Композиційний біопрепарат для лікування запалення тканин пародонта і корекції асоційованих гастродуоденальних розладів кишечнику у дітей

Реферат: Винахід належить до біопрепарату для лікування запалення тканин пародонта і корекції асоційованих гастродуоденальних розладів кишечнику у дітей, причому містить штами пробіотичних бактерій L. acidophilus ІMB В-7413, L. casei ІMB В-7412 та L. delbrueckii IMB В-7414 у рівних кількісних співвідношеннях і носій-пребіотик рослинного походження, що вибирають з водних екстрактів ягід вишні або чорниці, овочевого соку з перцю, моркви та помідор і яблучно8 пектинового концентрату. Ефективна кількість кожного з зазначених вище штамів складає 10 КУО/мл. UA 109353 C2 (12) UA 109353 C2 UA 109353 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до галузі медицини, зокрема стоматології та гастроентерології і може бути використаний для лікування карієсу зубів та захворювань тканин пародонта дітей із асоційованими гастродуоденальними розладами кишечнику. Захворювання тканин пародонта і карієс зубів є одними з найпоширеніших захворювань рота дітей і підлітків. Основними передумовами розвитку захворювань тканин пародонта та каріозного процесу є недотримання правил гігієни рога [1], наявність каріозогенної мікробіоти [2] і сприятливих умов для її росту та розмноження. Супутніми патологіями запалення тканин пародонта у дітей є хронічні гастрити і дуоденіти, які в свою чергу пов'язані з порушенням мікробного ценозу кишечнику [3, 4] - прототипи. Для підтримки і відновлення біоценозу травного тракту і профілактики карієсу зубів застосовують бактеріальні препарати, як от пробіотик Біфацил (ТОВ "АстраФарм", Україна), що містить живі ліофілізовані бактерії Bifіdobacterium adolescentis і Lactobacillus acidophilus. Найбільш близькими аналогами до запропонованого винаходу є: 1) пробіотик Lactobacillus fermentum CECT 7472 активний проти ряду ентеропатогенів; 2) жувальна гумка з Lactobacillus anti-caries, які характеризуються специфічною дією проти збудника карієсу зубів Streptococcus muluns (BASF). Однак, використання описаних вище препаратів не забезпечує одночасної поєднаної дії стосовно збудників запальних процесів тканин пародонта, карієсу зубів у дітей і підлітків і асоційованих із ними шлунково-кишкових розладів. Наявні препарати не випускаються в оптимальних і зручних для дітей лікарських формах. Задачею винаходу є конструювання нового композиційного біопрепарату (синбіотику) з пробіотичною складовою (пробіотичним компонентом) і рослинним (пребіотичним) наповнювачем (носієм) для поєднаної і одночасної профілактики і лікування запальних процесів тканин пародонта та карієсу зубів у лікарській і харчовій формах, зручних для вживання дітьми і підлітками. Поставлена задача вирішується шляхом застосування штамів лактобактерій Lactobacillus acidophilus 042 (ІMB В-7413). L. casei 021 (IMB В-7412) та L. delbrueckii 0-22 (IMB В-7414) як пробіотичної складової та носіїв рослинного походження як пребіотичної складової композиційного біопрепарату для лікування запалення тканин пародонта у дітей і корекції асоційованих гастродуоденальних розладів кишечнику. Штами лактобактерій: Lactobacillus acidophilus 042 (IMB В-7413), L. casei 021 (IMB В-7412) та L. delbrueckii 0-22 (IMB B-7414) були ізольовані з фекалій здорової дитини і ферментованої за традиційною рецептурою квашеної капусти. Вони здійснюють спрямовану протимікробну дію на домінуючі збудники запалення тканин пародонта і умовно-патогенні мікроорганізми, що спричиняють гастро-дуоденальні розлади кишечнику. Як пребіотична складова і одночасно носій у композиційному біопрепараті згідно з винаходом може бути використаний водний нативний екстракт вишень (Primus cerasus), який характеризується синергічною антимікробною ефективністю і стимулює ріст відібраних штамів лактобактерій. Придатними також є інші носії фруктово-овочевого