Спосіб одержання сипкого комплексного бактеріального препарату для рослинництва

Реферат: Винахід належить до способу одержання сипкого бактеріального препарату для рослинництва, де до стерильного вермикуліту додають змішану суспензію азотфіксувальних бактерій Azotobacter vinelandii ІMB В-7076 і фосфатмобілізувальних бактерій Bacillus subtilis ІMB В-7023 у співвідношенні 1:1 та інкубують одержану суміш при 28 °C, та до продукту, отриманого зазначеним способом. UA 106135 C2 (12) UA 106135 C2 UA 106135 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до біотехнології, а саме до виробництва бактеріальних препаратів для підвищення урожайності рослин. Такі препарати мають ряд переваг перед суспензіями мікроорганізмів та іншими формами готового продукту. Це стабільність складу, зручність зберігання, транспортування, дозування і використання. Найбільш поширеними є бактеріальні препарати на основі окремих культур мікроорганізмів, що здатні стимулювати ріст рослин. їх недоліком є те, що вони проявляють свій вплив завдяки дії одного чи декількох механізмів. Найбільш перспективними є комплексні препарати, виготовлені на основі двох чи декількох видів мікроорганізмів [Курдиш, 2010]. Як правило, ці препарати пропонують у вигляді суспензій [Патент Росії № 2127509], в яких чисельність життєздатних клітин швидко знижується [Каменєва і співавт., 2008]. Найбільш близькими до запропонованих є гранульований комплексний препарат [Курдиш з співав., 2003]. Однак його застосування для бактеризації зернових рослин потребує суспендування гранул, що викликає певні незручності для працівників сільського господарства. Задачею винаходу є розробка ефективного сипкого комплексного препарату. Поставлена задача вирішується тим, що препарат виготовляється у вигляді композиту бактерій на сипкому носії. Цей носій інокулюють композицією високоефективних азотфіксувальних і фосфатмобілізувальних штамів бактерій. Поставлена задача вирішується тим, що як носій для виготовлення комплексного бактеріального препарату використовують вермикуліт. Це легкий, сипкий природний мінерал групи гідрослюд, біологічно стійкий, не канцерогенний. Характеризується високою вологоємністю, стабільний при тривалому зберіганні, легко піддається стерилізації. Цей носій інокулюють композицією азотфіксувальних бактерій Azotobacter vinelandii ІMB В-7076 і фосфатмобілізувальних бактерій Bacillus subtilis ІMB В-7023. Штам азотфіксувальних бактерій Azotobacter vinelandii ІMB В-7076, депонований в Депозитарії мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, штам фосфатмобілізувальних бактерій Bacillus subtilis ІMB В-7023, депонований в цій же установі. Ці штами використовуються для одержання комплексного гранульованого бактеріального препарату, внесення якого в агроекосистеми дозволяє значно підвищити врожайність ряду культурних рослин (Курдиш, 2010). Суть винаходу полягає в тому, що стерилізований вермикуліт інокулюють композицією бактерій. Отриманий композит інкубують протягом певного часу при відповідних температурах 9 для досягнення в ньому чисельності життєздатних бактерій кожного штаму на рівні не нижче 10 клітин/г. Для вирішення поставленої задачі вермикуліт стерилізували тричі при 1,5 атм протягом 30 хв. Після цього висушували протягом 1 год. в сушильній шафі при температурі 160 °C. Вермикуліт інокулювали змішаною суспензією бактерій Azotobacter vinelandii і