Динатрієва сіль 2-(2-метил-5,8-диметоксихінолін-4-ілтіо)сукцинатної кислоти, що проявляє антиоксидантну та нейропротекторну активності

Реферат: Винахід стосується синтезу біологічно активної хімічної сполуки, саме до динатрієвої солі 2-(2метил-5,8-диметоксихінолін-4-ілтіо)сукцинатної кислоти, що проявляє антиоксидантну активність та нейропротекторну активність. UA 113479 C2 (12) UA 113479 C2 NaO H3 C O O O ONa S N H3 C O CH3 UA 113479 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до синтезу біологічно активних хімічних сполук, а саме до динатрієвої солі 2-(2-метил-5,8-диметоксихінолін-4-ілтіо)сукцинатної кислоти, що проявляє антиоксидантну активність (АОА) та нейропротективну активність (НПА). Відома сполука - 2-метил-6-метоксихіноліл-4-тіоацетат натрію (Патент України № 28789, C2, МПК C07D215/36 2-метил-6-метоксихіноліл-4-тіоацетат натрію, що проявляє протиішемічну та антиоксидантну активність / Омельянчик Л.О., Бражко О.А., Бєленічев І.Ф., Завгородній М.П.; заявник і патентовласник ЗНУ; Заявл. 23.09.1997; опубл. 15.05.2002. - Бюл. № 5. - 3 с.), що містить хіноліновий цикл (2-метил-6-метоксихінолін-4-ільного радикала), залишок меркаптокарбонової кислоти (оцтову кислоту), атоми cульфуру та натрію. Сполука проявляє протиішемічну та антиоксидантну активність. Недоліком прототипу є значно вища токсичність, ніж у сполуки, що заявляється. Спільними ознаками з рішенням, що заявляється, є наявність хінолінового циклу (2-метил-6метоксихінолін-4-ільного радикала), залишку меркаптокарбонової кислоти (оцтова кислота) та атомів cульфуру і натрію. Структурним аналогом рішенням є 3-(2-метил-5,8-диметоксихінолін-4-ілтіо)пропанова кислота. Ця сполука має антиоксидантну активність (заявка в Україні u 2015 06614, дата подачі заявки 06.07.2015 р., МПК С07D215/00, C07D215/22 / 3-(2-метил-5,8-диметоксихінолін-4ілтіо)пропанова кислота, що проявляє антиоксидантну активність / заявник і патентовласник ЗНУ; що містить хіноліновий цикл (2-метил-5,8-диметоксихінолін-4-ільного радикала) та залишок меркаптокарбонової кислоти (пропанова кислота), та атома сульфуру. Недоліком аналога є недостатньо виражена антиоксидантна активність. В основу винаходу поставлено задачу синтезувати сполуку, що матиме антиоксидантну та нейропротективну активності, яка шляхом поєднання хінолінового циклу з двома метоксигрупами у 5-му та 8-му положенні, сукцинатної кислоти та атомів сульфуру і натрію, дозволяє розширити арсенал біологічно активних сполук та значно підвищити зазначені активності сполуки. Суттєвими ознаками рішення є наявність: - хінолінового циклу 2-метил-5,8-диметоксихінолін-4-ільного радикала; - сукцинатної кислоти; - атомів сульфуру; - атомів натрію. Відмінними від прототипу ознаками є наявність сукцинатної кислоти, атомів натрію. Поєднання в одній молекулі заявлених компонентів забезпечує підвищення (в 2 рази) водорозчинності та обумовлює одночасну антиоксидантну та нейропротекторну активності. На кресленні зображено структурну формулу динатрієвої солі 2-(2-метил-5,8диметоксихінолін-4-ілтіо)сукцинатної кислоти (ДНХС), що проявляє антиоксидантну та нейропротекторну активності. Процес одержання сполуки складається з: - розчинення 0,05 мол 2-метил-5,8-диметоксихінолін-4-хлорохіноліну в 200 мл діоксану; - приготування розчину 0,05 мол 2-меркаптосукцинатної кислоти в 100 мл діоксану; - змішування цих розчинів; - кип'ятіння суміші до утворення осаду; - охолодження суміші до кімнатної температури; - зливання діоксанового розчину; - приготування 0,1 мол метанольного розчину натрію гідроксиду; - додавання до реакційної суміші метанольного розчину натрію гідроксиду до рН 8,5; - перегонки розчинника під вакуумом; - збирання осаду на фільтрі; - промивання осаду діетиловим ефіром; - перекристалізації сполуки з метанолу. Приклад одержання сполуки: до розчину 0,05 мол 2-метил-5,8-диметокси-4-хлорохіноліну в 200 мл діоксану