походження з доведеною протизапальною і синергічною дією на ріст бактерій, а саме: 1) водний екстракт ягід чорниці (Vaccinium myrtillus L.), багатих на фенольні сполуки і антоціани; 2) готовий продукт - овочевий сік (компоненти - перець, морква, помідори) при фіксованому навантаженні бактеріальної 9 біомаси на кожні 100 мл суміші 10 КУО мікроорганізмів; 4) яблучно-пектиновий концентрат, отриманий шляхом дезінтегрування яблук, екстрагування у водному середовищі, фракціонування та висушування з наступним перемелюванням та просіюванням. Отже, об'єктом винаходу є композиційний біопрепарат для лікування запалення тканин пародонта і корекції асоційованих гастродуоденальних розладів кишечнику у дітей, який відрізняється тим, що містить штами пробіотичних бактерій Lactobacillus acidophilus 042 (ІMB В7413), L. casei 021 (ІMB В-7412) та L. delbrueckii 0-22 (IMB В-7414) і носій-пребіотик, вибраний з водних екстрактів ягід вишні або чорниці, овочевого соку з перцю, моркви та помідор і яблучнопектинового концентрату. Штами вказаних бактерій містяться у біопрепараті згідно з винаходом 8 у рівних кількісних співвідношеннях. Ефективна кількість кожного з вказаних штамів складає 10 КУО/мл. Композиційний біопрепарат розроблений наступним чипом. На підставі огляду стоматологами і гастроентерологами 80-ти рандомізовано відібраних дітей сформовано три групи: а) контрольна - діти, які не мали ознак карієсу зубів, запалення тканин пародонта і будь-яких реєстрованих захворювань шлунково-кишкового тракту; б) перша експериментальна група - пацієнти, у яких діагностовано карієс зубів, запалення тканин пародонта, але у яких не виявлено симптомів гастродуоденальних порушень у кишечнику; в) друга експериментальна група - пацієнти, які перебувають на диспансерному обліку у лікаря 1 UA 109353 C2 гастроентеролога та мають чітко виражені ознаки карієсу зубів, запалення тканин пародонта. У всіх обстежених дітей досліджено мікробіоту рота і кишечнику (табл. 1-3). Таблиця 1 Середні значення індикаторних мікроорганізмів, виділені зі слини пацієнтів досліджуваних груп № з/п 1 2 3 4 5 6 7 Індикаторні мікроорганізми Escherichia coli Streptococcus salivarius Streptococcus mitis Bifidobactehum breve Candida spp. Enterococcus faecalis Lactobacillus spp. Контрольна група 0 4 2,3±0,2 (10 ) 0 6 9,8±0,7 (10 ) 4 4,3±0,6 (10 ) 4 6,3±0,4 (10 ) 6 2,3±0,2 (10 ) Перша група Титр, КУО/мл 2 1,8±0,2 (10 ) 7 7,9±1,4 (10 ) 4 5,6±0,4 (10 ) 6 1,2±0,3 (10 ) 6 6,8±0,4 (10 ) 4 3,3±0,7 (10 ) 3 4,9±0,8 (10 ) Друга група 4 5,3±0,2 (10 ) 6 3,1±0,4 (10 ) 5 4,3±0,7 (10 ) 6 1,3±0,1 (10 ) 6 2,9±0,8 (10 ) 6 7,9±0,6 (10 ) 0 Таблиця 2 Середні титри індикаторних мікроорганізмів, виділених з ясенної борозни пацієнтів досліджуваних груп № з/п Індикаторні мікроорганізми 1 2 3 4 5 6 Escherichia coli Streptococcus salivarius Streptococcus mitis Candida spp. Enterococcus faecalis Lactobacillus spp. Контрольна група 0 4 7,9±0,9 (10 ) 0 4 6,2±0,4 (10 ) 4 9,8±0,3 (10 ) 6 2,3±0,2 (10 ) Перша група Титр, КУО/мл 2 8,0±0,5 (10 ) 6 1,3±0,2 (10 ) 6 3,3±0,6 (10 ) 4 4,3±1,2 (10 ) 4 7,7±0,8 (10 ) 6 2,2±0,6 (10 ) Друга група 5 4,2±0,2 (10 ) 6 1,0±0,1 (10 ) 0 5 9,3±0,2 (10 ) 0 0 5 Таблиця 3 Середні загальні титри індикаторних мікроорганізмів, виділених з фекалій пацієнтів досліджуваних груп № з/п 1 2 3 3 4 5 10 15 Індикаторні мікроорганізми Escherichia colі УПЕ (умовно-патогенні ентеробактерії) S. aureus Candida spp. Enterococcus faecalis Lactobacillus spp. Контрольна група Перша група 6 0,3±0,2 (10 ) 8,9±0,8 (10 ) 3 6,3±0,5 (10 ) 0 4 7,3±0,9 (10 ) 7 4,7±0,2 (10 ) 6 1,3±0,2 (10 ) 9,5±0,9 (10 ) 4 6,9±0,5 (10 ) 7 3,8±0,4 (10 ) 8 2,3±0,2 10 1,1±0,8 (10 ) Друга група 6 8,8±0,2 (10 ) 8 4 9,8±1,8 (10 ) 5 7,6±0,8 (10 ) 6 2,3±0,2 (10 ) 5 9,0±0,7 (10 ) 4 2,6±0,4 (10 ) 7 7 Мікробний ценоз слизових оболонок рота і вмісту кишечнику дітей з запальними процесами до того ж характеризувався