Bacillus subtilis, виготовленою шляхом внесення цих бактерій в стерильне середовище наступного складу (г/л): меляса - 32,5; кукурудзяний екстракт - 4,5; K2НРО4×3Н2О - 0,25 г; KН2РО4-0,25; MgSO4×7H2O-0,3; NaCl-0,3;СаСО3-3,0; рН 7,0-7,2 Для цього отримували суспензії обох вказаних штамів бактерій шляхом їх періодичного культивування при перемішуванні (240 об/хв) протягом 24 год. в колбах Ерленмейера об'ємом 750 мл, що містили по 100 мл оптимізованого для кожного штаму рідкого середовища. Azotobacter vinelandii ІMB В-7076 вирощували в рідкому середовищі з мелясою наступного складу (г/л): меляса - 50; кукурудзяний екстракт - 7,0; K2НРО4×3Н2О - 0,3 г; KН2РО4-0,3; MgSO4×7H2O-0,3; NaCl-0,3; СаСО3-3,0; рН 7,0-7,4 [Патент України № 44883]. Це середовище інокулювали 1 мл суспензії, отриманої шляхом змиву з агаризованого середовища Ешбі наступного складу (г/л): сахароза - 20; K2НРО4×3Н2О - 0,2; MgSO4×7H2O-0,2; NaCl-0,2; K2SO40,1; СаСО3-5; агар - 15; дистильована вода - 1 л; В це середовище вносили 1 мл розчину мікроелементів (за Федоровим) наступного складу: Н 3ВО3-5,0; (NH4)2MoO4×2H2O-5,0; ZnSO4×7H2O-0,2; KІ - 0,5; NaBr-0,54 Al2(SO4)3×18H2O-0,3; дистильована вода 1 л; рН 7,2-7,3. Бактерії Bacillus subtilis IMB B-7023 вирощують в середовищі наступного складу (г/л): меляса - 15; кукурудзяний екстракт - 2,0; K2НРО4×3Н2О - 0,2 г; KН2РО4-0,2; MgSO4×7H2O-0,3; NaCl-0,3; СаСО3-3,0; рН 6,7-7,2 [Патент України № 42415]. Для цього середовище інокулювали 1 мл суспензії бацил, виготовленої за стандартом щільності 10 одиниць після їх вирощування протягом 24 год. на картопляному агарі. Культуральну рідину, отриману в результаті вирощування вказаних двох штамів бактерій з 9 вмістом клітин 1×10 в 1 мл, розводили основним середовищем у співвідношенні 1:100-1:10000 5 7 для одержання чисельності кожного штаму 1×10 -1×10 клітин в 1 мл. Одержану суспензію в кількості 100 мл вносили асептично в 40 г стерильного вермикуліту і інкубували за температури 9 28 °C протягом 1-7 діб з метою одержання препарату, що містить в одному грамі не нижче 1×10 кл кожного штаму. 1 UA 106135 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Для визначення чисельності життєздатних бактерій в препараті, відбирали 10 г препарату і додавали 90 мл фізіологічного розчину (рН 7,0), перемішували протягом 30 хв на качалці (240 об./хв). З отриманої суспензії методом десятикратних розведень відбирали 0,1 мл з відповідного розведення і висівали на поверхню агаризованого середовища Ешбі (для азотобактера) і картопляного агару (для бацил) в чашки Петрі. Після їх інкубування при 28 °C протягом 3-5 діб підраховували чисельність колоній, що дозволяло визначити кількість життєздатних бактерій у виготовленому сипкому бактеріальному препараті. Суть виходу підтверджується наступними прикладами: Приклад 1 Отримані суспензії Azotobacter vinelandii IMB В-7076 і Bacillus subtilis IMB В-7023 вносили в основне середовище з мелясою у співвідношенні 1:100-1:10000 для одержання кількості клітин 5 7 кожного штаму 1×10 -1×10 в 1 мл. Одержану суспензію об'ємом 100 мл вносили асептично в 40 г стерильного вермикуліту і інкубували за температури 28 °C протягом 1-7 діб. Встановлено, що інкубування за цих умов вермикуліту, інокульованого азотобактером на 5 5 рівні 5,0×10 кл/г та бацилами - 6,5×10 кл/г, протягом 10 діб супроводжується наростанням 9 чисельності кожного з цих штамів до 10 кл/г (табл. 