Спосіб прогнозування результату екстракорпорального запліднення

Реферат: Винахід належить до медицини, зокрема до акушерства та імунології, стосується прогнозування результату екстракорпорального запліднення (ЕКЗ) у жінок з непліддям шляхом дослідження функціонального стану лімфоцитів-природних кілерів. UA 104806 C2 (12) UA 104806 C2 UA 104806 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до галузі медицини, зокрема клінічної імунології, акушерства і гінекології, та може бути використаний для прогнозування результату екстракорпорального запліднення у жінок, зокрема у жінок які багаторазово мали негативний результат екстракорпорального запліднення. Протягом досить тривалого часу були виявлені окремі імунологічні ознаки негативного результату екстракорпорального запліднення. Раніше нами показано, що експресія CXCR3 та CCR4 на Т лімфоцитах-хелперах відображає активність внутрішньоклітинних цитокінів інтерферону-гамма (Тh1) та інтерлейкіну 4 (Th2) при вагітності [Чернышов В.П., Туманова Л.Е., Судома И.А., Банников В.И. Особенности иммунной регуляции при беременности с аллогенным плодом // Журн. АМН України, 2008, т. 14, № 3. - С. 541-549; Chernyshov V.P., Tumanova L.E., Sudoma l.A., Bannikov V.I. Тр1 and Th2 in Human IVF Pregnancy with Allogenic Fetus // Am. J. Reprod. Immunol. - 2008. - 59-P. 352-358.]. Нами встановлено більш високий рівень цитотоксичності природних кілерів у жінок з ЕКЗневдачами. ЕКЗ-невдача асоціювалась з більш високою експресією CD8, CD158a та HLA-DR на природних кілерах, підвищеною експресією активаційних маркерів на Т-лімфоцитах та зниженим рівнем CCR4 та IL-4 на Т лімфоцитах [Чернышов В.П., Судома И.А., Донской Б.В., Костючик А.А., Маслий Ю.В. Значение повышенной цитотоксичности естественных киллеров при многократних неудачах экстракорпорального оплодотворения // Журн. АМН України, 2010, т. 16, № 2. - С. 288-298; Chernyshov V.P., Sudoma I.A., Dons'koi В.V., Kostyuchik A.A., Masliy Y.V. Elevated NK cytotoxicity, CD158a expression in NK cells and activated T lymphocytes in peripheral blood of women with IVF failures // Am. J. Reprod. Immunol. - 2010. - 64-P. 58-67.]. Особливу увагу у проблемі невдач екстракорпорального запліднення приділяється ролі природних кілерів [Coulam C.B., Roussev R.G. Correlation of NK cell activation and inhibition markers with NK cytotoxicity among women experiencing immunologic implantation failure after in vitro fertilization and embrio transfer // J. Assist. Reprod. Genet. - 2003. - 20-P. 58-62.]. Рецептори природних кілерів контролюють активність природних кілерів шляхом балансу сігналінга між активуючими і інгібуючими рецепторами, так званими KIR рецепторами. Цей баланс порушується при відторгненні плоду організмом матері, спонтанних абортах та неплідді [Ntrivals E.I., Bowser C.R., Kwak-Kіm J., Beaman K.D., Gilman-Sachs A.: Expression of killer immunoglobulinlike receptors on peripheral blood NK cell subsets of women with recurrent spontaneous abortions or implantation failures // Am. J. Reprod. Immunol. - 2005. - 53-P. 215-221.]. Підвищення цитотоксичності природних кілерів є незалежним фактором ризику при неплідді і не асоціюється з віком, тривалістю непліддя, депресією, лікуванням гіперпролактинемії або ендометріозу [Matsubayashi Н., Hosaka Т., Sugiyama Y., Suzuki Т., Arai Т., Kondo A., Sugi Т., Izumi S., Makino T. Increased natural killer-cell activity is associated with infertile women // Am. J. Reprod. Immunol. 2001. - 46-P. 318-322.]. Надлишок продукції інтерферону-гамма (IFN-γ) природними кілерами периферичної крові відмічено у невагітних жінок зі спонтанними абортами та невдачами екстракорпорального запліднення [Fukui F., Kwak-Kim J., Ntrivalas E., Gilman-Sachs A., Lee S.K., Beaman K. Intracellular cytokine expression of peripheral blood natural killer cell subsets in women with recurrent spontaneous abortions and implantation failures // Fertility and Sterility-2008. - 89-P. 157-165.]. Таким чином стан популяції лімфоцитів природних кілерів є критичним для успішної імплантації. Нещодавно в нашій лабораторії був винайдений новий спосіб вимірювання популяційно-функціонального показника що дуже точно характеризує актуальний стан цієї ланки. Ми показали, що інкубація з чутливою клітинною лінією К562 підвищує рівень експресії + CD69 на більшій частині популяції природних кілерів, чисельність CD69 клітин, які експресують CD69, достовірно корелює з цитотоксичністю природних кілерів [Донской Б.В., Чернишов В.П., Осипчук Д.