підвищеною кількістю мікроорганізмів роду Candida (табл. 1-3). Е. faecalis у великих титрах ізольовано лише в слині дітей, у яких виявлено гастродуодeнальні порушення у кишечнику. Представники роду Lactobacillus повністю відсутні в пробах слини і ясенної борозни і знайдені в незначних кількостях у вмісті товстого кишечнику (табл. 3). Таким чином до індикаторних мікроорганізмів зазначених запальних процесів рота належать бактерії роду Streptococcus, тоді як маркерними ознаками гастродуоденітів є збільшені титри Е. соlі (в тому числі зі зміненою ферментативною активністю), збільшеною частотою виділення інших умовно-патогенних ентеробактерій (УПЕ, насамперед клебсієл, цитробактеру і протею), поява у значних титрах штамів S. aureus і Candida spp., та зменшення лактобактерій і ентерококів, що певною мірою уточнює наявні літературні дані. 2 UA 109353 C2 5 10 15 20 Дослідження всіх ізольованих від дітей із ознаками карієсу зубів, захворюваннями тканин пародонта і гастродуоденальної хвороби кишечнику штамів мікроорганізмів на їх відношення до Ампіциліну, Ванкоміцину, Гентаміцину, Левофлоксацину, Лінкоміцину, Меропенему, Метронідазолу, Моксифлоксацину, Новобіоцину, Оксациліну, Олеандоміцину, Офлоксацину, Пеніциліну, Рифампіцину, Стрептоміцину, Тикарциліну, Гобраміцину, Цифлоксацину, Цефамандолу, Цефепіму, Цефоперазону, Цефуроксину показало, що найбільш чутливим до їх дії виявилися штами лактобацил, тоді як тестовані штами, S. aureus і С. albicans характеризувалися резистентністю до цілого ряду тестованих антибіотиків. Із числа ізолятів з ферментованих традиційних продуктів і вмісту шлунково-кишкового тракту здорових осіб методом сумісного культивування нами виділено три штами лактобактерій, які характеризувались високовибірковою антагоністичною активністю стосовно культур стрептококів S. aureus, Р. aeruginosa, C. albicans і ізольованих умовно-патогенних ентеробактерій (УПЕ), виділених від хворих дітей (табл. 4). Таким чином для створення нового біопрепарату були відібрані три штами мікроорганізмів. Два штами лактобактерій (L. casei та L. delbrueckii), які виділені у 2011 р. із вмісту кислої капусти домашнього виробництва за оригінальною (традиційною) рецептурою ферментації (с. Бедевля, Тячівський район в Закарпатській області) і депоновані в депозитарії Інституту мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного (реєстраційні номери L. casei IMB В-7412 та L. delbrueckii IMB В7414) і штам L. acidophilus IMB В-7413, який ізольовано з кишечнику здорової дитини як перспективний антагоніст умовно-патогенних мікроорганізмів, титри яких збільшуються при гастродуоденітах кишечнику. Таблиця 4 Антибактеріальна дія (діаметр затримки росту, мм) штамів лактобактерій проти штамів умовнопатогенних бактерій, виділених від дітей, хворих на карієс зубів та захворювання тканин пародонта 15,2±0,7 20,0±0,9 5,1±0,3 14,8±1,4 28,4±1,8 24,8±1,8 Lactobacillus delbrueckii 30,5±0,9 18,9±0,3 26,5±1,4 14,5±1,2 22,0±1,4 33,0±3,1 Lactobacillus acidophilus 0 30,2±0,2 31,2±0,9 8,0±2,2 12,2±0,7 22,1±1,2 16,0±1,7 23,6±4,2 16,2±1,1 19,0±1,9 22,0±0,7 15,1±2,2 17,6±1,6 20,5±1,3 16,3±2,6 17,7±2,4 22,0±1,9 30,4±1,4 № з/п Тест-культура Lactobacillus casei 1 2 3 4 5 6 S. salivarius S. mitis S. mutans S. aureus Enterococcus faecalis Enterobacter cloacae Proteus morganii (Morganii morganii) E. coli (лактозо-негативний штам) Klebsiella pneumonia subsp. oxytoca Candida albicans 7 8 9 10 25 30 35 Результати тестування антимікробних властивостей відібраних лактобактерій в експериментах in vitro та in vivo (на BALB/c мишах) показали, що мікроби-антагоністи були високоактивними в першу чергу стосовно штамів стрептококів і стафілококів і характеризувалися суттєвою пригнічувальною ефективністю стосовно ізольованих штамів УПЕ і Сandіda albicans. У композиційному біопрепараті як носій бактерій можуть застосовуватись різні рослинні