1). При підвищенні кількості кожного штаму 6 6 бактерій на початку експерименту до 10 кл/г, а також при чисельності азотобактера 10 і бацил 5 9 10 кл/г уже після 5 діб інкубування чисельність бактерій в препараті досягала 10 кл/г. 7 Підвищення вмісту в вермикуліті кожного штаму на початку досліду до 10 кл/г дозволяє вже 9 після 48 годин інкубування отримати препарат з вмістом бактерій 10 кл/г. Такий препарат готовий до застосування в рослинництві чи може зберігатись при температурі 6-10 °C до використання. Приклад 2 Після культивування бактерій Azotobacter vinelandii IMB В-7076 і Bacillus subtilis IMB В-7023 при температурі 28 °C протягом 1-7 діб, препарат зберігали при температурах 6-10 °C та 2023 °C. Через певні проміжки часу визначали кількість мікроорганізмів в препаратах вищеописаним методом. Нами встановлено, що отримані препарати, на основі бактерій Azotobacter vinelandii IMB В7076 і Bacillus subtilis IMB В-7023 добре зберігаються як при температурі 6-10 °C, так і при 2023 °C (табл. 2). Так, на другий місяць зберігання, кількість бактерій в препараті є на досить 9 високому рівні, як для Azotobacter vinelandii IMB В-7076-10 , так і для Bacillus subtilis IMB В-70239 10 при обох температурах. Через шість місяців зберігання препарату при температурі 6-10 °C, спостерігалося 8 зменшення чисельності клітин Azotobacter vinelandii до 10 , а Bacillus subtilis підтримувалося на 9 рівні 10 , однак при температурі 20-23 °C - обидві культури мали дев'ятий степінь. Після 1 року 9 8 зберігання, кількість клітин Bacillus subtilis становила - 10 кл/г, a Azotobacter vinelandii 10 кл/г, як при температурі 6-10 °C, так і при 20-23 °C. Так, як бактеріальні препарати в більшості випадків мають термін зберігання від одного до двох місяців, то запропонований нами препарат можна зберігати протягом року та використовувати як описано в прикладі 3, при обробці пшениці різних сортів. Приклад 3 Отриманий сипкий комплексний бактеріальний препарат, що зберігався протягом 6 місяців, помітно впливав на розвиток рослин. Після обробки протруєного насіння озимої пшениці сорту Царівна препаратом, показники його проростання збільшуються на 17,5-26,2 %, схожості на 15,3-21,8 %, а довжини паростків на - 13,5 % у порівнянні з контролем. Препарат, що зберігався 6 місяців, може бути рекомендований для застосування при обробці насіння перед висівом його у ґрунт (табл. 3). Обробка насіння пшениці ярої сорту Рання 2010 сипким комплексним бактеріальним препаратом (6 місяців зберігання) збільшує показники проростання на 17,5-26,2 %, схожості на 15,3-21,8 %, довжини паростків - 13,5 %, у порівнянні з контролем. Сипкий комплексний препарат позитивно впливав на проростання та схожість насіння ярої пшениці сорту Рання і може бути рекомендований для застосування при обробці насіння перед висівом у ґрунт (табл. 4). В табл. 5, 6, показано застосування сипкого комплексного бактеріального препарату, який мав термін зберігання 12 місяців. Так, при обробці насіння ярої пшениці сорту Херсонська спостерігалося збільшення проростання насіння на 5,0-17,3 %, а схожість насіння - 28 %, у порівнянні з контролем. При обробці насіння озимої пшениці сорту Подолянка сипким комплексним препаратом, показано його позитивний вплив на проростання насіння - 18,555,5 %, схожість 23,8-60,0 % та довжину паростків - 4,0-9,6 %, в порівнянні з контролем. 