додавали 0,05 мол 2-меркаптосукцинатної кислоти розчиненої в 100 мл діоксану. Отриманий розчин кип'ятили протягом 0,5 год., охолоджували, розчинник зливали. До осаду, що утворився, додавали 0,1 мол метанольного розчину натрію гідроксиду до досягнення рН=8,5. Розчинник переганяли під вакуумом. Осад, що утворювався, відфільтровували, промивали діетиловим ефіром, висушували та кристалізували з метанолу. Вихід динатрієвої солі 2-(2-метил-5,8-диметоксихінолін-4-ілтіо)сукцинатної кислоти 75 %. Брутто-формула - C16H15NNa2О6S. Знайдено: С 48.75; Н 3.90; N 3.60; S 8.20. Вирахувано: С 48.61; Н 3.82; N 3.54; S 8.11. 1 UA 113479 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Динатрієва сіль 2-(2-метил-5,8-диметоксихінолін-4-ілтіо)сукцинатної кислоти - кристалічна речовина жовтуватого кольору з температурою плавлення 300 °С розкл. (з метанолу), розчинна у воді, метанолі, малорозчинна в етанолі, нерозчинна в діетиловому ефірі, хлороформі, ацетоні. Чистота сполуки контролювалась і підтверджена методом тонкошарової хроматографії на пластинках "Sorbfil" у системі розчинників: метанол-хлороформ(1:1). Значення Rf100=48. Хімічну структуру динатрієвої солі 2-(2-метил-5,8-диметоксихінолін-4-ілтіо)сукцинатної 1 кислоти доведено даними спектроскопії ядерного магнітного резонансу ( Н ЯМР). Дані, отримані 1 з Н ЯМР спектра (знято на приладі АС-300 у CF3COOD): стандарт - ТМС, -шкала, м.д.: 2,85 (3Н, с, СН3); 3,30 (2Н, м, СН2); 3,50 (1Н, м, СН); 4,00 (6Н, подв. с, 2ОСН3); 4,90 (1Н, с, SCH); 6,707,20 (3Н, м, Наром). 1 У Н ЯМР спектрі сполуки спостерігається складний мультиплет протонів ароматичних ядер (=7,20-7,95 м. д.). Замісники в хіноліновому циклі проявляються сигналами, що є характерними для хімічного зміщення метальної та алкоксигруп (відповідно синглетом (2-СН3) - =2,85 м. д. та подвійним синглетом (5,8-(ОСН3)2) - =4,00 м. д.). Сигнали протонів тіоалкільної групи в положенні 4 хінолінового циклу проявляють себе відповідними мультиплетами (SCH - =4,90 м. ч., СН - =3,50 м. ч., СН2 - =3,50 м. ч.), що характеризують залишок сукцинатної кислоти. Летальну дозу (ЛД50) визначали на білих безпородних мишах вагою 18-22 г за експресметодом В.Б. Прозоровського при внутрішньоочеревинному введенні досліджуваної сполуки (Прозоровский В.Б. Табличный метод определения ЛД50 (DL50) веществ с низкой биологической активностью / В.Б. Прозоровский, М.П. Прозоровская // Фармакология и токсикология. - 1980. Т. 43, № 6. - С. 733-735). Не спостерігалося загибелі тварин при введенні препарату в дозі 2000, 3000, 5000 мг/кг, вони були живі та активні як через 12, 24 год., так і на 14 добу. У мишей не була порушена рефлекторна активність, глибина та частота дихання. Прийом води, їжі, екскреція тварин не зазнали порушень. Відсутні були коливання маси тіла порівняно з контрольною групою тварин. LD50 динатрієвої солі 2-(2-метил-5,8-диметоксихінолін-4ілтіо)сукцинатної кислоти становила більше 5000 мг/кг. Це дозволило цю сполуку віднести до VI класу токсичності - нешкідливі речовини. Для оцінювання антиоксидантної та нейропротекторної активностей була використана модель неповної глобальної ішемії головного мозку, яка найбільш адекватна клінічним проявам ішемічного інсульту, а саме модель активації вільнорадикального окислення при експериментальній циркуляторній ішемії головного мозку і захисний ефект інфузії нормокисневонасиченої суміші антиоксидантів. Цю модель відтворювали шляхом двобічної перев'язки загальних сонних артерій. Двобічну перев'язку загальних сонних артерій виконували під етамінал-натрієвим наркозом (40 мг/кг) з використанням хірургічного доступу шляхом виділення сонних артерій та одночасного накладання на них шовкової лігатури. Досліджувану сполуку вводили 1 раз на добу протягом усього експерименту в дозі 100 мг/кг перорально. Як препарат порівняння використовували "Емоксипін" за аналогічною схемою в дозі 250 мг/кг внутрішньоочеревинно. Інтактом слугували оперовані тварини, яким під етаміналнатрієвим наркозом (40 мг/кг) з використанням хірургічного доступу видаляли сонні артерії, але не накладали лігатуру. Неврологічний дефіцит у тварин визначали за шкалою stroke-index С.P. McGrow (Барабой В.