Штам бактерій azotobacter vinelandii 7-кв для одержання бактеріального добрива для рослинництва

Штам бактерій Azotobacter vinelandii ІMB B7076 для одержання бактеріального добрива для рослинництва. Винахід відноситься до мікробіологічних засобів підвищення врожайності культурних рослин за рахунок поліпшення азотного та фосфорного живлення і стосується виділення нового штаму, що фіксує азот, призначеного для виготовлення бактеріального препарату. Метою винаходу є одержання нового штаму, який характеризується високою активністю фіксації атмосферного азоту, стійкістю при довготривалому культивуванні в лабораторних умовах, росте на важкорозчинних сполуках фосфору та виявляє стимулюючий ефект на енергію проростання, схожість насіння, підвищує врожайність сільськогосподарських культур. Штам бактерій Azotobacter vinelandii 7-KB виділений з чорноземного ґрунту, відібраного з кореневої зони цукрового буряка в Житомирській області і селекціонований у відділі мікробіологічних процесів на твердих поверхнях Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного (ІMB) НАН України. Штам депонований у Депозитарії мікроорганізмів ІMB НАН України 21 листопада 2002 року і йому привласнено колекційний номер Azotobacter vinelandii 7-KB ІMB В-7076. Основною особливістю штаму є його здат ність накопичувати велику кількість біомаси порівняно з відомим штамом Azotobacter vinelandii 56, синтезувати жовто-бурий пігмент та його здатність до росту на важкорозчинних неорганічних сполуках фосфору, зокрема трикальційфосфаті. Штам Azotobacter vinelandii 7-KB для одержання препарату, що поліпшує азотне живлення рослин і частково фосфорне за рахунок його мобілізації з важкодоступних неорганічних сполук, стимулює енергію проростання та схожість насіння, підвищує врожайність овочевих культур. Винахід відноситься до ґрунтової мікробіології, зокрема для одержання бактеріального препарату, внесення якого в ґрунт підвищує врожайність сільськогосподарських культур і являє собою новий штам для одержання бактеріального препарату. Штам виділений з чорноземного ґрунту Житомирської області на мінеральному середовищі Ешбі з сахарозою методом розкладання грудочок ґрунту на поверхню агаризованого середовища Ешбі. Штам ідентифіковано відповідно до визначника Бергі, йому визначили номер 7-КВ. В Депозитарії Української колекції мікроорганізмів ІMB НАН України наданий номер ІMB В7076. (19) UA (11) 72856 (13) C2 (21) 20031211033 (22) 04.12.2003 (24) 15.08.2006 (46) 15.08.2006, Бюл. № 8, 2006 р. (72) Курдиш Іван Кирилович, Бега Зінаїда Терентіївна 3 72856 4 Штам Azotobacter vinelandii 7-KB має наступні ється накопиченням більшої кількості клітин ніж властивості. Az.vinelandii 56. Морфологічні і культуральні ознаки: Здатність Azotobacter vinelandii 7-KB рости і клітини округло-овальної форми розміром на тяжкорозчинному трикальційфосфаті показано 1,9-2,0мкм, в молодому віці (16-20 годин) - палична прикладі 2. ковидні. Клітини розміщуються поодинці, утвоПриклад 2 рюють цисти, синтезують значну кількість капсуПосівний матеріал вирощують в пробірках на льного слизу. Клітини в молодому віці рухливі, скошеному агаризованому середовищі Ешбі на грамваріабельні. В рідкому середовищі Ешбі протязі 48 годин при 28 С. Потім 1мл суспензії, утворюють жовто-бурий пігмент, розчинний у воприготованої змивом мікроорганізмів фізіологічді. Колонії на агаризованому Ешбі округлі, слизиним розчином з скошеного середовища і доведесті, жовтого кольору, випуклі, блискучі, край коної за стандартом мутності до 5 одиниць, засівалоній рівний. Діаметр колоній 72-годинної ють в 100 мл рідкого середовища Ешбі, в