Спосіб одержання біопрепарату “бізар” для захисту рослин від хвороб, викликаних фітопатогенними грибами

Корисна модель відноситься до галузі сільськогосподарської мікробіології, а саме, до способу одержання бактеріальних препаратів для біологічного захисту рослин і може бути використана в мікробіологічній промисловості, а також у дослідницькій практиці. Відомий спосіб одержання препарату для біологічного захисту рослин на основі штаму бактерій Bacillus Subtilis ЦМПМ В-2895 [див. наприклад, препарат для обмеження поширення і шкідництва збудника сірої гнилі суниці - Botrytis Сіnеrса, патент України №12939]. Недоліком даного способу є те, що він використовується як ліофильно висушена маса спороутворюючих бактерій; робоча суспензія препарату, що призначена для обприскування рослин досить легко седиментується, унаслідок чого рослини нерівномірно покриваються препаратом, крім того, відсутність властивостей прилипання, змочування, антиоксидантів є наслідком недостатньої фізичної і біологічної стабільності препарату, що обумовлює його незначний контакт із рослинами. Відомий спосіб одержання препарату для біологічного захисту рослин на основі штаму бактерій Bacillus Subtilis 26 D, на основі якого виготовляють фітоспорин - мікробний препарат проти бактеріальних і грибкових хвороб [див. наприклад, мікробний препарат проти бактеріальних і грибкових хвороб по а.с. СРСР №1717156]. Культура ферментує глюкозу, арабінозу, лактозу, манніт, сахарозу з одержанням кислоти, не розкладає дульцит, дає позитивну реакцію Форрес-Проскауера, гідролізує крохмаль, утилізує цитрат. Культура не росте в анаеробных умовах, не робить індол, сірководень. Штам не патогенний. Значним недоліком даного способу є те, що штам Bacillus Subtilis 26D інгібує ріст деяких симбіотичних вільноіснуючих і асоціативних азотфіксувальних бактерій, тобто виявляє бактерицидну або бактеріостатичну дію стосовно деяких виробничих штамів, що ускладнює технологію використання фітоспорина з азотфіксувальними фосфоромобілізуючими біопрепаратами. Недоліком даного біопрепарату є також його висока токсична активність стосовно як патогенної, так і агрономічно коштовної мікрофлори, що ускладнює технологію використання фітоспорина. Відомі способи одержання препаратів для біологічного захисту рослин на основі штамів Streptomyces griseovirides ATCC 39271-39273 [див. наприклад, спосіб захисту рослин від зів’янення, викликаного фітопатогенними грибами. Патент СРСР №1477231 - прототип]. Даний спосіб є ефективним для боротьби зі шкідниками (чорна ніжка, аскохитоз, сіра гнилизна), що ушкоджують такі рослини як капуста, огірки, салат, суниця, і передбачає одержання біопрепарату шля хом культивування зазначеного штаму на агаровому або рідкому живильному середовищі, що містить солодовий екстракт, дріжджовий екстракт, казеїновий гідролізат, глюкозу або лактозу, агар з наступним культивуванням вихідного продукту на рідкому середовищі в колбах, що періодично струшуються с наступним витримуванням його без струшування протягом одного тижня, у результаті чого утворюється шар міцелію з виниклими на поверхні середовища повітряними спорами, що декантують, гомогенізують у стерильній воді; суспензію центрифугують, вологу спорову масу зберігають у пластмасових мішках і перед уживанням суспензують у воді. Недолік даного способу полягає в тім, що застосування мікроорганізмів p. Streptomyces як агентів біологічної боротьби із сірою гнилизною, аскохітозом, чорною ніжкою поєднано з низкою технологічних труднощів для нарощування біомаси, зв’язаних з необхідністю застосування дорогих живильних середовищ, у т.