Спосіб визначення мембранного потенціалу клітин стрес-індукованих некультурабельних ентеробактерій

Реферат: (72) Винахідник(и): Юдін Ігор Петрович (UA), Похил Сергій Іванович (UA), Казмірчук Віктор Володимирович (UA), Гушилик Борис Іванович (UA), Короваєва Інга Вадимівна (UA), Суходуб Людмила Борисівна (UA), Похил Світлана Вікторівна (UA), Макаренко Валентина Дмитрівна (UA), Гіржанова Інна Владленівна (UA), Чумаченко Олена Олегівна (UA) (73) Власник(и): ДЕРЖАВНА УСТАНОВА "ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ ТА ІМУНОЛОГІЇ ІМ. І.І. МЕЧНИКОВА НАМН УКРАЇНИ", вул. Пушкінська, 14-16, м. Харків, 61057 (UA), Юдін Ігор Петрович, вул. Римарська, 6, кв. 16, м. Харків, 61057 (UA), Похил Сергій Іванович, пр. Фрунзе, 26, кв. 99, м. Харків, 61007 (UA), Казмірчук Віктор Володимирович, вул. Молодіжна, 5, кв. 47, Харківський р-н, Харківська обл., 62401 (UA), Гушилик Борис Іванович, вул. Олексія Боярка, 14, м. Чернівці, 58022 (UA), Короваєва Інга Вадимівна, вул. Шекспіра, 26, кв. 75, м. Харків, 61072 (UA), Суходуб Людмила Борисівна, вул. Академіка Павлова, 142-б, кор. 1, кв. 60, м. Харків, 61000 (UA), Похил Світлана Вікторівна, пр. Фрунзе, 26, кв. 99, м. Харків, 61007 (UA), Макаренко Валентина Дмитрівна, вул. Молодіжна, 5, кв. 47, Харківський р-н, Харківська обл., 62401 (UA), Гіржанова Інна Владленівна, вул. Бакуліна, 3, кв. 23, м. Харків, 61166 (UA), Чумаченко Олена Олегівна, пл. Рози Люксембург, 2, кв. 162, м. Харків, 61003 (UA) ПОТЕНЦІАЛУ КЛІТИН СТРЕС-ІНДУКОВАНИХ UA 107411 U (12) UA 107411 U Спосіб визначення мембранного потенціалу клітин стрес-індукованих некультурабельних ентеробактерій включає змішування суспензій клітин з композицією барвника. Як розчинник флуоресцентного барвника Родамін 123 (Rh 123) застосовується Tris-буфер з етилендіамінтетраоцтовою кислотою, який забезпечує підвищення рівня проникності флуорохрому крізь мембрани грамнегативних бактерій. UA 107411 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медицини, а саме до медичної та санітарної мікробіології, зокрема до способів визначення життєздатних клітин у популяціях некультурабельних ентеробактерій. Ця корисна модель може бути використана для виявлення життєздатних, але некультурабельних патогенних та умовно-патогенних ентеробактерій в зразках клінічного матеріалу та об'єктів оточуючого середовища. Традиційно виявлення і підрахунок життєздатних клітин ентеробактерій здійснюється за допомогою їх культивування на поживних середовищах. Цей спосіб може проводитись шляхом визначення кількості культивованих бактерій безпосередньо посіяних на чашки Петрі з відповідними поживними середовищами, або - підрахунку мікроколоній на мембранних фільтрах після фільтрації бактерійних суспензій. Зазначеним способом оцінюються життєздатні бактерії по їх змозі утворювати видимі колонії чи мікроколонії. На жаль, такий спосіб, зазвичай, вимагає багато часу для утворення видимих колоній або мікроколоній для їх візуального обрахунку. До того ж, зазначений традиційний спосіб не враховує клітини, які під впливом стресу знаходяться в некультурабельному стані. Інший спосіб визначення культурабельних і некультурабельних клітин ентеробактерій є метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Метод ПЛР ґрунтується на багаторазово повторюваній ампліфікації ділянок ДНК in vitro із застосуванням термостабільної ДНКполімерази. ПЛР дає можливість одну або декілька копій ділянки ДНК збільшувати до мільярдів (або більше) копій даної ділянки ДНК ентеробактерій. Однак, недоліком ПЛР є те, що досліджувані зразки можуть містити інгібітори реакції, і тому, не завжди забезпечують достовірні кількісні результати. Етапи попереднього виділення та очищення ДНК можуть призводити до втрати ДНК клітин ентеробактерій з наступною недооцінкою присутності останніх у зразку. Крім того, метод ПЛР не дозволяє відрізнити життєздатні клітини від нежиттєздатних. Життєздатним, але