наповнювачі (водні екстракти, соки) з метою підвищення смакових якостей біопрепарату і забезпечення оптимальної (зручної) лікарської форми їх застосування. Однак, головне завдання полягало також у виборі натуральної сировини із вираженою синергічною протибактеріальною дією і доведеною пребіотичною активністю. Було досліджено вплив екстрактів цілого ряду їстівних рослин [4] на різні групи мікроорганізмів - представників коменсальної та умовно-патогенної мікробіоти, а також вплив яблучного пектину (15 % і 30 %) на ріст Lactobacillus casei та Lactobacillus delbrueckii. Проведені дослідження дали змогу відібрати екстракти, які не лише інгібують таргетні патогенні та умовнопатогенні бактерії, але й проявляють при цьому стимулюючий вплив на штами L. casei, L. delbrueckii, L. acidophilus, що є пробіотичною складовою синбіотику. 3 UA 109353 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Методом сумісного культивування таку дію виявили водні екстракти вишень (Prunus cerasus) і чорниці (Vaccinium myrtillus L.), овочевий сік із перцю, моркви і помідор. Зокрема нами показано, що екстракт вишень пригнічує ріст Е. faecalis, E. faecium, К. pnewnoniae subsp.oxytoca, P. morganii, L. salivarius однак стимулює ріст L. delbrueckii, тоді як екстракт чорниць інгібує Е. faecalis і водночас стимулює і L. acidophilus. Тестований овочевий сік пригнічує ріст лактозонегативного штаму Е. соlі, стимулює ріст L. casei та L. delbrueckii. 15 % яблучний пектин проявив стимулюючий вплив на L. delbrueckii, а 30 % - на L casei та L. delbrueckii. Крім того, яблучний пектин може бути носієм для ліофілізовано висушених бактерій, що дозволить одержати сухий концентрат композиційною біопрепарату згідно з винаходом. Вказана форма біопрепарату має ряд переваг у порівнянні з готовим рідким біопрепаратом, оскільки термін його придатності буде значно довшим. Композиційний біопрепарат було протестовано в обмежених клінічних дослідженнях на 40 добровольцях - дітях шкільного віку (від 12 до 15 років), серед яких у 28 осіб клінічно діагностовано карієс зубів та захворювання тканин пародонта і супутній гастродуоденіт, а 12 осіб становили контрольну групу. Протягом перших 7 діб діти контрольної групи ополіскували рота суспензією L. delbrueckii та протягом наступних 7 діб - суспензією L. casei. Для цього ліофільно висушені штами 8 лактобактерій у концентрації 10 КУО в 1 мл безпосередньо перед вживанням розчиняли у кип'яченій воді кімнатної температури. Дітям основної групи протягом 14 діб в якості напою давали вишневий екстракт з суспендованими бактеріями згідно з винаходом. На початку експерименту, і кінці першого і другого тижня проведено обстеження дітей лікарем стоматологом і лікарем гастроентерологом (діти, які прийняли участь у дослідженні, мають хронічний гастродуоденіт та перебувають на диспансерному обліку). У всіх пацієнтів проведено аналіз мікробного ценозу слизових оболонок і вмісту кишечнику, визначено рівні секреторного IgAs в слині і копрофільтраті до і після прийому біопрепарату. В результаті обмежених клінічних випробувань було доведено, що домінантними серед усіх ідентифікованих видів аеробних мікроорганізмів, ізольованих із зубного нальоту хворих дітей були грам-позитивні коки, зокрема гетерогенна група стрептококів (S. salivarius, S. mitis). Із рога виділили кілька видів ентеробактерій (K. oxytoca, лактозонегативний штам Е. соlі, Е. faecalis) і мікроскопічні триби Candida albicans, Cryptococcus hymiloca ma Trichosporon spp. Мікробний аналіз вмісту ясенної борозни показав подібні результати стосовно видового складу 5 6 ізольованих аеробних мікроорганізмів, однак останні виявили у більш високих титрах (10 чи 10 КУО/мл). Після двотижневого застосування біопрепарату відмічено зміни мікробіоти слизових оболонок ротової порожнини і кишечнику, що свідчить про наявність терапевтичного ефекту його застосування. Найбільш