 хвилин та після інкубації під мікроскопом визначають кількість дискоцитів та Дм% К ЧМ   100 % Дн% обраховують коефіцієнт чутливості мембран еритроцитів за формулою - де К ЧМ - коефіцієнт чутливості мембран еритроцитів; Дн - кількість дискоцитів в нативному мазку, %; Дм - кількість дискоцитів за впливу вищезазаначених важких металів, %. Якщо К ЧМ менше 95 % вихідного рівня, то клітинні мембрани чутливі до даного металу. Відомий "Спосіб діагностики синдромів дитячого церебрального паралічу" (Смірнов І.С. та Семенов А.С, RU 2226983, 2002), для реалізації якого проводять визначення концентрації мікроелементів у суспензії еритроцитів, в якій визначають одночасно вміст фосфору, купруму, літію та кадмію та, за наявності нормальних показників концентрацій купруму та зниженні концентрацій фосфору, кадмію та літію щодо норми, діагностують гіпертензійний синдром, а при збільшенні концентрацій кадмію, фосфору, літію та купруму - судомний синдром. Відомий "Спосіб прогнозування патології нирок у дітей, що проживають в регіоні з високим антропогенним навантаженням важкими металами" (Попова Л.Ю. та ін., РФ 2234251, 2003). При підвищенні цитотоксичного індексу важких металів понад 0,15 і зниженні рівня кортизолу в сироватці крові більше ніж у 2 рази у поєднанні з накопиченням нефротоксичних важких металів у біосередовищах і сумою діагностичних коефіцієнтів, рівною +70 і більше, визначають ризик формування нефропатій. Спосіб дозволяє своєчасно виявити дітей з високим ризиком розвитку ниркової патології і провести превентивні заходи. До недоліків запропонованого способу можна віднести відсутність чітких рекомендацій щодо обрахунку цитотоксичного індексу металів та його високу ресурсоємність відповідно до значного набору кількісних критеріїв для його реалізації. Відомий "Спосіб визначення дефіциту мікроелементів в організмі людини" (Вельховер Є.С., RU (11) 2040257 (13) С1), в основу якого покладено визначення дефіциту окремих металів в організмі за інтенсивністю їх всмоктування шкірою протягом 24-48 год. з моменту накладення аплікатора з моношаром металу, товщиною 0,0001-30,0 мкм. До недоліків запропонованого способу можна віднести відсутність чітких кількісних критеріїв та відсутність даних щодо товщини моношару для окремого металу, а також рекомендацій до практичного використання способу. Відтак, проведений патентний пошук свідчить про спорадичні дослідження можливості використання вмісту та/або розподілу мікроелементів у тканинах організму людини для прогнозу розвитку патологічних станів, незважаючи на визначальну роль низки біогенних елементів у забезпеченні функціональної активності практично всіх органів людини та їх систем. Запропоновані способи здебільшого не мають системного характеру, не пропонують чітких кількісних критеріїв для диференціації досліджуваних груп, не враховують стадійності перебігу патологічного процесу тощо. Розробники, в основному, використовують вузькоспеціалізовані і недостатньо стандартизовані методики, опосередковані методи, які не повною мірою відображають ефекти пошкоджуючих речовин на біологічні системи. З одного боку, функція щитоподібної залози тісно пов'язана з системою гіпоталамус-гіпофізяєчники, перш за все, завдяки наявності загальних центральних механізмів регуляції, а з іншого - стан репродуктивної системи модулює функціональну активність щитоподібної залози, що підтверджується змінами її функції під час вагітності, лактації, доброякісних пухлинах та гіперпластичних процесах жіночих статевих органів тощо (Poppe and Volkeniers, 2004). Відомо, що яєчники містять рецептори до тиреотропного гормону та трийодтироніну, що робить можливим прямий вплив дисфункції щитоподібної залози на стероїдогенез, овуляцію, функцію жовтого тіла тощо (Metalon ct al., 2001). Відтак, використання системного підходу у вивченні патологічних станів щитоподібної залози та яєчників є доречним та полегшує розуміння механізмів їх розвитку та прогресування, а в окремих випадках, методами інтер- або екстраполяції, дозволяє спрогнозувати протікання патофізіологічних процесів. У низці робіт доведено, що для забезпечення