некультурабельним станом (НС) вважається особливий стан бактеріальних клітин, при якому вони демонструють метаболічну активність, але не здатні піддаватися безперервному клітинному поділу, що необхідно для підтвердження росту в середовищах, які звичайно підтримують ріст клітин цих бактерій [1]. На теперішній час описано більше 70 видів родини Enterobacteriaceae, які здатні переходити у НС, у тому числі - Escherichia coli, Shigella sonnei, S. flexneri, Salmonella enteritidis, що є найбільш поширеними збудниками гострих бактерійних кишкових інфекцій людини (ешерихіозів. шигельозів та сальмонельозів) [2]. Проведено велику кількість експериментальних досліджень про фактори, які призводять бактерії до НС. Серед таких факторів є біоциди різних класів та механізмів дії [3]. Патогенні та умовно-патогенні ентеробактерії в НС відіграють важливу роль у контамінації об'єктів середовища життєдіяльності людини та можуть впливати на епідемічний процес поширення інфекційних хвороб. Для виявлення бактерій у НС застосовується широкий спектр методів альтернативних методам культивування і ПЛР, особливістю яких є пряме кількісне визначення життєздатності окремих бактеріальних клітин. З цією метою тривалий час використовуються високочутливі флуоресцентні методи [4]. Для візуалізації специфічних (цільових) біомолекул, які є маркерами клітинної життєздатності, застосовується властивість деяких гетероциклічних вуглеводнів (флуорофорів) до емісії фотонів при переході зі збудженого стану за умов опромінення досліджуваного матеріалу джерелом світла в короткохвильовій області спектра. За допомогою флуорофорів можуть бути виявлено широкий спектр структурних і функціональних маркерів життєздатності бактеріальних клітин: цілісність мембрани та її прохідність, протеїни (ферменти) та їхня активність, рибосоми, нуклеоїди та їхня функціональність [5]. Серед методів визначення життєздатності некультурабельних бактерій найбільш поширеними є методи виявлення життєздатності бактеріальних клітин, які застосовують швидке визначення живих, неживих і пошкоджених стресом клітин у бактеріальній культурі з використанням комбінації флуоресцентних барвників і вимірювання флуоресценції [Патент США № 4094745 від 13. 06. 1978 р…], [Патент США № 5939282 від 17. 08. 1999 p.]. Найбільш відомі барвники включають флуоресцеїну діацетат, карбоксифлуоресцеїну діацетат, флуоресцеїну ізотіоціанат, LIVE/DEAD Baclight™, бенгальський рожевий, кальцеїну метиловий ефір, Hoechst 33342, Родамін 123 (Rh 123), 3, 3'dihexyloxacarbocyanine iodide, Calcofluor white, йодід пропідію (PI), 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), бромід етидію, акридиновий помаранчевий, та ін. Однак, зазначені способи мають ряд суттєвих недоліків. Основні з них полягають в наступному: низька комерційна доступність (активно використовувані в світі LIVE/DEAD Baclight™, Hoechst 33342, DAPI є високовартісними і відсутні на ринку України); для деяких вищезазначених способів отримувані результати мають неоднозначну інтерпретацію. Наприклад, найбільш популярний комерційний барвник LIVE/DEAD Baclight ™ визначає лише 1 UA 107411 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 один маркер життєздатності - мембранну цілісність. Крім того, при дослідженні деяких видів хімічного стресу (вплив біоцидів) необхідно проводити тестування бактеріальних популяцій з визначенням декількох параметрів життєздатності клітин. Найближчим аналогом (прототипом) корисної моделі, що пропонується є спосіб кількісного визначення кількості життєздатних клітин молочнокислих бактерій у зразку [Патент ЄС № 1891436 від 11. 07. 2012 p.]