2 UA 106135 C2 Таким чином, сипкий комплексний бактеріальний препарат позитивно впливав на проростання та схожість насіння пшениці сортів Херсонська, Подолянка, Царівна та Рання 2010, але кількісні показники цієї дії залежать від сорту насіння даного виду рослин. Таблиця 1 Ріст бактерій A. vinelandii та В. subtilis у вермикуліті залежно від початкового їх вмісту в суспензії і тривалості інкубування A. vinelandii IMB В-7076 + В. subtilis IMB В7023 Початкова 5 A(5,0±0,1)×10 5 B(6,5±0,1)×10 6 A(5,0±0,1)×10 6 B(6,5±0,1)×10 6 A(1,0±0,05)×10 5 B(1,1±0,07)×10 7 A(1,0±0,02)×10 7 B(5,1±0,5)×10 Кількість бактерій у препараті, клітин/г Після 2-х діб Після 5 діб Після 10 діб 8 8 9 А(3,4±0,1)×10 А(3,5±0,07)×10 А(3,8±0,2)×10 8 9 9 В(5,5±0,3)×10 В(4,5±0,4)×10 В(5,2±0,1)×10 8 9 9 А(6,1±0,2)×10 А(4,3±0,2)×10 А(5,7±0,1)×10 8 9 9 В(7,2±0,07)×10 В(6,2±0,1)×10 В(8,1±0,1)×10 8 9 9 А(4,3±0,1)×10 А(3,4±0,1)×10 А(3,8±0,05)×10 8 9 9 В(4,9±0,2)×10 В(7,2±0,2)×10 В(8,2±0,1)×10 9 10 10 А(1,0±0,1)×10 А(1,4±0,09)×10 А(1,4±0,02)×10 9 10 10 В(1,1±0,05)×10 В(1,6±0,01)×10 В(1,7±0,03)×10 Примітка: Препарат інкубували при 28 С; A-A. vinelandii IMB В-7076; В - В. subtilis IMB В-7023 5 Таблиця 2 Залежність чисельності життєздатних клітин B.subtilis IMB В-7023 і A.vinelandii IMB В-7076 у сипкому комплексному бактеріальному препараті від тривалості та температури зберігання Термін зберігання, місяць 0 2 6 12 Клітин в 1 г препарату 6-10 °C 20-23 °C 9 9 А(4,3±0,2)×10 А(4,3±0,2)×10 9 9 В(6,2±0,1)×10 В(6,2±0,1)×10 9 9 А(2,4±0,7)×10 А(2,5±0,2)×10 9 9 В(9,7±0,4)×10 В(6,0±0,4)×10 8 9 А(1,9±0,3)×10 А(2,0±0,2)×10 9 9 В(8,1±0,3)×10 В(2,4±0,3)×10 8 8 А(1,2±0,7)×10 А(6,6±0,2)×10 9 9 В(1,6±0,1)×10 В(1,4±0,05)×10 Примітка: А - A.vinelandii IMB В-7076; В - B.subtilis IMB В-7023 3 UA 106135 C2 Таблиця 3 Вплив обробки насіння озимої пшениці сорту Царівна сипким комплексним бактеріальним препаратом на проростання, схожість та розвиток паростків Варіанти досліду Контроль Вермикуліт:вода 1:10 Препарат: вода 1:10 1:50 1:100 Проростання насіння % до шт. контролю 34,3±2,0 100,0 Схожість насіння % до шт. контролю 35,3±2,9 100,0 Довжина паростків % до см контролю 5,2±0,3 100,0 37,7±0,4 109,9 37,3±0,8 105,7 5,1±0,2 98,1 43,3±1,6 41,0±2,6 40,3±1,1 126,2 119,5 117,5 43,0±1,2 42,2±2,5 40,7±1,5 121,8 119,0 115,3 5,9±0,2 5,9±0,7 5,91±0,2 113,5 113,5 113,6 Примітка: 1. Препарат зберігали протягом 6 місяців; 9 2. Кількість клітин бактерій в 1 г препарату B.subtilis ІMB В-7023 - (2,4±0,3)×10 кл, A.vinelandii 9 ИМВ В-7076 - (2,0±0,2)×10 кл; 3. Контроль - насіння, оброблене водогінною водою. Таблиця 4 Вплив обробки насіння ярої пшениці Рання 2010 сипким комплексним бактеріальним препаратом на проростання, схожість та розвиток паростків Варіанти досліду Контроль Вермикуліт:вода 1:10 Препарат:вода 1:10 1:50 1:100 Проростання насіння % до шт. контролю 34,3±2,0 100,0 37,7±0,4 109,9 43,3±1,6 126,2 41,0±2,6 119,5 40,3±1,1 117,5 Схожість насіння % до шт. контролю 35,3±2,9 100,0 37,3±0,8 105,7 43,0±1,2 121,8 42,2±2,5 119,0 40,7±1,5 115,3 Довжина паростків % до см контролю 5,2±0,3 100,0 5,1±0,2 98,1 5,9±0,2 113,5 5,9±0,7 113,5 5,91±0,2 113,6 Примітка: 1. Контроль - насіння, оброблене водогінною водою; 9 2. Кількість клітин бактерій в 1 г становила: B.subtilis ІMB В-7023 - (2,4±0,3)×10 кл, A.vinelandii 9 ІMB В-7076 - (2,0±0,2)×10 кл; 3. Термін зберігання препарату 6 місяців. 