ч. тих, що є харчовою сировиною (солодовий екстракт, казеїновий гідролізат, глюкоза або лактоза), необхідністю триразової обробки; отриманий біопрепарат недостатньо ефективний у боротьбі зі шкідниками, що уражають зернові і зернобобові культури (фузаріозні, гельмінтоспоріозні, кореневі гнилі), виноград (оїдіум, мілдью), плодові культури (борошниста роса, парша). До недоліків зазначеного способу варто також віднести порівняльну тривалість циклу одержання біопродукту, викликану недостатньою збалансованістю живильного середовища, що знижує продуктивність культури, а також виникнення проблем, зв’язаних зі збереженням спорової маси в пластмасових мішках в умовах негативної температури. Крім того, відомо, що представники зазначеної групи мікроорганізмів - стрептоміцети можуть в окремих випадках спричинити захворювання теплокровних. Метою корисної моделі є одержання у виробничому варіанті необхідної кількості біопродукту, що забезпечує ефективний захист сільськогосподарських культур, у тому числі, зернових, зернобобових, винограду, томатів, плодових (яблунь, груш) від грибних бактеріальних хвороб, що не є фітотоксичними і не токсичними для людини, теплокровних тварин, риб. В основу корисної моделі поставлено завдання створення способу одержання у виробничому варіанті з мінімальними енергетичними витратами необхідної кількості біопродукту встановленого титру, що забезпечує захист сільськогосподарських культур (зокрема зернових, зернобобових, винограду, томатів, яблунь, груш) від шкідників. Поставлене завдання вирішується тим, що в способі одержання біопрепарату „Бізар” для захисту рослин від шкідників, що включає посів клітин бактерій-антагоністів фітопатогенних грибків, культивування їх у живильному середовищі, яке містить в собі всі необхідні мікроелементи, мінеральні солі, вітаміни і стимулюючі добавки, вирощування біомаси на живильному середовищі з одержанням у промисловому варіанті цільового продукту у вигляді суспензії встановленого титру, визначення активності препарату при пригніченні фітопатогенів на різних сільськогосподарських культурах, - для одержання біопродукту використовують активний штам бактерій Pseudomonas aureofaciens Kluyver B-306, депонований у Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології НАН України 21 січня 2004 року; культивування штаму-продуцента проводять на збалансованому живильному середовищі з наступним співвідношенням компонентів у кількості г/л. автолізат дріжджів пекарських 42-48 сік цукрового сорго 9-15 K2HPО4S 0,3-0,4 NH4SО3 0,7-0,9 NaCI 0,8-1,0 вода дистильована решта рН 7,2-7,5 а одержання цільового продукту здійснюється в такий спосіб: натуральний сік цукрового сорго розводять дистильованою водою до досягнення 15% кількості в розчині, вводять у готовий розчин інгредієнти в такій послідовності: дріжджовий екстракт, попередньо в казані для варіння доведений до кипіння й охолоджений до 35°С, амоній сірчанокислий NH 4SО3, хлористий натрій (кухонна сіль) NaCl, калійфосфат K 2HPO4S, стерилізують 100г живильного середовища протягом 1,5 годин при, температурі 120°С, охолоджують до 2830°С, поміщують 10мл стерилізованого середовища в пробірку, помішують туди вихідн у культуру, вирощують 3235 годин при температурі 26-28°С, потім стерилізують 10л живильного середовища протягом 1,5 годин при температурі 127°С, охолоджують до 27-30°С, роблять перевірку на стерильність висівом культури на МЛА або МАВ, визначають титр біомаси, поміщують її в міні-ферментер на 50л, засівають середовище 10мл біомаси, отриманої в пробірці, вирощують культур у в міні-ферментері