Штам бактерій bacillus subtilis для одержання бактеріального добрива для рослинництва

Штам бактерій Bacillus subtihs 1MB В-7023 для одержання бактеріального добрива під овочеві культури Винахід відноситься до мікробіологічних засобів підвищення врожайності рослин за рахунок поліпшення фосфорного живлення й захисту від дії фітопатогенів і стосується виділення нового штаму бацил, призначеного для виготовлення бактеріального препарату Метою винаходу є одержання нового штаму, що характеризується високою активністю мобілізації фосфору з важкорозчинних неорганічних і органічних сполук фосфору (трикальційфосфат, гліцерофосфат, фітин і ін), та виявляє антагоністичну активність до фітопатогенних грибів і бактерій, що викликають хвороби овочевих і злакових рослин Штам бактерій Bacillus subtihs 5-RK виділений з чорноземного ґрунту Черкаської області і селекціонований у ВІДДІЛІ мікробіологічних процесів на твердих поверхнях Інституту мікробіологи й вірусологи їм Д К Заболотного (1MB) НАН України Штам, депонований у Депозитарії мікроорганізмів 1MB НАН України 26 лютого 2001 р і йому привласнено колекційний номер Bacillus subtihs 1MB В-7023 Основною особливістю штаму є його здатність до мобілізації фосфору з важкорозчинних неорганічних та органічних сполук у найбільш відповідальний період розвитку рослин У 1мл мінерального середовища з трикальційфосфатом протягом 3-х діб культивування штам накопичує Відомий штам Bacillus megatenum за 25 діб культивування накопичував з фосфатів заліза 44,6мг/100мл Р2О5 (Ас СССР №1645266, 1988 Суховицкая), (тобто не менше за 25 діб культивування) Штам Bacillus subtihs 5-RK характеризується високою антагоністичною активністю проти фітопатогенних грибів і бактерій, що вражають овочеві й злакові культури рослин (табл 4-5) Описані раніше штами Bacillus subtihs мають антагоністичну активність, але при цьому не має відомостей щодо їх здатності мобілізувати фосфати (А с №2099947, 1996 Смирнов, Сорокулова) Штам Bacillus subtihs 5-RK для одержання препарату, що поліпшує фосфорне живлення рослин за рахунок його мобілізації із важкорозчинних неорганічних (трикальційфосфат) і органічних сполук (гліцерофосфат, фітин), що захищає рослини від фітопатогенів і підвищує врожайність овочевих культур Винахід відноситься до ґрунтової мікробіологи, зокрема, до одержання бактеріального препарату, що поліпшує фосфорне харчування рослин, за рахунок мобілізації важкорозчинних у ґрунті неорганічних і органічних сполук фосфору та захищає рослини від фітопатогенів, сприяє підвищенню врожаю овочевих і зернобобових культур і являє собою новий штам для одержання бактеріального препарату Штам, виділений з чорноземного ґрунту на мінеральному середовищі Мєнкіної з глюкозою й гліцерофосфатом кальцію Ідентифікований ВІДПОВІДНО до визначника Берп, посібника Смирнова із співавт , йому привласнений №5-RK 1,8-108 клітин та 150мг/л РО^~, У середовищі з гліцерофосфатом в аналогічних умовах вирощування титр життєздатних клітин складав 3,8-108 клітин у 1мл, а концентрація РО^~ до 300мг/л ГО Ю 54923 Штам, депонований в Українській колекції мікроорганізмів 1MB НАН України, колекційний номер 1МВ-В-7023 Штам Bacillus subtihs 5-RK має наступні властивості Морфологічні і культуральні ознаки грампозитивні палички з круглими кінцями, рухливі, розміром 0,8х2,9мкм Спори