А. Биоантиоксиданты / B.A. Барабой. - К.: Книга плюс, 2006. - 460 с. - С. 245). Важкість стану визначали за сумою відповідних балів: до 3 балів - легкий ступінь, з 3 до 7 балів - середній ступінь і з 7 балів і вище - тяжкий ступінь. Відмічали парези, паралічі кінцівок, тремор, манежні рухи, птоз, положення на боці, рухливість як прояви неврологічного дефіциту. Проводили тест "стрижня, що обертається" (діаметр 15 см, швидкість 3 об/хв). Тварин тестували щоденно, виставляли суму балів. Для оцінювання тяжкості ішемічного пошкодження тканин мозку та ефективності фармакокорекції проводили біохімічні дослідження артеріальної крові. З метою вивчення віддалених результатів фармакокорекції в експериментальних тварин на 4 добу після операції досліджували стан головного мозку. Для біохімічних досліджень використовували лобні долі кори мозку. Тканини мозку гомогенізували на холоді в сольовому ізотонічному середовищі (0,15 М KСl) при температурі +4 °C за допомогою скляного гомогенізатора в співвідношенні тканина сольовий розчин 1:10. Після чого методом диференціального центрифугування виділяли цитозольну фракцію (15000 g). Безбілковий екстракт отримували додаванням точної наважки гомогенату тканини мозку в хлорну кислоту (0,6 М) з наступною нейтралізацією розчином калію карбонату (5,0 М) (Бражко О.О. Антиоксидантна активність 2-метил-6-бром-4-тіохінолінів / О.О. Бражко // III університетська науково-практична конференція студентів, аспірантів та молодихучених "Актуальні проблеми та перспективи розвитку природничих наук": зб. тез, 17 грудня 2011 р. - Запоріжжя, 2011. - С. 109-110). 2 UA 113479 C2 5 10 15 20 Стан антиоксидантної системи оцінювали за активністю супероксиддесмутази (СОД), каталази, глутатіонпероксидази, показниками окислювальної модифікації білків у тканинах головного мозку (Владимиров Ю.А. Перекисное окисление липидов в биомембранах / Ю.А. Владимиров, А.И. Арчаков. - М.: Наука, 2003. - С. 230-272). Двостороння перев'язка загальних сонних артерій викликала важкі неврологічні зміни у тварин: паралічі, парези, птоз, з максимальним проявом на 4 добу. Так, у ці терміни спостереження в групі контрольних тварин середній бал за шкалою С.Р. McGrow становив 18, 22 бала, що відповідало важкому ступеню неврологічної симптоматики (табл. 1). Введення тваринам з гострим порушенням мозкового кровообігу (ГПМК) динатрієвої солі 2-(2-метил-5,8диметоксихінолін-4-ілтіо)сукцинатної кислоти в кількості 100 мг/кг, або емоксипіну в кількості 100 мг/кг протягом усього терміну спостереження (1 раз на добу) викликало різний за силою нейропротекторний ефект. В умовах експерименту як ДНХС, так й емоксипін послаблювали розвиток неврологічного дефіциту, прискорювали відновлення неврологічного статусу та зменшувати загибель тварин з двосторонньою перев'язкою загальних сонних артерій (ішемічний інсульт), що свідчило про нейропротекторний ефект досліджуваних речовин. Значно виділялася сполука ДНХС, яка майже в 3 рази знижувала виникнення неврологічної симптоматики на 4-у добу експерименту і зменшувала летальність на 50 % порівняно з нелікованою групою тварин. За цими показниками ДНХС перевершувала емоксипін (табл. 1). ДНХС була найбільш ефективна в гострий період церебральної ішемії, що вигідно її відрізняло від емоксипіну. Таблиця 1 Виживаність і розвиток неврологічного дефіциту у тварин на 4-у добу Група тварин Інтактна (n=10) Ішемія (контроль) (n=5) Ішемія + ДНХС (n=8) Ішемія + емоксипін (n=7) Середній бал за шкалою С.Р. Кількість тварин, що вижили, McGrow, y.o. на 4-у добу, % 0±0 100  18,22±2,11 30 # 80* 6,11±0,71* 70* 6,77±0,88* Примітки: 1.  - р