Спосіб терапії променевих опіків шкіри

Реферат: Спосіб терапії променевих опіків шкіри включає використання суміші фібробластів та кератиноцитів. Суміш введена за допомогою аутотрансплантації. UA 106529 U (12) UA 106529 U UA 106529 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі медицини та може бути використана в терапії променевих опіків шкіри. Відомі методи терапії променевих опіків шкіри здебільшого зосереджені на використанні стовбурових клітин [1-4]. Нанесені на уражену область клітини знижують ступінь запалення, збуджують місцеві імунні механізми і стимулюють процес регенерації в зоні виразки [5, 6]. У деяких випадках аплікацію стовбуровими клітинами проводили після оперативного втручання [7]. Недоліками відомих методів терапії променевих опіків шкіри є те, що використання стовбурових клітин пов'язане зі значними матеріальними витратами на здобуття та контроль якості клітинного матеріалу, досить специфічними умовами застосування [8]. До того ж, в останні роки з'явилися відомості про те, що використання стовбурових клітин в терапії пов'язане з ризиком їх трансформації в ракові [9, 10]. Найближчим аналогом для запропонованої корисної моделі є спосіб поверхневого нанесення суміші алогенних фібробластів та кератиноцитів у складі матриці з бичачого колагену та поліглікану [11]. Стандартні методики терапії з використанням цих клітин полягають у нанесенні їх у вигляді суспензій або клітинних шарів на вже сформовані рани до або після хірургічного втручання [12-13]. Доведено абсолютну безпеку використання аутогенних дермальних фібробластів та кератиноцитів [12-14]. Недоліком метода є неможливість тривалого зберігання. Крім того, усі існуючі методи є способами "пізнього реагування", коли розвиток ураження вже має клінічні прояви або вступає у хронічну стадію. Окремо слід зазначити, що, на відміну від термічних та хімічних опіків, особливість променевих опіків міститься у віддалених наслідках, багатих на розвиток виразок, які не загоюються самостійно, або загрожують виникненням раку шкіри, а у цьому випадку застосування стандартних способів фармакологічної та клітинної терапії не тільки неефективно, а навіть небезпечно. В основу запропонованої корисної моделі поставлена задача створити спосіб терапії променевих опіків шкіри, який буде спрямований не тільки на лікування ураження шкіри, яке вже утворилося, але й на попередження та уповільнення його розвитку. Суть способу полягає в тому, що суміш фібробластів та кератиноцитів, нарощених з біоптату пацієнта, вводять навколо зони опіку підшкірно за допомогою декількох ін'єкцій (об'ємна аутотрансплантація) за спеціальним розкладом. Причинно-наслідковий зв'язок між запропонованим способом та заявленим результатом пояснюється наступним: введення суміші фібробластів та кератиноцитів способом об'ємної аутотрансплантації через 1 годину після опромінювання та кожні наступні 24 години гальмує розвиток опіку та сприяє скорішому загоєнню рани. Розробку кількісного вмісту клітин у суміші проводили, виходячи з відомих даних щодо вмісту фібробластів і кератиноцитів у нативній шкірі. Близько 95-98 % кератиноцитів шкіри 4 3 локалізовано у шарі епідермісу з середньою щільністю розподілення 37,5×10 клітин в 1 мм . 