. Даний спосіб включає стадії, що збігаються з запропонованим способом: 1) змішування суспензій клітин з композицією барвника, який зв'язується з окремими клітинами бактерій, що вказує на наявність мембранного потенціалу зазначених клітин; 2) виявлення оптичних властивостей фарбувальної композиції, зв'язаної з вищезазначеними окремими клітинами бактерій; 3) кількісне визначення числа життєздатних клітин у зразку. При цьому запропоновано використовувати барвники для оцінки мембранного потенціалу клітини, у тому числі Rh 123 (максимум збудження 510 нм, максимум емісії 534 нм, зеленожовта флуоресценція). Основним недоліком вищезазначеного прототипу є нездатність Rh 123 ефективно забарвлювати клітини ентеробактерій, які в основному слабопроникні для катіоноактивних зондів, до яких відноситься Rh 123. В основу корисної моделі поставлена задача розробити ефективний спосіб визначення життєздатних клітин у стрес-індукованих некультурабельних популяцій ентеробактерій шляхом підвищення рівня проникності їх мембран для барвника Rh 123, розчиненого в Tris-буфері з етилендіамінтетраоцтовою кислотою (Tris-EDTA буфер). Мембранна проникність клітин, яка пов'язана з трансмембранним потенціалом (близько 70 + + + мВ, негативний усередині клітини, як наслідок градієнтів концентрації К , Na й СI ), котрий підтримується активними транспортними процесами - популярний маркер життєздатності [6]. Для його визначення використовується властивість ліпофільного катіоноактивного флуорохромного барвника Rh 123 проникати вибірково тільки через неушкоджені мембрани і накопичуватись переважно в клітинах, що мають мембранний потенціал, зафарблюючи внутрішньоклітинні структури у відповідний (зелений) колір. В разі порушення цілісності мембрани барвник дифундує назовні за межі клітинної стінки EDTA характеризується специфічною дією (у концентраціях від 0,1 до 5 мМ) внаслідок адсорбції на лігандах поверхні мембран, що приводить до суттєвого підвищення їх проникності із збереженням Rh 123 у життєздатних клітинах. Загалом, запропонований спосіб визначення життєздатних клітин у стрес-індукованих некультурабельних популяцій ентеробактерій має наступні стадії: 1) змішування суспензій клітин з композицією EDTA та Tris буферу з Rh 123, який зв'язується з окремими клітинами бактерій, що вказує на наявність мембранного потенціалу зазначених клітин. Експериментальним шляхом встановлено, що оптимальним часом фарбування Rh 123 для ентеробактерій є 15 хвилин (див. нижче). Також встановлено, що найбільш прийнятними умовами для застосування барвника Rh 123 є добавлення наступної суміші EDTA та Tris буферу (10 ммоль Tris, 1 ммоль EDTA, рН=8). Rh 123 у кінцевій концентрації 13 мкмоль (10 мкг/мл) додається у Tris-EDTA буфер, що містить суспензії клітин ентеробактерій, підданих біоцидному стресу (наприклад після дії гіпохлориту натрію, перекису водню, саліцилової кислоти). Далі зазначені суспензії фільтруються через мембранні фільтри з подальшою флуоресцентною мікроскопією фільтруючої поверхні; 2) виявлення оптичних властивостей фарбувальної композиції, зв'язаної з окремими клітинами бактерій, адсорбованих на поверхні фільтра. Клітини, що мають зелену, або зеленожовту флуоресценцію вважаються життєздатними за ознакою цілісності мембран та електрохімічного мембранного потенціалу; 3) кількісне визначення числа життєздатних клітин (Rh-позитивних бактерій) у дослідженому зразку підраховується за допомогою флуоресцентної мікроскопії на мембранних фільтрах (ФММФ). Корисна модель дозволяє визначати два маркери життєздатності клітин ентеробактерій цілісність мембран і наявність електрохімічного мембранного потенціалу. Визначення оптимальної концентрації барвника Rh 123 для фарбування суспензій ентеробактерій. Оптимальна концентрація барвника Rh 123 для фарбування визначено з використанням трьох різних штамів ентеробактерій в логарифмічній фазі росту. Концентрація барвника вважалася оптимальною, якщо методом ФММФ визначалася максимальна кількість клітин, що мають зелену флуоресценцію, за найменшої концентрації барвника. Для запобігання 2 UA 107411 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 осмотичному стресу бактерії розчинялись у Юммоль Tris-буфера, рН 8,0. Бактерії