В. Імунофенотипова характеристика двох функеционально різних субпопуляцій натуральних кілерних клітин периферичної крові людини // Фізіол. журн., 2011, Т. 57, № 1-29-35; Dons'koi В.V., Chernyshov V.P., Osypchuk D.V. Measurement of NK activity in whole blood by the CD69 up-regulation after co-incubation with K562, comparison with NK cytotoxicity assays and CD 107a degranulation assay // J.Immunol. Meth. 2011, 372 // 187-195.]. Відомий спосіб прогнозування результатів екстракорпорального запліднення у пацієнток з аутоімунними захворюваннями [RU 2345715 С2, 10.05.2008, Федеральное государственное учреждение "Уральский научно-исследовательский институт охраны материнства и младенчества Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" Способ прогнозирования результатов экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) у пациенток с аутоиммунными заболеваниями]. У пацієнтки встановлюють присутність в анамнезі аднексита, присутність в периферичній крові HLA-антигенів В18, Cw3, Cw4 та кількість тромбоцитів у коагулограмі. Підраховують прогностичний індекс F по формулі: F=1,4xX1-1,3xX2-2,4xX3 1 UA 104806 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 2,1хХ4+0,019хХ5-2,5; де X1 - наявність (або відсутність) у фенотипі жінки HLA-антигену В18 (1 чи 0); Х2 - наявність (або відсутність) у фенотипі жінки HLA-антигену Cw3 (1 або 0); Х3 наявність (або відсутність) у фенотипі жінки HLA-антигену Cw4 (1 або 0); Х4 - наявність (або 9 відсутність) в анамнезі аднексита (1 або); Х5 - кількість тромбоцитів у коагулограмі (10 /л). Якщо F більше 0, прогнозують вдалий наслідок проведення ЕКЗ та переносу ембріону; при значеннях F менше 0, прогнозують невдалий випадок ЕКЗ і не рекомендують проведення ЕКЗ на даному етапі у зв'язку з передбаченою відсутністю позитивного результату ЕКЗ. Недоліком способу є те, що даний спосіб можна використовувати тільки у пацієнток з системними автоімунними захворюваннями, які складають дуже невеличку групу серед пацієнток, які потребують ЕКЗ. Основна більшість пацієнток, які потребують ЕКЗ, не мають виразних ознак автоімунних захворювань. Крім того, даний спосіб не враховує суттєвих імунологічних змін, які притаманні жінкам з багаторазовими невдачами ЕКЗ - це і підвищення експресії активаційних маркерів на Т лімфоцитах, підвищення експресії KIR рецепторів на природних кілерах та їх цитотоксичності тощо. Тобто не враховує актуальний імунний статус пацієнтки. Найбільш близьким до об'єкта, що заявляється є спосіб прогнозування результатів екстракорпорального запліднення [пат. 54560, UA Спосіб прогнозування результату екстракорпорального запліднення], який вирішується дослідженням в венозній периферичній крові показників цитотоксичності природних кілерів, активаційних маркерів на Т лімфоцитах, Т цитотоксичних лімфоцитах, Т хелперах, природних кілерах, експресії KIR (CD158а) та CD8 на природних кілерах і реєструється в балах відхилення їх рівня від "меж ЕКЗ фертильності", які формуються в межах з персентілами Р5-Р95 (90 % даних), отриманих при дослідженні жінок з успішним екстракорпоральним заплідненням, при цьому відхилення кожного показника за "межи ЕКЗ фертильності" оцінюється в балах, притаманних окремим показникам, сума балів окремої пацієнтки виражається як прогностичний індекс; з підвищенням прогностичного індексу більше 1,5 бали вірогідність ЕКЗ успіху зменшується. Вищенаведений спосіб недостатньо відображає стан системи природних кілерів, який пов'язаний з актуальним гормональним впливом. Недоліком способу є висока сукупна собівартість та складність виконання - тому він більш придатний для пацієнток з численними негативними результатами ЄКЗ, які потребують більш детального уточнення типу імунного порушення. В основу винаходу, що заявляється, поставлено задачу створення способу прогнозування результату екстракорпорального запліднення, в якому враховано функціональний стан лімфоцитів природних кілерів, що притаманні жінкам з багаторазовими невдачами ЕКЗ, тобто як підвищені, так і знижені показники активності природних кілерів вказують на негативний прогноз у жінок, при цьому для виконання спосіб потребує значно меншої вартості, сприяє покращенню діагностики і результатів. Поставлена задача способу прогнозування результату екстракорпорального запліднення вирішується шляхом дослідження венозної крові, згідно з винаходом, досліджуються показники активації природних кілерів під впливом стимуляції пухлинною лінією К562, причому: стан активації лімфоцитів природних кілерів в умовах експерименту в діапазоні 3-9 % вважається нормальною та сприятливою для