Біопрепарат для захисту рослин від хвороб, викликаних фітопатогенними грибами

Реферат: Винахід належить до біопрепарату "Біоксин" для захисту рослин від хвороб, викликаних фітопатогенними грибами, що містить активний штам бактерій Pseudomonas aureofaciens ІМВ У-7096 на основі живильного середовища, що містить воду, сірчанокислий амоній, калій фосфорнокислий однозаміщений, де біопрепарат додатково містить активний штам бактерій Pseudomonas aureofaciens ІМВ У-7097, при співвідношенні штамів 1:1, а живильне середовище додатково містить мелясу бурякову, кукурудзяний екстракт, магній сірчанокислий. UA 104807 C2 (12) UA 104807 C2 UA 104807 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Винахід належить до галузі біотехнології, зокрема, до біологічних засобів рослин від хвороб. Запропонований біопрепарат може бути використаний у сільському господарстві для біологічного захисту рослин від хвороб, викликаних фітопатогенними грибами та бактеріями. Для боротьби із збудниками грибкових інфекцій застосовуються хімічні і мікробіологічні засоби (див. http://www.gardenia.ru/pages/vribo1008.htm). Недоліком вживання отрутохімікатів є те, що вони не мають виборчої дії на навколишні об'єкти, не руйнуються або не встигають руйнуватися і внаслідок цього, зберігаючись в рослинах, потрапляють в організм людини і тварин. Одним з найбільш перспективних є використання біопрепаратів, тому, що мікроорганізми, що входять до складу таких препаратів виділені з природних умов і при їх використанні не приводять до небажаних змін в біоценозі та не приводять до отруєння рослин, тварин та людей. Відомий біопрепарат "Бізар" для захисту рослин від хвороб, викликаних фітопатогенними грибами, спосіб одержання якого наведений у патенті (див. пат. UA № 23657, МПК A01N 63/00, опубл. 11.06.2007, Бюл. № 8). Спосіб включає посів клітин бактерій-антагоністів фітопатогенних грибів, культивування їх у живильному середовищі, яке містить в собі всі необхідні мікроелементи, мінеральні солі, вітаміни і стимулюючі добавки, вирощування біомаси на живильному середовищі з одержанням у промисловому варіанті цільового продукту у вигляді суспензії встановленого титру, визначення активності препарату під час пригнічення фітопатогенів на різних сільськогосподарських культурах. Для одержання біопрепарату використовують активний штам бактерій Pseudomonas aureofaciens Kluyver, штам В-306 (далі шт.306), культивування штаму-продуцента проводять на збалансованому живильному середовищі з наступним співвідношенням компонентів у г/л: автолізат дріжджів пекарських 42-48 сік цукрового сорго 9-15 K2HPO4S 0,3-0,4 NH4SO3 0,7-0,9 NaCl 0,8-1,0 вода дистильована решта рН 7,2-7,5. Одержання цільового продукту здійснюють таким чином: стерилізують 100 г живильного середовища протягом 1,5 годин при температурі 120 °C, охолоджують до 28-30 °C, поміщають 10 мл стерилізованого середовища в пробірку, вміщують туди початкову культуру, вирощують її протягом 32-35 годин при температурі 26-28 °C, потім стерилізують 10 л живильного середовища протягом 2-х годин при температурі 127 °C, охолоджують до 27-30 °C, визначають титр біомаси, поміщають у міні-ферментер на 50 л, засівають середовище 10 мл біомаси, отриманої в пробірці, вирощують культуру в мініферментері протягом 32-35 годин при температурі 28-30 °C при постійному перемішуванні і подачі стерильного повітря, проводять перевірку матеріалу на стерильність, визначають титр біомаси, проводять визначення рН середовища; 10 л напрацьованої біомаси поміщають у стерилізоване живильне середовище того ж складу, розміщене у ферментері на 1 тонну, здійснюють