були вирощені в бульйоні LB до експонентної фази, відмиті шляхом триразового центрифугування при 4500 g впродовж 10 хвилин і ресуспендовані у стерильному Tris-буфері до концентрації 6 близько 10 клітин/мл. Rh 123 додавався з основного розчину 1 мг/мл в етанолі (що тривалий час може зберігались в темряві при кімнатній температурі) до приготовлених вибірок суспензій ентеробактерій у різних концентраціях (від 1 до 15 мкг/мл) (Фіг. 1). Експериментальний час витримки суспензій у розчині барвника становило 5 хв. Потім + вибірки фільтрувались на мембранні фільтри в трьох паралельних повторах, Rh-позитивні (Rh ) клітини підраховували методом ФММФ. Результат розраховано у формі геометричного середнього. Для штамів Shigella та Salmonella результати були подібні. За даними експериментів щодо визначення оптимальної концентрації барвника встановлено, що найбільш оптимальною концентрацією для Rh 123 є 10 мкг/мл. Визначення оптимального часу фарбування суспензій ентеробактерій барвником Rh 123. Оптимальний час фарбування для барвника Rh 123 визначали, використовуючи три різних штами ентеробактерій в логарифмічній фазі росту. Час фарбування вважався оптимальним, якщо методом ФММФ визначалася максимальна кількість клітин, що мають зелену флуоресценцію, при найбільш короткому часі інкубації барвника. Вирощування бактерій, їх відмивання та приготування робочих суспензій здійснювали, як викладено вище. Час інкубації становив: 2, 5, 10, 15, 20, 25 й 30 хв. Потім вибірки фільтрувались + на мембранні фільтри в трьох паралельних повторах, і клітини Rh із зеленою флуоресценцією підраховувалися, використовуючи ФММФ. Результат представлено геометричним середнім (Фіг. 2). В результаті експериментів оптимізації часу фарбування суспензій ентеробактерій встановлено, що оптимальним часом фарбування для Rh 123 є 15 хвилин. Визначення оптимальної концентрації EDTA у Tris-EDTA буфері для суспензій ентеробактерій, що забарвлюються Rh 123. Результати попередніх експериментів вказують на велику недооцінку кількості життєздатних клітин внаслідок слабкого проникнення мембран грамнегативних мікроорганізмів для катіоноактивних барвників, у тому числі для Rh 123. З метою усунення цього недоліку і для підвищення проникності Rh 123 в клітини до вибірок суспензій трьох різних штамів ентеробактерій в логарифмічній фазі росту в Tris-буфер додавали EDTA в дослідних концентраціях: 0,1, 0,5, 1, 3, 5, 10 ммоль. При застосуванні визначеної оптимальних концентрації Rh 123 (10 мкг/мл) і часу фарбування (15 хв.) концентрація EDTA вважалася оптимальною, якщо методом ФММФ визначалася максимальна кількість клітин, що мають зелену флуоресценцію, за найменшої концентрації EDTA (Фіг.3). Для всіх взятих в експеримент штамів Escherichia, Shigella та Salmonella результати були подібні. Дані експериментів оптимізації концентрації EDTA у Tris-буфері довели, що найбільш обґрунтовано застосування барвника Rh 123 у Tris-буфері що містить 1 ммоль EDTA. Кореляція показників виміру мембранного потенціалу зі стандартним методом посіву на живильні середовища. Для порівняння кількості бактерій, що володіють мембранним потенціалом і кількістю культурабельних бактерій в одній і тій же вибірці, тестувалися суміші суспензій (щільністю біля . 5 7,0 10 КУО/мл) живих і деполяризованих граміцидином клітин ентеробактерій у пропорціях з 20, + 40, 60, 80 і 100 % живих клітин. У вибірках сумішей в Tris-EDTA буфері Rh бактерії було підраховано методом ФММФ. У цих же вибірках визначалося число колонієутворюючих одиниць (КУО/мл) методом посіву на агаризоване середовище LB з наступною інкубацією при 37 °C протягом 24-36 годин. На Фіг. 4 представлено кореляційний зв'язок між кількістю живих бактерій в суспензіях Escherichia coli, вирослих на LB-arapi (КУО) і Rh+, підрахованих методом ФММФ. Отримання некультурабельних популяцій ентеробактерій Тестові бактеріальні штами Escherichia coli, Shigella