овальні, розташовані субтермінально Факультативний анаероб Колонії на картопляному агарі округлої форми, сіруватобілого кольору, плоскі, матові, R-типу Край колонії не рівний Діаметр колонії 48-годинноі культури складає 3-12мм На МПБ утворює плівку, росте на МПБ з 5 і 7% NaCI Може рости при температурі 28°С, 37°С і 45°С Оптимальна температура росту 28-0,5°С, рН=6,0-7,0 ного складу (г/л) (NH 4 ) 2 SO 4 - 0,5, MgSO 4 -7H 2 O 0,3, NaCI - 0,3, КСІ - 0,3, MnSO 4 -7H 2 O - 0,001, FeSO 4 -7H 2 O - 0,001, СаСОз - 5,0, глюкоза - 10,0, гліцерофосфат - 1,0 у перерахуванні на РО4~ > рН=6,91-7,1, агар-агар - 15,0 Перед стерилізацією середовище розливають по 100мл у колби Ерленмейєра об'ємом 0,75л Режим стерилізації 20 хв, при 0,5 атм Здатність штаму мобілізувати фосфор із його органічних і неорганічних сполук підтверджується прикладом 1 Приклад 1 Готують посівний матеріал, вирощуючи бактерії на агаризованому середовищі Мєнкіної з гліцерофосфатом протягом 24 год Потім 1мл суспензії бацил, приготовленої за стандартом мутності 5 одиниць, засівають колби з рідким середовищем Мєнкіної, склад якого приведений вище Бактерії Bacillus subtihs 5-RK вирощують в умовах періодичного культивування (240 об/хв) протягом 3-х діб при 28°С Після вирощування в культуральній рідині визначають чисельність бактерій (табл 1-2) У фугаті культуральної рідини Росте на суслоагарі рН=5,5 Дає позитивну реакцію на наявність каталази, уреази, лецитінази Виділяє В середовище аміак, не виділяє сірководень і індол Пдролізує крохмаль, желатину Відновлює метиленовий синій, нітрати й нітрити Дає позитивну реакцію Фогес-Проскауера Здатний до утворення ацетілметнлкарбінолу на середовищі Кларка Ферментує без утворення газу глюкозу, сахарозу, галактозу, сорбіт і гліцерин Слабкіше ферментує манніт і мальтозу Не ферментує лактозу, ксилозу, арабшозу, дульцит Ознаки штаму СТІЙКІ Штам непатогенний для теплокровних тварин концентрацію РО4~ визначають колориметричне з використанням молібденово-кислого амонію та аскорбінової кислоти в якості відновлювача (табл 1-2) Вміст фосфат-іонів, що накопичуються штамом бактерій обчислюють по різниці його концентрації у експериментальному й контрольному (стерильному) варіантах Умови зберігання Штам зберігається й підтримується методом періодичних пересівів (не рідше 2 разів у півроку) на агаризованому середовищі Мєнкіної з гліцерофосфатом кальцію наступ Таблиця 1 3Ростова активність Bacillus subtihs 5-RK і накопичення Р О | в культуральному середовищі з гліцерофосфатом КІЛЬКІСТЬ життєздатних клітин в 1 мл сереНакопичення РО4 (мг/л) в кульдовища туральному середовищі, що міспочаткова кінцева тить гліцерофосфат э (1,2±0,1)-10 280,0 Bacillus subtihs (2,9±0,3)10в 5-RK (4,1±0,1)-10э 300,0 (3,8±0,2)10в РН Штам почат кшцев 7,0 7,0 5,6 5,5 Примітка час культивування 3 доби Таблиця 2 Ростова активність Bacillus subtihs 5-RK і накопичення Штам КІЛЬКІСТЬ життєздатних клітин в 1 мл середовища початкова Bacillus subtihs 5-RK (2,7±0,5)-10э (3,0±0,2)-10э кінцева 7 (8,9±0,7)10 (9,1±0,5)107 Примітка час культивування 3 доби Дані таблиці 1-2 вказують на високу активність мобілізації РС>4~ запропонованим штамом з органічних фосфоровмісних сполук, що є властиві для чорноземних ґрунтів Порівняльні активності мінералізації фосфатів різних представників роду Bacillus (табл 3) показа в