протягом 32-35 годин при температурі 28-31°С при постійному перемішуванні і подаванні стерильного повітря, проводять перевірку матеріалу на стерильність, визначають титр біомаси, проводять визначення рН середовища; 10 літрів напрацьованої біомаси помішують у стерилізоване живильне середовище того ж складу, розміщену у ферментері на 1 тонну, проводять засів ферментера через посівний штуцер у зоні полум’я, біомасу вирощують 40-45 годин при температурі 27-30°С при постійному перемішуванні і подаванні стерильного повітря тиском до 0,8атм і одержують біомасу з титром 9×1010; в період культивування, для контролю процесу розвитку бактерій у біомасі, з апарата відбирають проби: першу через 2 години після засіву, другу - наприкінці вирощування культури, крім того, для профілактики захворювань рослин, викликаних патогенними грибами, у якості антипатогенного інгредієнта використовують штам бактерій або його культуральну рідину, що містить його антипатогенні метаболіти, при цьому активний антипатогенний інгредієнт застосовують як на насіннях і на частинах рослин, що виконують функції їхнього поширення і вегетації, так і на самих рослинах. Визначення рН біопрепарату здійснюють шляхом розведення його 5см 3 у 40см 3 дистильованої води, суспензію розмішують на магнітній мішалці і проводять вимір рН за інструкцією до приладу. Дослідним шляхом встановлено, що оптимальне нарощування біомаси відбувається при рН 7,3-7,6, в оптимальному інтервалі температур - від 31-36°С. Новизна способу характеризується використанням у якості продуцента нового штаму бактерій Psudomonas aureofacine Kluyver B-306, а також вибором для його реалізації живильного середовища зі збалансованими елементами харчування з введенням у нього дріжджів хлібопекарських, а також соку цукрового сорго в концентрації 15г/л, що є стимулюючою добавкою й у сполученні з іншими компонентами живильного середовища у зазначеному співвідношенні значно підвищує обмінний процес на рівні клітин при їхньому вирощуванні, сприяє їхньому розвиткові, а головне, їхньому визріванню; це забезпечило найбільший вихід біомаси з підвищенням її титру до 9×1010 і дозволило використовувати те саме живильне середовище на всіх стадіях виробництва біомаси; крім того, використання для засіву і вирощування біомаси на проміжній стадії міні-ферментера замість традиційних колб і качалок, дозволило при кращому перемішуванні середовища повітрям і збільшенні часу її вирощування одержати культуру з необхідним титром 9×1010. Порівняльний аналіз способу, що заявляється, з іншими відомими з науково-технічної і патентної літератури дозволяє виявити ознаки, які відрізняють рішення, яке заявляється, від прототипу, що дає можливість авторам зробити висновок про відповідність ознак, які заявляються, критерієві «істотні відмінності», що визначає новизну винаходу. Базовим показником, по якому йшла оптимізація живильного середовища, був титр препарату при закінченні кожної стадії його одержання. Статистичній обробці підлягала біомаса після вирощування у пробірці, на виході з міні-ферментера й у процесі вирощування в ферментері. Визначення титру препарату проводили методом, заснованому на підрахунку колоній, що виросли на живильному агарі, при засіві в чашки Петри суспензії різних концентрацій препарату у вигляді послідовних десятикратних розведень, виготовлених на середовищі МПА. Склад середовища: пептон,г 10 натрій хлористий, г 5 агар мікробіологічний, г 13 м’ясний бульйон, см 3 1000 рН середовища 7,4 Усі компоненти середовища поміщали в колбу, рН середовища доводили до 7,4 і стерилізували протягом 30хв. при