суттєвими були зміни в мікробному ценозі біля шийки зуба, де у більшості 3 випадків спостерігали значне зменшення титрів стрептококів (до 10 КУО/мл), які є основною причиною формування нальоту на зубах, запалення тканин пародонта та утворення карієсу зубів. У хворих дітей до початку клінічного експерименту реєстрували майже повну відсутність лактобактерій як у вмісті ясенної борозни, так і в пробах слини. Після 2-тижневого застосування біопрепарату як в слині дітей, так і в ділянці шийки зуба були виявлені обидві лактобактерії, які 6 містяться в препаратах. Титри біфідобактерій (10 ) представлені родом Bifidobacterium breve протягом дослідження залишалися незмінними. У більшості дітей до застосування біопрепарату, згідно з винаходом, у вмісті кишечнику переважали умовно-патогенні мікроорганізми (табл. 3). Їх кількість після 2-тижневого вживання біопрепарату була нижчою за відповідні значення у контрольній групі (табл. 5). Слід відмітити, 1 що вміст стафілококів знизився до ліміту визначення (до 10 ). Таким чином, використання композиційного препарату на основі лактобактерій, згідно з винаходом, забезпечує відновлення мікробіоти слизових оболонок рота і нормалізації мікробного ценозу кишечнику. Для підтвердження ефективності використання біопрепарату, згідно з винаходом, тестували активність локального імунітету слизових оболонок ротової порожнини і кишечнику, визначаючи зміни рівнів секреторного IgAs у дітей до і після застосування біопрепарату у слині (табл. 6) і копрофільтраті (табл. 7). Рівні IgAs в слині більшості обстежених дітей з діагностованим карієсом зубів та захворюваннями тканин пародонта і супутнім гастродуоденітом значно вищі, що свідчать про перебіг у них запальних процесів. 60 4 UA 109353 C2 Таблиця 5 Середні титри мікроорганізмів, виділених з вмісту кишечнику дітей до і після застосування препарату № з/п Індика горні мікроорганізми 1 2 До застосування Через два тижні після біопрепарату на початку експерименту початку експерименту Титр, КУО/мл 6 4 7±0,3 (10 ) 1±0,3 (10 ) 4 6 8,5±0,2 (10 ) 2,1±2,3 (10 ) Escherісhia coli (лактозо-негативна) Enterococcus faecalis Інші УПЕ (умовно-патогенні ентеробактерії) загальна кількість Сitrobacter freundii, Proteus mirabilis, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae subsp. oxytoca Staphylococcus aureus Cryptococcus humicola Lactobacillus spp. 3 4 5 6 6 6,7±0,3 (10 ) 4 0 6 2,5±0,2 (10 ) 6 3,3±0,7 (10 ) 2,8±0,5 (10 ) 5,2±0,3 (10 ) 6 7,5±0,4 (10 ) 4 4,3±0,3 (10 ) 4 Таблиця 6 Рівень секреторного IgA в слині дітей до і після застосування препарату № з/п 1 2 3 4 5 5 10 Кількість осіб серед загального числа обстежених 4 9 7 6 2 Середнє значення рівня IgA в слині, мг/л До застосування Через тиждень Через два тижні біопрепарату па початку після початку після початку експерименту експерименту експерименту 1559,6±0,32 2000±0,45 200±0,21 676,3±0,41 59,32±0,2 200±0,23 667,6±0,23 42,4±0,33 200±0,3 624,3±0,21 36,26±0,24 90,03±0,23 89,9±0,11 47,64±0,15 40,92±0,14 Дослідження рівнів секреторного IgAs в слині дітей, що приймали композиційний біопрепарат із лактобактерій, довели, що вже через тиждень його застосування рівень IgAs у 22 пацієнтів знизився до 40 мг/л, і лише в 4-ох випадках підвищився аж від 1559,6 до 2000 мг/л. Ще через тиждень його застосування рівень IgAs зріс і в середньому дорівнював близько 200 мг/л у більшості обстежених (табл. 6), що власне є в межах норми (від 115,3-299,7 мг/л - для дорослих осіб). У контрольній групі у дітей (12 осіб) рівень секреторного IgAs коливався в межах від 66,76 до 165,19 мг/л (табл. 8). Таблиця 7 Рівень секреторного IgAs в копрофільтраті дітей до і після застосування препарату № 1 2 3 4 5 Середнє значення рівня ІgA в копрофільтраті, мг/л Кількість осіб серед загального До застосування Через два ніжні після початку числа обстежених біопрепарату на початку експерименту експерименту 4 0,12±0,04