4 Фібробласти загалом локалізовані у шарі дерми у середній кількості 14,3×10 клітин в 1 мм. Тобто співвідношення кількості кератиноцитів і фібробластів в шкірі у середньому складає 2,6:1. Однак необхідно враховувати те, що товща шару дерми більша, ніж товща шару епідермісу, в середньому у 3 рази і повністю зазнає променевого ураження. Кількість клітин у суміші повинна бути такою, щоб повністю компенсувати уражену клітинну складову у обох шарах шкіри, враховуючи різницю у їх товщині. Отже для проведення роботи було встановлено співвідношення кількості кератиноцитів та фібробластів у суміші як 2,6:3,0. Як приклад застосування можна навести клітинну терапію променевих опіків аутотрансплантацією суміші фібробластів та кератиноцитів у дослідних тварин. Для аутотрансплантації обидва типи клітин розморожували згідно стандартному протоколу 3 3 [17] і готували 6 доз суспензії яка містила суміш (150-160)×10 фібробластів і (130-140)×10 кератиноцитів в 100 мкл стерильного фізіологічного розчину для ін'єкцій. Життєздатність фібробластів і кератиноцитів у суспензії становила, в середньому, 80-85 %. Через 1 годину після опромінення, а потім кожні 24 години одній групі тварин, яких лікували, вводили суспензію суміші фібробластів та кератиноцитів. Робили 6 підшкірних ін'єкцій по периметру зони опромінення під кутом 45° до її центру на глибину 1 мм. Проведення ін'єкції в об'єм ураження та карта процедури наведені схематично на Фіг. 1 А, Б. На Фіг. 2 наведені фотографії розвитку дослідженого радіаційного опіку з променевою виразкою шкіри у нелікованих і лікованих аутотрансплантацією тварин. Як видно на Фіг. 3 та 4, і площа опіку, і загальний об'єм ураження при аутотрансплантації весь час спостереження залишаються меншими, ніж без неї, а між 15-ю і 20-ю добами ці показники перестають збільшуватися. На 25-у добу вони вже значно менші ніж ураження, які розвивалися без гальмування аутотрансплантацій. 1 UA 106529 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Ще ефективніше впливає аутотрансплантація на розвиток променевої виразки. До 25-и при введенні суміші фібробластів з кератиноцитами в зону опромінення виразка гоїться і повністю зникає. Отримані результати свідчать про те, що аутотрансплатація призводить до двох взаємодіючих механізмів - це, по-перше, гальмування розвитку променевого опіку і формування променевої виразки і, по-друге, інтенсифікація репараційних процесів. Висока ефективність терапевтичних властивостей суміші фібробластів з кератиноцитами пояснюється їх синергетичною взаємодією в процесах морфогенезу та репарації ушкоджень шкіри. В основі цієї синергетики знаходиться система взаємно стимулюючих позитивних зворотних зв'язків. Так, фібробласти продукують, зокрема, фактор росту сполучної тканини, фактор росту кератиноцитів (KGF), епідермальний фактор росту (EGF), а кератиноцити синтезують інтерлейкін-1 (IL-1), який стимулює фібробласти до синтезу KGF. Все це сприяє проліферації і міграції кератиноцитів від глибоких шарів опікової рани до її поверхні. Наведені дані свідчать, що найбільш істотним результатом аутотрансплантації є високий вміст живих клітин в зоні ураження (Фіг. 5). При введенні суміші фібробластів з кератиноцитами вже на 20 добу після опромінення кількість живих клітин в зоні ураження досягає 90 %, а на 35 добу навіть перевищує контрольні значення виявляється рівним 117 %. Аутотрансплантація суміші фібробластів з кератиноцитами у значно зменшує кількість деградованого і підвищує вміст нативного колагену. При цьому на 35 добу концентрація нативного колагену в зоні опіку стає вище контролю. Таким чином, перманентне введення аутоклітин в зону опіку призводить до нормалізації біополімерного складу сполучнотканинного матриксу за рахунок підвищення синтезу і зниження розпаду колагенових структур (Фіг. 6). При цьому вміст у них колагену типу І, який входить до складу найбільш сформованих, "зрілих", надмолекулярних утворень матриксу, також вище у опромінених лікованих тварин у порівнянні з нелікованими. За лікуванням сумішшю фібробластів з кератиноцитами його вміст становить 110 % від контролю на 35 добу після опромінення (Фіг. 7). Перманентне введення аутофібробластів та кератиноцитів у зону променевого опіку призводить до нормалізування біополімерного складу сполучнотканинного матриксу за рахунок підвищення синтезу та зниження розпаду колагенних структур. Таким чином ми створили метод терапії променевих опіків шкіри спрямований не тільки на лікування ураження шкіри, яке вже утворилося, але й на попередження та уповільнення його розвитку. Джерела інформації: 1. Герасимова Л.