культуральному середовищі з фітином Накопичення РО4 B культуральному середовищі, що містить фітин (мг/л) 46,0 61,0 РН почат кшцев 7,0 7,0 6,2 6,1 ли, що найбільш високою активністю характеризувався штам Bacillus subtihs 5-RK Цей штам за ознаками мобілізації фосфату з органічних сполук гліцерофосфату й фітину перевершує ІНШІ ВІДОМІ мікроорганізми 54923 Таблиця З Накопичення Мікроорганізми різними штамами бацил в культуральній рідині в середовищі с гліцерофосфатом Накопичення РО4 в культуральному середовищі за Здоби (мг/л) 204,0 219,0 120,0 194,0 280,0 В megaterium 9 Bsubtilis 15 В cereus var myc 6 В pumilus 3 Bacillus subtihs 5-RK Ефеїсгивність мобілізації фосфату з важкорозчинних неорганічних сполук підтверджується прикладом 2 Приклад 2 Готують середовище Муромцева наступного складу (г/л) (NbUhSC^ - 0,5, MgSO4 0,2, K2SO4 - 0,2, Са 3 (РО 4 ) 2 - 2,0, глюкоза - 10,0, рН=6,5-7,0, дріжджовий екстракт - 2мл Середовище розливають по 100мл у колби Ерленмейєра, об'ємом 0,75л та стерилізують протягом 20 хв при 0,5 атм Посівний матеріал готують на агаризованому середовищі Муромцева з Саз(РСч)2 протягом 24 год 1мл водної суспензії РН почат кшцев 6,8 7,0 6,9 7,1 7,0 6,3 6,3 6,0 6,3 5,6 бацил, приготовленої за стандартом мутності 5 одиниць, вносять в ЮОмл стерильного середовища Муромцева в колби Ерленмейєра Бактерії Bacillus subtihs 5-RK вирощують при перемішуванні (240 об/хв) протягом 3 діб при 28°С, Вміст РО^" У фугаті культуральної рідини визначають як показано вище Результати досліджень наведені у табл 4 Приведені результати свідчать, що запропонований штам бацил активно мобілізує фосфати з неорганічної важкорозчинної сполуки трикальційфосфату, властивого різним типам ґрунтів Таблиця 4 3Ростова активність Bacillus subtihs 5-RK і накопичення Р О | У культуральному середовищі з трикальційфосфатом Штам Bacillus subtihs 5-RK КІЛЬКІСТЬ життєздатних клітин в 1 мл сереНакопичення РО4 (мг/л) у довища культуральному середовищі початкова кінцева 118,0 (1,6±0,1)105 (1,8±0,03)10в 150,0 (1,8±0,1)105 (2,1±0,1)10в Примітка, час культивування 3 доби Перспективність використання штаму Bacillus subtihs 5-RK для пригнічення фітопатогенних грибів і бактерій підтверджується прикладом З Приклад 3 Бактерії вирощували у середовищі Мєнкіної з гліцерофосфатом або фітином, або на середовищі Муромцева з трикальційфосфатом протягом 3-х діб Отриману культуральну рідину висівали петлею у центрі чашки Петрі з агаризованим середовищем Гаузе-2 (для вивчення активності у відношенні до бактеріальних тест-культур) і на картопляний агар (для дослідження антагоністичної активності у відношенні тест-культур фітопатогенних грибів) Посіви шкубували при 28°С протягом 48-72 годин Потім ДО культури, що вирослу штрихом підсівали тест-мікроорганізми, якими були фітопатогенні гриби і фітопатогенні бактерії (з суспензії добових культур фітопатогенних бактерій і суспензії грибних спор у фізіологічному розчині, що містила 5х10 8 кл/мл) Чашки з тест-культурами бактерій шкубували у термостаті при 37°С протягом 24 год , з тест-культурами грибів - при 28°С протягом 5-7 діб Про ефективність пригнічення фітопатогенів бактеріями Bacillus subtihs 5-RK судили за розміром зон інгібування росту тест-культур Контролем росту тест-культур було паралельне вирощування їх на чашках з агаризованим середовищем Гаузе-2 та