sonnei, S. flexneri, Salmonella enteritidis для отримання некультурабельних популяцій вирощувались до експонентної фази в бульйоні LB. Культури були тричі відмиті центрифугуванням при 4500 g. протягом 10 хвилин, ресуспендовані у Tris-EDTA буфері до оптичної щільності 0,5 одиниць за McFarland (біля 6 logio клітин/мл). В подальшому до підготовлених суспензій були додані біоциди. Тестовими біоцидами слугували гіпохлорит натрію, перекис водню і саліцилова кислота. Після експозиції та + серійних розведень аліквоти забарвлювали Rh 123 у Tris-EDTA буфері та визначали Rh клітини бактерій методом ФММФ та висівали на чашки з агаром для визначення культурабельності. Число некультурабельних клітин (N) складало різницю між геометричним середнім показників 3 UA 107411 U 5 10 15 20 25 30 мембранного потенціалу (А) й найбільшим показником КУО (С), тобто: N = А - С [6]. Опробування запропонованого способу визначення мембранного потенціалу клітин стресіндукованих некультурабельних ентеробактерій дозволило встановити, що кількість некультурабельних ентеробактерій більш залежна від дози біоциду, ніж від часу їх експозиції і закономірно зростає при збільшенні дози біоциду для всіх досліджених видів ентеробактерій [7]. Таким чином, за результатами проведених досліджень розроблено новий спосіб визначення життєздатних клітин стрес-індукованих некультурабельних ентеробактерій, суть якого полягає в тому, що як розчинник флуоресцентного барвника Rh 123 застосовується Tris-EDTA буфер, який забезпечує підвищення рівня проникності флуорохрому крізь мембрани грамнегативних бактерій. Запропонована корисна модель може бути використана у галузях медичної та санітарної мікробіології. Джерела інформації: 1. Oliver J. D. Formation of viable but nonculturable cells [Text] // Starvation in bacteria / Ed. S. Kjelleberg. - New York, N.Y… Plenum Press, 1993. - p. 239-271. 2. Resuscitation of Escherichia coli VBNC cells depends on a variety of environmental or chemical stimuli [Electronic resource] / D. Pinto, V. Almeida, Santos M. Almeida [et al.] // Journal of Applied Microbiology-2011. - V. 110(6) - P. 1601-1611. - DOI: 10.111 l/j.1365-2672.2011.05016.x 3. Pinto, D. Thirty years of viable but nonculturable state research: unsolved molecular mechanisms [Electronic resource] / D. Pinto, Santos, Mario A., Chambel, L. // Critical reviews in microbiology-2013. - V. 41(1) - P. 61-76.-DOI:10.3109/1040841X.2013.794127 4. Davey, H. M. Flow cytometry and cell sorting of heterogeneous microbial populations: the importance of single-cell analyses [Electronic resource] / H. M. Davey, D. B. Kell // Microbiological Reviews.-1996. - V. 60. - P. 641-696. - Mode of access: http://mmbr.asm.Org/content/60/4/641.full.pdf 5. Shapiro, H. M. Microbial analysis at the single-cell level: tasks and techniques [Electronic resource] / // J. Microbiol. Methods.-2000. - V. 42. - P. 3-16. - Mode of access: http://dzumenvis.nic.in/Phvsiology/pdf/Microbial%20analvsis%20at%20the %20single.pdf 6. Юдін, І. П. Фенотипічні особливості некультурабельної фракції Escherihia coli ATCC 25922 [Текст] /1. П. Юдін // Інфекційні хвороби.-2005.-№ 2.-С. 70-73 7. Визначення некультурабельного стану ентеробактерій за ознакою електрохімічної активності [Текст] / Л. Б. Суходуб, І. П. Юдін, Б. І. Гушилик, С. В. Похил, В. В. Казмірчук // J. Clin. Exp. Med. Res.-2015.-3(1)-С. 51-56 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 35 Спосіб визначення мембранного потенціалу клітин стрес-індукованих некультурабельних ентеробактерій, що включає змішування суспензій клітин з композицією барвника, який відрізняється тим, що як розчинник флуоресцентного барвника Родамін 123 (Rh 123) застосовується Tris-буфер з етилендіамінтетраоцтовою кислотою, який забезпечує підвищення рівня проникності флуорохрому крізь мембрани грамнегативних бактерій. 4 UA 107411 U 5 UA 107411 U Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6