температурі 120°С. Із середньої проби препарату готували ряд послідовних розведень за загальноприйнятою методикою. Використовували стерильну дистильовану воду. Під час проведення іспитів стерильною піпеткою 1см 3 суспензії розведень 10-8,10-9, 10-10 був нанесений на поверхню середовища (МП А) трьох чашок Петри. Засіяні чашки витримували в термостаті при температурі 28°С протягом 50-70 годин. Кількість життєздатних бактеріальних клітин (Т), млрд/см 3 обчислювали за формулою: Т=П/Р, де П - число колоній (середня кількість з 3 чашок Петри) Р - розведення, узяте для посіву. Приклад 1. Результати визначення титру к ультури після її вирощування представлені в таблиці 1. Таблиця 1 Компоненти живильного середовища г/л Автолізат дріжджів Сік цукрового K2HPО4S NH4SО3 пекарських сорго 38 5 0,2 0,5 46 8 0,4 0,8 52 11 0,5 1,1 рН 0,7 0,1 1,2 Титр, млрд/см 3 7,4 NACl 9×102 9×103 9×102,5 У міні-ферментер здійснювався засів культурою, вирощеної в пробірці зі співвідношенням компонентів, що забезпечили її ви хід з максимальним титром 9×103. Приклад 2. Результати визначення титру культури після вирощування її в міні-ферментері при різних часових інтервалах і оптимальній температурі 30°С представлені в таблиці 2. Таблиця 2 Живильна середа Компоненти Автолізат дріжджів пекарських Сік цукрового сорго К2HPО4S NH4SО3 NaCl Вода дистильована рН Кількість, г/л Час Температура, °С. вырощування , год. 26 47,0 9,0 0,4 0,8 0,95 решта 7,3 Титр, млрд/см 3 30 9×108 30 9×1010 31 9×109 В ферментері здійснювався засів культури із міні-ферментера с титром 9×1010. У процесі культивування біомаси у ферментері відбиралися проби: перша - через 2 години після засіву, друга - наприкінці вирощування культури. Визначення титру препарату проводилося за вищенаведеною методикою. Величина титру продукту з проби, узятої у ферментері через 2 години культивації, наприкінці її складала 9×1010. Біопрепарат має наступну характеристику. Зовнішній вигляд, колір і запах препарату «Бізар» визначають у момент узяття проб - органолептично. «Бізар» за зовнішнім виглядом і кольором представляє рідину з кольором від ясно-жовтого до коричневожовтогарячого з запахом живильного середовища. Культурально-морфологичні особливості біопрепарату. Біопрепарат вирощений при температурі 29°С протягом 24 годин на МПА утворює однорідну суміш і слабкий дрібнодисперсний осад. Перегляд на предметному склі суспензії з добової культури, пофарбованої по Граму (перегляд при збільшенні 15х40 не менш 10 полів зору по діагоналі) показав, що бактерії Pseudomonas aureofaciens - добре розвинуті грамнегативні, пофарбовані в ясно-коричневий колір палички середньої довжини і товщини з округлими полями розміром від 0,4 до 4-9мк; бактерії добре ростуть на печінково-пептоновому бульйоні й інших середовищах, що мають нейтральну або злегка лужну реакцію (рН 7,3-7,6) в аеробних умовах при температурі 34°С. Фізіолого-біохімічні ознаки. Факультативний анаероб, нерухомий, каталізонегативний, не відновлює нітрити і нітрати, не розріджує желатини, слабко гідролізує зскулін, не утворює аміак з аргініна, не виживає після прогрівання при температурі 65°С, росте при температурі від 26 до 52°С; оптимальна температура росту 33-36°С, оптимальне рН 7,3-7,6. Як джерело вуглецю використовують сік цукрового сорго, як джерело азоту використовують NH4SO3; культура добре росте на концентрованих середовищах, що містять до 15г/л соку цукрового сорго, культура резистентна до кисню, не утрачає свою активність при збереженні біопрепарату тривалий час. Біопрепарат не токсичний для людини, теплокровних, у застосовуваній