картопляним агаром без РН почат 6,4 6,4 кшцев 5,2 5,1 Bacillus subtihs 5-RK Отримані результати, що представлені у табл 5-6, свідчать про високу антагоністичну активність Bacillus subtihs 5 по відношенню до фітопатогенних бактерій і грибів Таблиця 5 Антагоністична активність Bacillus subtihs 5-RK по відношенню до фітопатогенних бактерій Тест-культури Pseudomonas synngae pvsynngae Р fluorescens Ervin lacarotovora subs Caratovora Xantormonas campestns pv campestns Clavibacter michiganense Зони пригнічення тесткультур, мм 19,0±2,1 16,0±0,2 16,0±0,8 31,6±2,1 24,6±3,0 Таблиця 6 Антагоністична активність Bacillus subtihs 5-RK no відношенню до фітопатогенних грибів Тест-культури Fusanum gram in earum F oxysporum F solani Зони пригнічення тесткультур, мм 22,8+0,5 9,2±1,0 18,610,9 54923 продовж таб 6 Тест-кул ьтури Зони пригнічення тесткультур, мм 15,4±1,1 13,8±1,2 26,5±1,5 17,5±1,4 9,8±0,5 F sambicinum F culmomm Biopolans sorokiniana Altemana alternata Ghociadium roseum Запропонований штам Bacillus subtilis 5-RK характеризується помітним стимулюючим впливом на енергію проростання та схожість ряду овочевих і злакових культур, що підтверджується прикладом 4 Приклад 4 Вплив Bacillus subtilis 5-RK на енергію проростання і схожість насіння різних культур 8 оцінювали згідно ГОСТ 12038-84 Для цього отримували суспензію цих бактерій в рідких поживних середовищах в умовах, що описані у прикладах 12 Насіння огірків, томатів, буряка, пшениці, капусти обробляли суспензією клітин Bacillus subtilis 5RK (3-х добова культуральна рідина з клітинами бацил після їх вирощування у рідких середовищах Мєнкіної й Муромцева) протягом 1 год , потім насіння розкладали на фільтрувальний папір у кювети або чашки Петрі Папір зволожували стерильною водопровідною водою Інкубування насіння проводили у темряві при 25-30°С згідно ГОСТ 12038-84 Контролем служило насіння, оброблене стерильною водопровідною водою Результати досліджень приведені у т а б л 7 Таблиця 7 Енергія проростання і схожість насіння рослин після їх бактеризації Bacillus subtilis 5-RK Варіанти Контроль Бактеризація Bacillus subtilis 5-RK Контроль Бактеризація Bacillus subtilis 5-RK Контроль Бактеризація Bacillus subtilis 5-RK Контроль Бактеризація Bacillus subtilis 5-RK Контроль Бактеризація Bacillus subtilis 5-RK Контроль Бактеризація Bacillus subtilis 5-RK Контроль Бактеризація Bacillus subtilis 5-RK Контроль Бактеризація Bacillus subtilis 5-RK Контроль Бактеризація Bacillus subtilis 5-RK Контроль Бактеризація Bacillus subtilis 5-RK Енергія проростання % від контролю Буряк сорту Ялтушківський 100,0 132,2 Томати сорту Світанок 100,0 129,0 Томати сорту Перемога 100,0 172,4 Огірки сорту НІЖИНСЬКІ 100,0 117,6 Капуста сорту Бордо 100,0 125,5 Квасоля сорту Мавка 100,0 111,4 Озима пшениця сорту Веселка 100,0 108,7 Озима пшениця сорту Гостіанум 100,0 119,0 Насіння гарбуза сорту Стофунтова 100,0 115,3 Насіння трави сорту Ліліпут 100,0 113,0 Дані табл 7 показують, що культуральна рідина запропонованого штаму бацил значно підвищує Схожість насіння % від контролю 100,0 144,1 100,0 127,6 100,0 162,5 100,0 124,1 100,0 134,5 100,0 106,5 100,0 115,0 100,0 138,1 100,0 115,3 100,0 118,0 енергію проростання и схожість насіння Підписано до друку 03 04 2003 р Тираж 39 прим ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)236-47-24