засів ферментера через посівний штуцер у зоні полум'я, біомасу вирощують 40-45 годин при температурі 28-30 °C при подачі повітря тиском до 0,8 атм. і одержують біомасу з 10 титром 9·10 ; у період культивування, для контролю процесу розвитку бактерій у біомасі, з апарата відбирають проби: першу - через 2 години після засіву, іншу - наприкінці вирощування культури. Відомий біопрепарат вибраний прототипом. Прототип та винахід, що заявляється, мають такі спільні ознаки: - містить активний штам бактерій Pseudomonas aureofaciens шт. 306; - Живильне середовище містить K2HPO4S, NH4SO3 та воду. Значним недоліком відомого біопрепарату "Бізар", є те, що штам бактерій Pseudomonas aureofaciens шт. 306 має низький термін активності, що зменшує строк зберігання та активність біопрепарату, яка становить 3 місяці. В основу винаходу поставлена задача створення нового, активного біопрепарату для захисту сільськогосподарських культур, у тому числі овочів, винограду, плодових дерев та зернових культур від збудників плодових та кореневих гнилей, гельмінтоспоріозів, а також хвороб, викликаних фітопатогенними грибами. Поставлена задача вирішена тим, що біопрепарат "БіоКСІН" для захисту рослин від хвороб, викликаних фітопатогенними грибами, який містить активний штам бактерій Pseudomonas aureofaciens шт. 306 на основі живильного середовища, що містить воду, сірчанокислий амоній, калій фосфорнокислий однозаміщений, наведений біопрепарат додатково містить активний 1 UA 104807 C2 5 10 15 20 25 30 35 штам бактерій Pseudomonas aureofaciens шт. 111, при співвідношенні штамів 1:1, а живильне середовище додатково містить мелясу бурякову, кукурудзяний екстракт, магній сірчанокислий з наступним співвідношенням компонентів у г/дм: меляса бурякова 20,0-25,0 кукурудзяний екстракт 10,0-15,0 MgSO4 0,2-0,4 NH4SO3 1,0-2,0 K2HPO4S 0,5-1,5 pH 7,0-7,6. Новим у винаході, що заявляється, є те, що біопрепарат "БіоКСІН" для захисту рослин від хвороб додатково містить активний штам бактерій Pseudomonas aureofaciens шт. 111, при співвідношенні штамів 1:1, а живильне середовище додатково містить мелясу бурякову, 3 кукурудзяний екстракт, магній сірчанокислий з наступним співвідношенням компонентів у г/дм : меляса бурякова 20,0-25,0 кукурудзяний екстракт 10,0-15,0 MgSO4 0,2-0,4 NH4SO3 1,0-2,0 K2HPO4S 0,5-1,5 pH 7,0-7,6. Біопрепарат "БіоКСІН" використовують таким чином: насіння або вегетуючи рослини, а також дерева і чагарники обробляють препаратом, що складається з суміші суспензій кліток штамів Pseudomonas aureofaciens шт. В-306 (IMB У-7096) і Pseudomonas aureofaciens В-111 9 (IMB У-7097), взятих у співвідношенні 1:1 з титром (2-5)×10 кл/мл при нормі витрати 10-50 мл суспензії на 1 τ насіння або 20-50 мл суспензії на 1 га в разі обробки вегетуючих рослин. Обробку дерев проводять у кількості 5-10 мл суспензії на одне плодове дерево. Обробку вегетуючих плодових дерев проводять протягом від фенофази "закінчення цвітіння" до фенофази "початок зростання плодів" включно. Біопрепарат "БіоКСІН" забезпечує захист рослин від грибних і бактерійних хвороб, дозволяє понизити норму витрати препарату в 10-100 разів в порівнянні з біопрепаратом "Бізар" (див. Патент UA № 23657, МПК А01N 63/00, опубл. 