імплантації, тоді як при зниженні або збільшенні активності природних кілерів у більшому ступені вірогідність успіху ЕКЗ зменшується. Причино-наслідковий зв'язок полягає в тому, що рівні активності клітин - природних кілерів, які виходять за "межи ЕКЗ фертильності" призводять до недостатньої або надлишкової інфільтрації природними кілерами ендометрія і в результаті порушуються локальні механізми взаємодії репродуктивних, імунокомпетентних та підтримуючих клітин та збільшується імовірність ЕКЗ невдачі. Для клінічного опробування способу в ДУ "Інститут педіатрії, акушерства і гінекології НАМН України" було проведено подвійне сліпе дослідження на 84 пацієнтках у двох ЕКЗ клініках міста Києва. 2 UA 104806 C2 Процент успіху екстракорпорального запліднення в залежності від рівня ПК активності ПК статус Підвищений рівень активації (більший за 9 %) Або знижений рівень активації (менший за 3 %) Нормальний рівень активності ПК лімфоцитів (більше 3 % та менший за 9 %) n Прогностичний індекс неуспіху порівняно з нормальними пацієнтками та вірогідність % вагітності 29 OR=4,978 (95 % Confidence Interval 1,65-14,94) р=0,0032 17,2 % 55 50,9 % Примітка: OR - імовірність сприятливого результату (співвідношення шансів). 5 10 15 20 25 30 Проведені дослідження показали, що неадекватна активність лімфоцитів природних кілерів призводить до зниження проценту успіху екстракорпорального запліднення з високою вірогідністю. Спосіб прогнозування результату екстракорпорального запліднення виконується наступним чином: зразки периферичної крові пацієнток з непліддям отримують на 9-12 день менструального циклу за стимуляції гонадотропіном в ЕКЗ процедурі. До 200 мкл гепаринізованої крові додавали надлишок клітин К562 та 2 мл RPMI-1640. Після інкубації 20 годин, центрифугували (5 хв 1500 об/хв.), відбирали супернатант та мітили моноклональними антитілами. У досліді використовували моноклональні антитіла (Весton Dickinson) специфічні до CD69-FITC, CD56-PE та CD3-PECy5. Після 40 хв. еритроцити лізувалися Lysing Solution (Becton Dickinson) та відмивалися Cell Wash(Becton Dickinson). Аналіз проводився на приладі FACSCan(Becton Dickinson). В аналіз бралися 20000 лімфоцитів. Аналізувалася експресія поверхневих маркерів на популяціях ПК (CD3-CD56+) клітин. Рівень ПК активності визначали за формулою (% активованих клітин/100)* % ПК серед всіх лімфоцитів. Активність менша за 3 % вважалася зниженою, активність більша за 9 % за підвищену. Результати досліджень піддавали варіаційно-статистичній обробці за Стьюдентом з використанням програмного пакета Microsoft Excel. Клінічні приклади підрахунку прогностичного значення активності природних кілерів у пацієнток з багаторазовими невдачами ЕКЗ. Приклад 1. Пацієнтка Л. 35 років. Трубний фактор непліддя. В анамнезі 3 невдалі ЕКЗ процедури. Результати імунологічного дослідження від 20.10.2010 р: Активність природних кілерів (ПК) 2,15 (при нормі 3-9 %), тобто активність лімфоцитів - природних кілерів суттєво знижена порівняно з нормою. В результаті ЕКЗ цикл був невдалий. Приклад 2. Пацієнтка П., 34 роки. Непліддя нез'ясованого походження. В анамнезі чотири невдалі ЕКЗ цикли. Імунологічне обстеження пацієнтки було проведено 2 рази. При першому обстеженні активність ПК лімфоцитів була 11,6 %, тобто суттєво підвищена і результат в ЕКЗ циклі - чергова невдача. При другому обстеженні після лікування активність ПК лімфоцитів була 6,2 % - відповідала нормальним значенням і клінічний результат - успішна вагітність. Таким чином, вищевикладені дані свідчать про застосування даного способу з найбільшою серед існуючих способів об'єктивністю, що може використовуватися для клінічного обстеження пацієнток з непліддям, що лікуються методом екстракорпорального запліднення з метою прогнозування клінічного-результату, що значно підвищує ефективність лікування. 35 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 40 Спосіб прогнозування результату екстракорпорального запліднення (ЕКЗ) шляхом імунологічного дослідження венозної периферичної крові, який відрізняється тим, що досліджуються показники активації природних кілерів під впливом стимуляції пухлинної лінії К562, причому стан активації лімфоцитів природних кілерів в умовах експерименту під впливом стимуляції пухлинної лінії К562 в діапазоні 3-9 % вважається нормальним та сприятливим для імплантації, тоді як при зниженні або збільшенні активності природних кілерів зменшена вірогідність успіху ЕКЗ. 3 UA 104806 C2 Комп’ютерна верстка О. Рябко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4