якому культури становить 2-3мм. розчинний К2НРO4 3Н2O замінено на тяжкорозКультура швидкоростуча, за три доби культичинний Са3(РO4)2 (2г/л). Azotobacter vinelandii вування нарощує біомасу з 1 105кл/мл до вирощували 72 години при 28 С, в умовах періо4,9 108кл/мл, штам Azotobacter vinelandii 56 дичного культивування при перемішуванні 3,4 108кл/мл. (240об/хв.). До і після цього в культуральній рідиБіохімічні ознаки: ні визначали чисельність бактерій методом посіШтам 7-KB - аероб, хемоорганотроф, викориву на агаризоване середовище з десятикратних стовує для живлення вуглеводи (сахарозу, глюрозведень. У фугаті визначають концентрацію козу, рамнозу), не росте на крохмалі, споживає РO43- колориметрично з використанням молібдеспирти (маніт, інозит), солі органічних кислот (кановокислого амонію та аскорбінової кислоти в пронат, каприлат, малонат), каталазопозитивний. якості відновлювача (таблиця 2). Штам Azotobacter vinelandii 7-KB росте при темТаким чином, штам Azotobacter vinelandii 7пературі від 20 до 45°С і рН від 5,0 до 9,0. ОптиKB, що пропонується для внесення в грунт, харамальна температура росту 28-37°С, рН 6,5-7,5. ктеризується значним стимулюючим впливом на Росте на середовищі Ешбі без азоту, але може енергію проростання і схожість насіння ряду ововикористовувати як джерело азоту нітрати, солі чевих культур. амонію. Ознаки штаму стійкі. Приклад 3 Штам непатогенний для теплокровних тваВплив Azotobacter vinelandii 7-KB на енергію рин. проростання та схожість насіння овочевих кульУмови зберігання. тур оцінювали за ГОСТом 12038-84. З цією меШтам зберігається на безазотному середотою отримували суспензію мікроорганізмів на вищі Ешбі наступного складу (г/л): сахароза рідкому середовищі Ешбі в умовах, описаних ви20,0; К2НРО4.3Н2О - 0,2; MgSO4·7H2O - 0,2; NaCl ще. Насіння огірків, томатів, буряка, капусти об0,2; K2SO4 - 0,1; СаСО3 - 2,0; агар - 15,0; мікроеробляли суспензією клітин Azotobacter vinelandii лементи (по Федорову) - 1мл; рН - 7,0-7,5. Збері7-KB, а також суспензіями, розведеними в 10, 50 і гання штаму здійснюється в пробірках на скоше100 разів водопровідною водою, протягом 1 гоному агаризованому середовищі Ешбі під ватнодини, після чого насіння розкладали на зволожений фільтрувальний папір в чашки Петрі, або марлевими пробками при температурі 4 С. Підтпластмасові кювети. Крім того, насіння обробляримується штам методом періодичних пересівів ли надосадковою рідиною, звільненою від клітин (один раз у квартал). центрифугуванням. Інкубували насіння в темряві Здатність штаму до високої ростової активності за рахунок фіксації атмосферного азоту при 25 С згідно ГОСТ 12038-84. Контролем слупідтверджується прикладом 1. жило насіння, оброблене водопровідною водою Приклад 1 (таблиця 3). Готують посівний матеріал, вирощуючи бакДані таблиці 3 показують, що обробка насіння терії Azotobacter vinelandii 7-KB на скошеному суспензією азотфіксуючих мікроорганізмів агаризованому середовищі Ешбі в пробірках проAzotobacter vinelandii 7-KB та надосадковою рідитягом 48 год при 28°С в термостаті. Потім готуною значно підвищує енергію проростання, і його ють суспензію бактерій змивом з косяків фізіолосхожість та довжину проростків. гічним розчином. Визначають титр бактерій в Запропонований штам спричиняє помітний суспензії методом прямого рахунку, наносячи стимулюючий вплив на ріст та врожайність сіль0,01 мл суспензії на 4 см2 предметного скла. В ськогосподарських рослин. качалочні колби з 100 мл рідкого середовища Суспензію мікроорганізмів Azotobacter Ешбі вносять суспензію з таким розрахунком, vinelandii 7-KB змішували з глинистим мінералом щоб концентрація клітин Azotobacter vinelandii і вносили під коріння рослин з розрахунку 0,5г препарату. 