11.06.2007, Бюл. № 8) та підвищити врожайність сільськогосподарських рослин. Визначення біологічної активності біопрепарату "БіоКСІН". Приклад 1. Вивчення антагоністичної активності комплексу штамів Pseudomonas aureofaciens: шт. 111 та шт. 306. Культуру бактерій Pseudomonas aureofaciens: шт. 111 та шт. 306 висівали суцільним "газоном" на поверхню живильного агару (середа LB) і вирощували при 26 °C протягом 2-3 діб. Потім вирізували диски - агарові блочки з культурою нового комплексу штамів і розміщували на суцільний "газон" тест культури. Для отримання суцільного "газону" середу Чапека або картопляний агар засівали глибинним способом тест-культурой з розрахунку близько 100 спор на мл середи. Чашки з суцільним "газоном" тест-культури з нанесеними на нього агаровими блочками з клітками нового комплексу штамів Pseudomonas aureofaciens: шт. 111 та шт.306 поміщали в термостат при 28-30 °C на 3-6 діб. Облік проводили по зонах відсутності або придушення зростання гриба довкола диска з клітками комплексу штамів. Результати випробувань показали, що новий комплекс штамів Pseudomonas aureofaciens: шт. 111 та шт. 306 надає підвищену антагоністичну дію щодо збудника плодової гнилизни Physalospora piricola. В табл. 1 наведена антагоністична активність комплексу штамів Pseudomonas aureofaciens: шт. 111 та шт. 306. Таблиця 1 Концентрація антагоністичного мікроорганізму (кое/мл) 5 10 6 10 7 10 40 Діаметр зростання патогену (мм) шт. 111 шт.306 БіоКСІН Бізар (прототип) 23 15 23 12 4 21 7 29 17 8 Вивчення антагоністичної активності комплексу штамів Pseudomonas aureofaciens: шт. 111 та шт. 306 залежно від використовуваної концентрації проводили методом агарових блочков 2 UA 104807 C2 5 аналогічно прикладу 1. В якості тест культури використовували фітопатоген Physalospora piricola. Як порівняння вивчали антагоністичну активність "Бізар" (прототип) і штамів Pseudomonas aureofaciens: шт. 111 та шт. 306, узятих окремо. Отримані результати наведені в таблицях 1 та 2. З таблиць 1 та 2 видно, що запропонований комплекс штамів Pseudomonas aureofaciens: шт. 111 та шт. 306 в 2 рази перевищує по ефективності прототип "Бізар" і штами Pseudomonas aureofaciens: шт. 111 та шт. 306, що узяті окремо. Таблиця 2 Концентрація антагоністичного мікроорганізму (кое/мл) 6 5×10 7 1×10 7 5×10 10 15 20 Кількість доспілих спор патогену по відношенню до контролю (%) шт. 111 шт. 306 БівКСІН Бізар (прототип) 74 36 19 75 43 24 65 32 12 79 44 25 Ефективність біопрепарату "БіоКСІН" вивчали на плодових деревах (див. табл. 3). Експеримент поставлений на яблунях 10-річного віку, в кожному варіанті - 20 дерев, всі дерева зростали в однакових умовах на одній ділянці. Обробку дерев проводили обприскуванням біопрепаратом "Біоксін" 5 разів за вегетацію в період від фенофази "закінчення цвітіння" до фенофази "початок зростання плодів" включно. Як порівняння - біопрепаратом "Бізар" в ті ж 7фази. Плодові дерева обробляли біопрепаратом "БіоКСІН", з титром 5×10 кліток/мл, який перед використанням розводили у воді з розрахунку 5-10 мл на літр води для обробки одного плодового дерева яблуні. Біопрепарат "Бізар" брали в тих же самих пропорціях, що і біопрепарат "БіоКСІН", для обробки одного плодового дерева. Контрольні дерева обробляли водою. Результати експерименту представлені в таблиці 3, з якої видно, що обробка біопрепаратом "БіоКСІН", дає кращі результати ніж біопрепаратом "Бізар", при цьому при обробці біопрепаратом "БіоКСІН" збільшується вага свіжих яблук, а кількість опалих яблук, інфікованих плодів та листя зменшується. Таблиця 3 Кількість Середній Кількість Кількість Біологічна № опалих діаметр сталих БІОПРЕПАРАТ інфікованих ефективність п/п яблук (%) плоду(см) яблук плодів (%) обробки (%) 5.09.2012 14,102012 (%) 1. БіоКСІН 2,81 6,52 4,67 1,94 87,1 2. Бізар 3,21 6,32 4,78 2,35 82,2 3. Контроль 8,43 6,25 19,15 14,86 25 30 35 40 Вага Кількість 100 інфікованого яблук листя (кг) (%) 17,46 5,78 15,75 6,92 15,61 32,71 Дослідним шляхом встановлено, що оптимальне нарощування