4 UA 106135 C2 Таблиця 5 Вплив обробки насіння ярої пшениці сорту Херсонська сипким комплексним бактеріальним препаратом на проростання, схожість та розвиток паростків Варіанти досліду Контроль Препарат:вода 1:10 1:50 1:100 Проростання насіння % до шт. контролю 19,6±1,7 100,0 Схожість насіння % до шт. контролю 14,0±2,1 100,0 Довжина паростків % до см контролю 11,0±0,7 100,0 20,3±2,5 113,7 14,3±2,2 102,0 11,0±0,08 98,1 22,6±2,8 18,0±0,4 105,0 117,5 18,0±1,2 13,0±3,1 128,0 92,0 10,2±0,2 10,2±0,2 92,3 109,6 Примітка: 1. Контроль насіння, оброблене водогінною водою; 9 2. Кількість клітин бактерій в 1 г препарату становила: B.subtilis ІMB В-7023 - (1,4±0,05)×10 кл, 8 A.vinelandii ІMB В-7076 - (6,6±0,2)×10 кл 3. Термін зберігання препарату 12 місяців. Таблиця 6 Вплив обробки насіння озимої пшениці сорту Подолянка сипким комплексним бактеріальним препаратом на проростання, схожість та розвиток паростків Варіанти досліду Контроль Препарат:вода 1:10 1:50 1:100 Проростання насіння % до шт. контролю 27,0±5,0 100,0 Схожість насіння % до шт. контролю 21,0±1,7 100,0 Довжина паростків % до см контролю 12,2±1,0 100,0 32,0±3,1 118,5 26,0±0,7 123,8 12,8±0,3 104,0 42,0±3,5 33,6±4,6 155,5 124,4 33,0±5,9 27,0±4,1 160,0 128,5 12,7±0,4 12,4±0,3 101,6 109,6 Примітка: 1. Контроль насіння, оброблене водогінною водою; 9 2. Кількість клітин бактерій в 1 г препарату становила: B.subtilis ІMB В-7023 - (1,4±0,05)×10 кл, 8 A.vinelandii ІMB В-7076 - (6,6±0,2)×10 кл 3. Термін зберігання препарату 12 місяців. 5 10 15 Джерела інформації: Деклараційний патент на винахід, Україна № 57269.2003. Спосіб одержання гранульованих бактеріальних препаратів Курдиш І. К., Рой А.О., Бега З.Т. Патент на корисну модель № 44883. Україна. 2009. Поживне середовище для культивування азотфіксувальної бактерії Azotobacter vinelandii ІMB В-7076 для одержання бактеріальних добрив Царенко І.Ю., Курдиш І.К. Патент на корисну модель № 42415. Україна. 2009. Поживне середовище для отримання біомаси бактерій роду Bacillus. Царенко І.Ю., Рой А.О., Курдиш І.К. Курдиш І.К. Інтродукція мікроорганізмів у агроекосистеми. К.: Наукова думка, 2010. – 253 с. Патент России № 2127509. A01G7/00. Способ выращивания растений/ Е.В. Чекасина, И.В. Егоров, Н.К. Булгаков. - Опубл. 20.03.1999, Бюл. № 6. 20 5 UA 106135 C2 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 10 15 1. Спосіб одержання сипкого бактеріального препарату для рослинництва, який відрізняється тим, що до стерильного вермикуліту додають змішану суспензію азотфіксувальних бактерій Azotobacter vinelandii ІMB В-7076 і фосфатмобілізувальних бактерій Bacillus subtilis ІMB В-7023 у співвідношенні 1:1 та інкубують одержану суміш при 28 °C. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що початковий вміст кожного з вказаних штамів 7 бактерій становить 10 КУО/г, а час інкубування - 2 доби. 3. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що початковий вміст кожного з вказаних штамів 6 бактерій становить 10 КУО/г, а час інкубування - 5 діб. 4. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що початковий вміст кожного з вказаних штамів 5 бактерій становить 10 КУО/г, а час інкубування - 7 діб. 5. Продукт, який складається з вермикуліту та суміші азотфіксувальних бактерій Azotobacter vinelandii ІMB В-7076 і фосфатмобілізувальних бактерій Bacillus subtilis ІMB В-7023 при вмісті 9 10 КУО/г кожного штаму бактерій. Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6