концентрації не має фітотоксичності, не впливає на запах і смак одержуваної продукції. Після вирощування біопрепарату на культуральному середовищу (МБП із відповідними добавками) протягом 2-х тижнів при температурі 32°С у термостаті одержують фільтрат і досліджують його токсичність у дослідах на білих мишах вагою 17-20г. Фільтрат уводять перорально через зонд або внутрішньочеревними ін’єкціями. Спостереження за тваринами проводили щодня протягом 15 днів після закінчення ін’єкції або перорального введення. У період спостереження усі тварини були активні, добре поїдали харчові раціони, фізіологічні відправлення в них не порушувалися, поведінкові реакції були звичайними, змін з боку вовняного покриву не відзначалося. Усі піддослідні миші після закінчення терміну спостереження були убиті, розітнуті і їхні органи піддані мікроскопічному вивченню. Результати розтину показали: серце - звичайної форми і величини, легені в обсязі не збільшені, частки легко відокремлюються друг від друга, поверхня гладка, спайок не відзначається. Шлунок, петлі тонкого і товстого кишечнику зовні представляються звичайними, при розтині малюнок слизуватої не змінений. Печінка темночервоного кольору, середнього наповнення, не збільшена. Частки відділені друг від друга, поверхня гладка. Нирки звичайних розмірів і форми. Поверхні гладкі, на розрізі чіткий малюнок коркової і мозкової речовини. Селезінка не збільшена, щільної консистенції, на розрізі пульпа помірно повнокровна, темно-червоного кольору. Результати дослідження токсичності фільтрату культури Pseudomonas aureofaciens Kluyver, штам В-306 після росту на середовищі Гауза №2 представлені в таблиці 3 Таблиця 3 Кількість мишей у досліді 10 10 10 10 Доза,мл Шлях уведення 0,4 0,4 0,4 0,4 Внутрішньочеревинно Підшкірно Підшкірно Перорально Курс уведенн я 1 4 1 4 Занедужало Загинуло Вижило 0 0 0 0 0 0 0 0 10 10 10 10 Таким чином, уведення мишам фільтрату культури Pseudomonas aureofaciens Kluyver, штам В-306 не викликало у тварин патологічного процесу, який реєструвався клінічно або при мікроскопічному вивченні внутрішніх органів тварин. Наведені дані дають підставу вважати, що біопрепарат «Бізар» є нетоксичним, тобто не є патогенним для теплокровних тварин. Визначення біологічної активності препарату «Бізар». Готують розчин препарату з розрахунку норми витрати на обробку 1га площі посіву. Частку сільськогосподарської культури з захворюванням поміщають у чашк у Петри, наносять на неї препарат, помішують в автоклав і витримують у заданій концентрації: виноград - протягом 45 годин пшеницю, жито, овес, ячмінь - протягом 25 годин помідори, огірки - протягом 35 годин Після чого визначають відсоток знищення хвороботворних організмів за визначений інтервал часу. «Бізар» застосовують методом обприскування сільськогосподарських культур, їхніх насінь водною суспензією препарату. Приклад 3. Результат знищення хвороботворних організмів за визначений інтервал часу представлений у таблиці 4. Таблиця 4 Культура Об’єкт впливу Деревина, листи Виноград Пшениця Ячмінь Жито, овес Томати Огірки Семена, коренева система, стебло, колосся Поверхня, коренева система Досліджуваний вид хвороби Мілдью, оїдіум, сірі плями листа, гроноподібна гнилизна Чорна головешка, борошниста роса, коренева і стеблова гнилизна, стеблова іржа Фітофтороз, парша, аскохитоз, борошниста роса, чорна ніжка Норма Знищення Час витрати хворобо творних обробки, препарату, мікроорганизмів, год. л/га % 4,0 0,5 80-85 4,5 75-80 5,5 6,0 5,2 80-85 0,5 6,2 80-85 74-80 80-85 84-92 7,0 8.0 7,0 0,5 85-90 75-85 8,0 82-86 9,0 6,0 85-90 90-92 З таблиці 