И., Назаренко Г.И. Термические и радиационные ожоги. - М.: Медицина. 2005. - 384 с. 2. Tenenhaus M., Rennekampff H.О. Burn surgery. Clinics in Plastic // Surgery. - 2007. - 34, Is. 4. -P. 697-715. 3. Клигуненко E.H., Лещев Д.П., Слесаренко С.В., Слинченков В.В., Сорокина Е.Ю. Интенсивная терапия ожоговой болезни. М.: "МЕДпресс-информ". - 2005. - 144 с. 4. Петров С.В. Общая хирургия: М: ГЭОТАР-Медиа, - 2005. - 768 с. 5. Васин М.В. Средства профилактики и лечения лучевых поражений. М.: ВМЦК "Защита". 2001. - 312 с. 6. Елдашов С.В. Экспериментальное обоснование современных методов хирургического лечения сочетанных лучевых поражений. Автореф. дис. канд. мед. наук. СПб. - 2013. - 19 с. 7. Бушманов А.Ю., Еремин И.И., Мороз Б.Б., Галстян И.А., Надежина Н.М., Слободина Т.С., Гринаковская О.С Опыт современного лечения лучевых ожогов у лиц, подвергавшихся воздействию ионизирующего излучения. // Медицина труда и промышленная экология. - 2012.№ 10. - С. 20-27. 8. Hatzistergos K.E., Blum A., Ince T.A., Grichnik J.M., Hare J.M. What Is the Oncologic Risk of Stem Cell Treatment for Heart Disease? // Circ Res. - 2011. - 108. - p. 1300-1303. 9. Herberts C.A., Kwa M.SG., Hermsen H.PH. Risk factors in the development of stem cell therapy. // Journal of Translational Medicine. - 2011. - 9. p. 29-42. 10. Serakincil N., Christensen R., Fahrioglu U. Transformation of Mesenchymal Stem Cells, p. 207-226. 11. Waymack P, Duff R.G., Sabolinski M. The effect of a tissue engineered bilayered living skin analog, over meshed split-thickness autografts on the healing of excised burn wounds. The Apligraf Burn Study Group. Burns. 2000; Nov; 26[7]:609-19. 2 UA 106529 U 5 10 15 12. Зорин В.Л., Зорина А.И., Петракова О.С., Черкасов В.Р. Дермальные фибробласты для лечения дефектов кожи. // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2009. - Выпуск № 4 / том 4/ С. 27-40. 13. Деев Р.В. Применение ауто- и аллофибробластов для коррекции патологии кожи // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2010. - Выпуск № 1 / том 5 / С. 9-13. 14. Rennekampff Н., Kiessig V., Griffey S. Acellular human dermis promotes cultured keratinocyte engraftment // J. Burn Care Rehabil. - 1997. - N. 6. - P. 535-544. 15. Keira S.M. Experimental model for fibroblast culture. [Електронний ресурс]. Режим доступу до протоколу: www.scielo.br/pdf/acb/v19s1/v19s1а03.pdf 16. Shaw A.J. Epithelial cell culture. The practical approach series. - Series ed. Richwood D., Hames B.D. // Reconstruction of human skin epidermis in vitro-1996. - P. 179-200. 17. Asghar W1, El Assal R. Preserving human cells for regenerative, reproductive, and transfusion medicine // Biotechnol J. - 2014. - 9(7) - P. 895-903. 18. Phelan M.C. Basic Techniques for Mammalian Cell Tissue Culture // Current Protocols in Cell Biology. - John Wiley & Sons Inc. - 1998. - P. 82-83. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 20 25 1. Спосіб терапії променевих опіків шкіри, що включає використання суміші фібробластів та кератиноцитів, який відрізняється тим, що її вводять за допомогою аутотрансплантації. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що суміш вводять навколо зони опіку підшкірно за допомогою декількох ін'єкцій (об'ємна аутотрансплантація). 3. Спосіб за п. 1 або п. 2, який відрізняється тим, що суміш фібробластів та кератиноцитів вводиться за наступним розкладом: через 1 годину після опромінювання та кожні наступні 24 години. 3 UA 106529 U 4 UA 106529 U 5 UA 106529 U Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6