функціональної активності ендокринних залоз необхідне підтримання фізіологічного рівня біогенних елементів, насамперед цинку та купруму 2 UA 104078 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (Valko et al., 2006). Цинк - ессенціальний метал, який входить до складу близько 10 % всіх протеїнів організму та виступає в ролі кофактора для більш ніж 300 ензимів, регулює виділення та функціонування низки гормонів, у тому числі статевого – дигідрокортикостерону, проявляє антиоксидантну функцію, стабілізує структуру протеїнів та індукує упакування протеїнових субдоменів, залучається до підтримання стабільності геному, виконує функцію вторинного месенджера та регулює клітинний цикл, проліферацію, диференціацію клітини та апоптоз тощо. Доведено, що дефіцит та/або діерегуляція цинку в організмі сприяє розвитку патологічних процесів, виникненню ендокринних порушень, неопластичному росту клітин та підвищує ризик розвитку раку (Alam and Kelleher, 2012). Разом з тим, акумуляція цинку за патологічних станів щитоподібної залози та яєчників досліджена недостатньо (Lightman et al., 1988, Tian and Diaz, 2012, Kebapcilar et al., 2013, Фальфушипська та in., 2014). Практично невідомо, як відбувається розподіл металів між металодепонувальними протеїнами та потенційно токсичною недепонованою їх формою у клітині. Купрум - ессенціальний елемент для людини та тварин, однак перевищення його фізіологічного вмісту в організмі може викликати значні деструктивні зміни. У хворих на вузловий колоїдний зоб вміст купруму у незв'язаній з МТ, тобто потенційно токсичній формі, не зважаючи на збільшення рівня купруму у МТ, зростає у щитоподібній залозі приблизно удвічі. Очевидно, це сприяє прооксидантним змінам, що проявляється, зокрема, як посилення утворення оксирадикалів, збільшення рівня продуктів перекисного окиснення ліпідів та окиснення глутатіону (Фальфуїпинськата ін., 2011, 2014). Конкуренція цинку та купруму на рівні вмісту у плазмі крові, травному тракті та культурі клітин людини добре відома (Valko et аl., 2006). Надлишок купруму у тканині щитоподібної залози зумовлює зменшення накопичення цинку у тканині хворих на вузловий колоїдний зоб, що ймовірно може призводити до пригнічення цинк-залежної протеїн-синтезуючої функції, що може становити суттєву складову патогенезу. В основу корисної моделі поставлено задачу створення способу раннього виявлення та прогнозу патологічних станів щитоподібної залози та яєчників людини, у тому числі й гормонально-залежних, на підставі оцінки абсолютної (за вмістом металів у металотіонеїнах) та відносної (частка акумульованих металів у металотіонеїнах від загального у тканині) металодепонувальної здатності стресочутливого і метало-депонувального протеїну металотіонеїну (МТ) в однойменній тканині та/або сироватці крові. Поставлена задача вирішується тим, що на основівизначення вмісту купруму та цинку, зв'язаних з МТ тканини щитоподібної залози, яєчників людини та/або сироватки крові, та загального вмісту відповідного металу у тканині (т) обраховують частку акумульованого металу у МТ як Ζn-ΜΤ/Ζn (т) та Cu-MT/Cu(t), та, за умови вилучення металів з активного клітинного пулу до МТ, прогнозують розвиток патологічного процесу, в тому числі й гормонально-залежного. Металотіонеїни (МТ) - родина низькомолекулярних, внутрішньоклітинних, термостабільних, сульфурвмісних протеїнів, високоафінних до іонів d-металів, з плейотропними функціями. МТ у фізіологічних умовах беруть участь у гомеостатичній регуляції ессенціальних металів (купруму та цинку) у клітині. Вони мобілізують свої можливості в екстремальних умовах, виконують функції інших металопротеїнів за умов їх відсутності та/або пригнічення та виконують детоксикаційну функцію. Також МТ залучаються до регуляції проліферації та диференціації клітин, розвитку пухлин, вироблення резистентності до радіо- та хіміотерапії тощо. Аналіз МТ слугує важливим діагностичним критерієм прогнозу у розвитку захворювання, зокрема утворення метастазів, а також у застосуванні хіміотерапії. Нами було доведено, що МТ щитоподібної залози у зобнозміненій тканині активно залучаються до