1г препарату містив не менше ніж 1складала 1 105 або 5 105кл/мл. Вирощують куль2,5 108 клітин Azotobacter vinelandii 7-KB. В ретури при періодичному культивуванні (240об/хв) протягом 3-х діб при 28°С. До і після вирощуванзультаті в господарстві "Совки" Києвоня в культуральній рідині визначають чисельність Святошинського району Київської області в умоазотфіксуючих бактерій (таблиця 1). вах закритого фунту одержано урожай томатів Таким чином, отримані результати свідчать сорту Червона стріла на 27,7% вищий, ніж в конпро те, що культивування Azotobacter vinelandii 7трольному варіанті. KB в безазотному середовищі Ешбі супроводжу 5 72856 6 Таблиця 1 Ростова активність Azotobacter vinelandii 7-KB в рідкому середовищі Ешбі (72 год. культивування) П№ 1 2 3 Штам Az.vinelandii 7-KB Az.vinelandii 56 Az.vinelandii 7-KB Az.vinelandii 56 Az.vinelandii 7-KB Az.vinelandii 56 Кількість життєздатних клітин в 1 мл Початкова Кінцева (1,0±0,1).105 (4,9±00,30).108 (1,0±0,1).105 (3,40±0,50).108 (4,7±0,1).105 (2,80±0,08).109 . 5 (5,2±0,3) 10 (1,71±0,27).109 . 5 (5,9±0,6) 10 (8,70±0,56).108 . 5 (6,4±0,3) 10 (6,20±0,32).108 Таблиця 2 Ріст азотофіксуючих мікроорганізмів в середовищі Ешбі з тяжко розчинними фосфатом кальцію Штами Az.vinelandii 7-KB Az.vinelandii 56 Середовище Ешбі з К2НРО4.3Н2О, 0,2 г/л Чисельність, кл/мл РО43-, мг/л . 4 (2,14±0,26) 10 180±0,21 (1,87±0,22).108 160±0,52 (1,23±0,33).104 184±0,30 (1,68±0,18).108 157±3,00 Середовище Ешбі з Са3(РО4)2, 2 г/л Чисельність, кл/мл ΡО43-, мг/л . 4 (2,40±0,4) 10 4,2±0,14 (1,97±0,06).108 9,6±0,70 (3,87±0,30).104 3,0±0,01 (2,65±0,15).108 8,2±0,20 Примітка: в чисельнику - показники на початку досліду; в знаменнику - після 72 годин культивування Таблиця 3 Енергія проростання, схожість насіння та довжина проростків після їх бактеризації Azotobacter vinelandii 7-KB Бактеризація насіння Енергія проростання, % Схожість, % від контролю від контролю Томати copту Лагідний Контроль 100,0 100,0 Суспензія 116,4 101,9 Суспензія, розведена 1:10 119,8 103,6 Суспензія, розведена 1:100 111,3 107,4 Надосадкова рідина 116,7 101,9 Томати сорту Новинка Придніпров'я Контроль 100,0 100,0 Суспензія 100,0 Суспензія, розведена 1:10 110,1 103,9 Суспензія, розведена 1:100 104,3 102,4 Надосадкова рідина 103,4 104,7 Огірки сорту Конкурент * Контроль 100,0 100,0 Суспензія 100,0 100,0 Суспензія, розведена 1:10 100,0 100,0 Суспензія, розведена 1:100 100,0 100,0 * Схожість огірків у всіх варіантах 100% Червоноголова капуста сорту Топаз Контроль 100,0 100,0 Суспензія 113,4 114,0 Суспензія, розведена 1:10 122,9 118,1 Суспензія, розведена 1:100 147,9 120,0 Столовий буряк сорту Бордо Контроль 100,0 100,0 Суспензія 119,2 134,2 Суспензія, розведена 1:10 108,3 104,5 Надосадкова рідина 103,4 Довжина проростків, % від контролю 100,0 111,8 120,5 109,0 117,2 100,0 112,2 109,6 106,0 111,8 100,0 120,0 121,7 117,3 100,0 129,1 131,3 133,8 100,0 105,4 108,3 115,9 7 72856 8 Продовження таблиці 3 Контроль Суспензія, розведена 1:50 Контроль Суспензія Суспензія, розведена 1:10 Суспензія, розведена 1:50 Надосадкова рідина Надосадкова рідина, розведена 1:10 Надосадкова рідина, розведена 1:50 Ярова пшениця сорту Рання-93 100,0 100,0 120,5 120,7 Цукровий буряк сорту Олександрія 100,0 100,0 102,2 112,0 141,2 100,0 223,7 106,8 182,5 157,2 177,7 172,0 221,5 100,0 100,0 100,0 109,3 100,0 100,0 109,8 103,6 103,8 Примітка: за 100% прийнято показник у контрольному варіанті Комп’ютерна верстка Н. Лисенко Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601