3 видно, що оптимальними концентраціями біопродукту для максимального знищення хвороботворних мікроорганізмів на різних сільськогосподарських культурах є: для винограду 5,5л/га для пшениці, ячменя, жита, вівса 7л/га для томатів, огірків 9л/га Як показало тривале спостереження за рослинами, кількість хвороботворних мікроорганізмів, що залишилися, при зазначеному часі і числі обробок, не роблять негативного впливу на величину врожайності приведених сільськогосподарських культур. Приклад 4. Вплив обробки сільськогосподарських культур розчином препарату представлений в таблиці 5. Таблиця 5 Площа обробки, га 5,0 6,5 60 Виноград Пшениця Ячмінь Жито, овес Томати Огірки Кількість препарату, л/га 400 1000 Культура Підвищення Число обробок врожайності після за сезон обробки препаратом, % 4-5 30-36 2 26-31 9,0 5-6 31-36 Приклад 5. Дія штаму АТСС 39271 актиноміцетового гриба Стрептоміцес і біопрепарату «Бізар» на зернові культури шляхом культивування насінь ячменя Karri, що спочатку занурювали у водну суспензію зазначеного актиноміцетового гриба і суспензію біопрепарату «Бізар», а потім висушували. Результати представлені в таблиці 6. Таблиця 6 Вплив обробки насінь ячменя актиноміцетовьім грибом Стрептомицес і біопрепаратом «Бізар» на врожай зерна при різних типах сівозміни Рослини в попередні роки 1 1 рік ячмінь + земля під паром 2 рік ячмінь + земля під паром 3 рік ячмінь + земля під паром 6 рік ячмінь Насіння, оброблене штамом Стрептоміцес АТС 39271 Без обробки Додатковий врожай, врожай, кг/га, (%) (прототип), кг/га 2 3 4755 +837(17,6) Насіння, оброблене біопрепаратом «Бізар» Без обробки врожай, кг/га Додатковий врожай, кг/га,(%) 4 3900 5 +930(24,5) 4500 +948(21,0) 3600 970 (27%) 4563 4527 +102 (2,2) +285 (6,3) 3700 3650 145 (4,0%) 330 (9,0%) За даними таблиці видно, що при обробці насінь ячменю суспензією препарату «Бізар» врожайність вище, ніж при обробці тих же насінь суспензією штаму актиноміцету. Приклад 6. Гнітюча дія на захворювання, що уражає основу огірків і спричинене грибами Fusarium oxysporum штаму актиноміцету АТСС 39271 і біопрепарату «Бізар». Инокулювання здійснювали шляхом обприскування кореневої системи рослини. Результати приведені в таблиці 7. Таблиця 7 Поширення захворювання Індекс 0-3 Здорові рослини, % Необроблені 1,37 32 Оброблені штамом Стрептоміцес АТС 39271 1,07 50 Оброблені препаратом «Бізар» 1,03 78 З таблиці видно, що при обробці кореневої системи огірків препаратом «Бізар» захворюваність культури нижче, ніж при обробці її штамом стрептоміцес АТС 39271. Економічний ефект від використання препарату «Бізар» забезпечується за рахунок того, що замість солодового екстракту - одного з основних компонентів живильного, середовища на якому культивують штам Streptomyces griseovirides ATCC 3921 для одержання біопрепарату, використовуваного в прототипі для захисту рослин - у біопрепараті «Бізар» використовується сік цукрового сорго. Ціна 1кг солодового екстракту - 4грн. 20коп. Ціна 1л соку цукрового сорго - 3грн. 20коп. Витрата солодового екстракту на 1т біопрепарату - 10кг. Витрата соку цукрового сорго на 1т біопрепарату - 10л. Вартість солодового екстракту для виробництва 1 тонни біопрепарату - 42грн., а вартість соку цукрового сорго - 32грн. Отже, тільки за рахунок заміни одного з компонентів живильного середовища для виробництва 1 тонни біопрепарату досягається економія 10грн. Таким чином, запропонований спосіб дозволяє в промисловому варіанті одержати без застосування дорогих елементів живильного середовища біопрепарат для захисту ряду сільськогосподарських культур від грибкових хвороб.