зменшення наслідків окисного ушкодження, виконуючи роль пастки радикалів за рахунок резерву тіолових груп та хелатуючи купрум та цинк у нетоксичні для тиреоцитів комплекси (Фальфушинська та ін., 2011, Фальфушинська та ін., 2014). Запропонований спосіб здійснюється наступним чином: у пацієнта відбирають 1 мл крові або інтраопераційно 350 мг частки тканини щитоподібної залози (вузол, неуражена вузлом частина) або яєчників (онкозмінена та інтактна тканина). У досліджуваних зразках визначають вміст купруму та цинку у тканині (сироватці крові) та їх МТ та обраховують частку акумульованого металу у МТ як Ζn-ΜΤ/Ζn (т) та Cu-MT/Cu(т). Матеріалом для досліджень були зразки сироватки крові осіб, які в анамнезі не мали гормонально-залежних патологічних станів, зразки сироватки крові та післяопераційні препарати часток щитоподібної залози 25 хворих, оперованих з приводу однобічного йододефіцитного вузлового колоїдного зоба на базі хірургічного відділення міської клінічної лікарні швидкої допомоги м. Тернополя. Відбирали тканину вузла та неураженої вузлом частки щитоподібної залози. Всі обстежені пацієнти були мешканцями регіону дефіциту йоду 3 UA 104078 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 середнього ступеня тяжкості. Також відбирали зразки тканини яєчників жінок, які в анамнезі не мали відповідної гінекологічної патології та оперованих з приводу епітеліального раку яєчників на базі гінекологічного відділення Тернопільського обласного онкологічного диспансеру. Всі дослідження проводились у відповідності до ухвали Першого національного конгресу з біоетики (Київ, 2000) та рішення комісії з біоетики Тернопільського державного медичного університету ім. І.Я. Горбачевского. Всі процедури по обробці тканин проводили на холоді. Всі реактиви, крім нижче зазначених, були фірми "Синбіас" кваліфікації "хч". Для визначення вмісту металів у ΜТ одержують розчин термостабільних сполук з 10 %-ного гомогенату досліджуваної тканини або сироватки крові в 10 мМ трис-НСІ буфері, рН 8,0 з додаванням 10 мМ 2-меркаптоетанолу ("Sigma") для запобігання окиснення SH-груп та інгібітора протеаз фенілметилсульфонілфлуориду (0,1 мМ, "Sigma"). Гомогенат виготовляють з наважки тканини загальною масою 350 мг та центрифугують протягом 45 хв. за 16 000 × g. Отриманий надосад інкубують 5 хв при 85 °C і знову центрифугують за тих самих умов. Надосад, що містить розчинні термостабільні сполуки, піддають гель-розподільчій хроматографії, яку здійснюють 0,01 Μ трис-НСІ буфером, рН 8,0 на колонці, заповненій сефадексом G-75 ("Sigma") або сефадексом G-50 ("Sigma"), з охолоджувальним кожухом розміром 50×1,5 см із швидкістю 0,33 мл/хв. Для запобігання втратам металів, зв'язаних з протеїнами, в елюент не додають ЕДТА. Вимірюють світлопоглинання проб при довжині хвилі 280 і 254 нм (D280 і D254)·Калібровку колонки здійснюють за допомогою протеїнів з відомою молекулярною масою - сироваткового альбуміну (67,0 кДа), хімотрипсиногену (25,8 кДа), міоглобіну (17,0 кДа), питохрому с (12,3 кДа), убіквітину (8,4 кДа) та окисненого β-ланцюга інсуліну (3,4 кДа), (всі маркери фірми "Sigma", CILIA). М'Г ідентифікують як низькомолекулярні термостабільні протеїни із високим показником співвідношення світлопоглинання D 254/D280·Після об'єднання проб піку ΜТ-вмісної фракції (10 мл) проводять визначення в ній вмісту купруму та цинку. Вміст купруму та цинку у фракціях ΜТ та тканинах (сироватці крові) вимірюють після озолення зразків за 105 °C у перегнаній нітратній кислоті в співвідношенні 1:5 (маса:об'єм). Вміст металів визначають на атомно-абсорбційному спектрофотометрі за загальноприйнятими методиками і виражають в нмоль (або мкг) на г вологої маси тканини (мл крові). Для тканини щитоподібної залози людини вміст купруму та цинку в нормі становить 2,2±0,4 мкг/г та 106,5±10,7 мкг/г тканини відповідно, для тканини яєчників - 1,83+0,19 мкг/г та 129,5±21,4 мкг/г тканини відповідно, а сироватки крові - 1,35+0,4 мкг/мл та 1,25+10,7 мкг/мл крові відповідно. Реакцію організму кваліфікують як: - "норма" частка акумульованого металу в ΜТ (Ме(МТ)/Ме(т)) знаходиться в діапазоні -15 % < Me