бактерій Pseudomonas aureofaciens: шт. 111, шт. 306 відбувається при оптимальній температурі (26±1)°С та рН в межі 7,0-7,6. Заявлені суттєві ознаки дозволяють отримувати технічний результат, що полягає в підвищені строку використання біопрепарату "БіоКСІН", та в підвищенні його фітопатогенної активності. Біопрепарат "БіоКСІН" містить разом два штаму Pseudomonas aureofaciens штам 306 та штам 111. Так, шт. 111 продукує комплекс феназин - карбонових кислот і сидерофори, що визначають його фунгіцидну активність, а сидорофори ще зв'язують залізо з поживним середовищем і таким чином, захищають в агробіоценозі штам 111 від ґрунтових фітопатогенів. Крім того, наявність двох штамів Pseudomonas aureofaciens у біопрепараті "БіоКСІН" приводить до зростання активності, вона більша, ніж у кожного штаму по одинці - явище "синергізму" (synergy). Механізми позитивного впливу Pseudomonas aureofaciens на рослини та ґрунт: - здатність Pseudomonas aureofaciens синтезувати регулювальників зростання рослин і покращувати фосфорне живлення рослин (5 літрів біопрепарату "БіоКСІН", замінює 60 літрів карбаміду). Фосфор присутній в ґрунті у вигляді органічних (відкладення рослинного, тваринного і мікробного походження) і неорганічних або мінеральних сполук. З цього спільного пулу фосфорних сполук лише близько 5 % доступні рослинам. Деякі мікроорганізми, особливо 3 UA 104807 C2 5 10 15 20 25 30 35 мікрорізні гриби і деякі різобактерії, здатні підсилювати надходження фосфору в рослині. Бактерії можуть використовувати дві системи підвищення концентрації екзогенного фосфату: 1) за рахунок гідролізу органічних фосфатів під дією фосфатаз; 2) шляхом розчинення мінеральних фосфатів за рахунок продукції кислот. Бактерії роду Pseudomonas aureofaciens здібні до ефективного розчинення фосфорних з'єднань, що можна використовувати для поліпшення фосфорного живлення рослин. - здатність Pseudomonas aureofaciens до фіксації атмосферного азоту і індукції в рослин стійкості до фітопатогенів. Роль Pseudomonas aureofaciens в процесах асоціативної азотфіксації, ще і велика тому, що такі штами здібні до безпосередньої стимуляції зростання рослин і за відсутності фітопатогенів. Також в теплих кліматичних зонах в ризосфері рослин азотфіксуючі псевдомонади домінують над представниками інших таксономічних груп азотфіксаторів. Навіть при 14-20 °C відбувається процес азотфіксації. Переваги меляси. Меляса є нестандартним побічним продуктом цукрової промисловості. Залишається після другого відділення кристалів цукру. Колір темно-коричневий, щільністю 1,351,40. Меляса містить 61-86 % сухих речовин, 40-55 % сахароз. Крім того, в неї є від 0,5 до 2 % інвертного цукру і 0,5-2,5 % рафінози. 1,1-1,5 % меляси складає азот, причому третя частка його знаходиться у формі бетаїну, використовувати який як джерела азоту мікроорганізми, як правило, не можуть. До складу меляси входять багато амінокислот, наприклад аспарагінова, глутамінова, лейцин, ізолейцин, тірозин, а також вітаміни групи В - біотваней, тіамін, рибофлавін, інозит, нікотинова і пантотенова кислоти, з яких особливо велике значення в мікробіологічному синтезі має біотваней. Переваги кукурудзяного екстракту. Кукурудзяним екстрактом є густа непрозора рідка маса, отримувана вакуум-випарюванням замкових вод, що є відходом кукурудзяне - крохмальне виробництво. Нижче приведений склад кукурудзяного екстракту. Вміст %: вода 30-60 спільний азот 2,7-4,5 амінійний азот 1,0-2,0 цукор, що редукують 0,1-11,0 молочна кислота 5,0-11,5 леткі кислоти 0,1-0,5 ангідрид сірчистої кислоти 0,01-0,02 зольні речовини 8,0-10,0 кальцій 0,25-0,75 мідь