Спосіб оцінки чутливості клітин раку молочної залози до дії доксорубіцину

Реферат: Винахід належить до галузі медицини, а саме онкології, і стосується способу оцінки чутливості клітин раку молочної залози до дії доксорубіцину, згідно з яким досліджують кількість та просторову локалізацію магнітовпорядкованої фази у формі біогенних магнітних наночастинок (БМН) у клітинах раку молочної залози, розраховують фрактальну розмірність контурів клітин раку молочної залози, а також розраховують площу поверхні клітин раку молочної залози та кількість БМН в їх межах, при цьому, якщо середнє значення фрактальної розмірності клітин раку молочної залози становить =1,126±0,003, та одна БМН в середньому припадає на 2 0,223±0,004 m площі клітин раку молочної залози, то клітини раку молочної залози оцінюють як такі, що є резистентними до дії доксорубіцину, і якщо середнє значення фрактальної розмірності клітин раку молочної залози становить =1,250±0,007, та одна БМН в 2 середньому припадає на 0,247±0,003 m площі клітин раку молочної залози, то клітини раку молочної залози оцінюють як такі, що є чутливими до дії доксорубіцину. UA 115249 C2 (12) UA 115249 C2 UA 115249 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Винахід, що заявляється, стосується медицини, а саме онкології, і може бути використаний для визначення чутливості пухлинних клітин до дії протипухлинних препаратів, зокрема доксорубіцину. Відомий спосіб оцінки резистентності клітин до протипухлинних препаратів, в якому окремо синтезують ДНК, після цього проводять ампліфікацію РНК за допомогою Т7 РНК-полімерази, отримуючи РНК. Для одного експерименту потрібно не менше 10 мкг РНК кожної лінії клітин або тканини. Для менших кількостей РНК застосовують повторний цикл подвійної ампліфікації за допомогою того ж набору, що вносить значні відхилення в репрезентативність вихідних молекул РНК в кінцевому препараті [1]. Недоліками наведеного способу є те, що екстремальна чутливість реакції ферментативної ампліфікації ДНК є одночасно і слабким місцем технології полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) внаслідок чутливості ПЛР до забруднення (контамінації) сторонніми молекулами ДНК, які можуть слугувати мішенню для набору праймерів, що використовуються. Також одиночні молекули забруднюючої ДНК можуть бути багаторазово скопійовані в процесі ПЛР, призводячи до утворення цільового ДНК продукту, а внаслідок цього і до хибно позитивного результату діагностики. У зв'язку з ризиком одержання хибно позитивних результатів у лабораторіях, які використовують ПЛР в цілях діагностики, необхідне дотримання суворих вимог і спеціальних підходів, спрямованих на зниження ризику ПЛР-забруднення, що є високовартісною процедурою. Відомий спосіб оцінки резистентності клітин до протипухлинних препаратів, який застосовують в MiniAmp mRNA amplification kit, що використовує SMART (Study for Monitoring Antimicrobial Resistance Trends, http://globalsmartsite.com/login.aspx?ReturnUrl=%2fdefault.aspx) технологію для синтезу кДНК, проміжну ампліфікацію ДНК за допомогою обмеженої ПЛР, та синтез за допомогою Т7 РНК-полімерази аРНК, яка потім ще раз переводиться в кДНК з введенням аміноаліл-дНТФ (дезокси-рибонуклеозидтрифосфат) для подальшого мічення [2]. Недоліками наведеного способу є те, що він має зайвий етап ферментативного копіювання матеріалу, який порушує репрезентативність вихідних молекул РНК в кінцевому препараті і має такі недоліки: ДНК-полімерази, які використовують в ПЛР, мають схильність до помилок, успіх процесу залежить від правильного вибору послідовності праймерів, проте, жодна програма для автоматизованого вибору праймерів не забезпечує повної гарантії їх правильної роботи. Праймери - це суміш молекул різної довжини і складу, що призводить до появи «мінусових» фракцій, тобто молекул з послідовністю, скороченою на одну або декілька основ, при цьому положення пропущеного нуклеотиду може бути будь-яким. Тому для отримання найкращих результатів слід проводити очищення від цих фракцій. Найбільш близьким способом, який застосовують за тим же призначенням, що і заявлений, є спосіб, який дозволяє віднести пухлинні клітини певної лінії до стійких (ІС50≥0,54 мкМ) або чутливих (ІС50≤0,073 мкМ) до протипухлинних препаратів (доксорубіцину) шляхом визначення рівнів експресії маркерних генів АВСС1, ERCC1, FTL, GSTP1, МТ2А, RRM1, TUBB3 в досліджуваних клітинах по відношенню до рівнів експресії зазначених генів у клітинах NCI-H322. Спосіб включає одержання біологічного матеріалу, виділення з нього сумарної РНК, приготування флуоресцентно-мічених препаратів нуклеїнових кислот, фракцій комплементарних РНК, що містять полі-А-хвіст, виділених з досліджуваного матеріалу і контрольних клітин NCI-H322, гібридизацію суміші отриманих препаратів у співвідношенні 1:1 з набором унікальних олігонуклеотидних зондів, гомологічних мРНК зазначених генів, іммобілізованих на твердій підкладці, відмивання незв'язаних препаратів аРНК, сканування підкладки лазерним сканером, обробку одержаного зображення і проведення кількісного аналізу результату. В зазначеному способі застосовують SMART-синтез ДНК і її обмежену ампліфікацію методом ПЛР з використанням набору для ампліфікації кДНК з подальшою лінійною ампліфікацією РНК за допомогою Т7 РНК-полімерази. Такий підхід, з одного боку, забезпечує ефективний синтез повнорозмірних ДНК, а, з іншого, дозволяє скоротити стадії ферментативного копіювання вихідної мРНК при збереженні репрезентативності транскриптів. У зазначеному способі можна необмежено копіювати проміжний матеріал (кДНК) за допомогою ПЛР. Для постановки експериментів на мікрочипах використовують стандартне устаткування [3]. Зазначений спосіб вибраний як прототип. Недоліками наведеного способу є те, що в ньому на кінцевий результат може впливати ціла низка чинників, наприклад, нерівна концентрація суміші чотирьох нуклеотидів призводить до збільшення помилок ДНК-полімерази в ході ампліфікації, зниження концентрації вільних катіонів впливає на температуру і специфічність гібридизації праймерів, що вимагає необхідної підтримки відповідної концентрації іонів магнію. 1 UA 115249 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 До причин, що перешкоджають досягненню очікуваного технічного результату при використанні відомого способу, відноситься те, що є ризик одержання хибно позитивного результату внаслідок контамінації неспецифічними ДНК, також недоліки вірусних векторів, пов'язані із обмеженим набором клітинних ліній, на яких можлива реплікація вектора. Власне опис винаходу, що заявляється. В основу винаходу, що заявляється, поставлена задача удосконалення існуючих способів оцінки резистентності клітин до дії доксорубіцину. Поставлена задача вирішується тим, що при оцінці резистентності клітин до дії доксорубіцину досліджують кількість та просторову локалізацію магнітовпорядкованої фази у формі біогенних магнітних наночастинок (БМН) у клітинах раку молочної залози, розраховують фрактальну розмірність контурів клітин раку молочної залози, а також розраховують площу поверхні клітин раку молочної залози та кількість БМН в їх межах,при цьому, якщо середнє значення фрактальної розмірності клітин раку молочної залози становить =1,126±0,003, та 2 одна БМН в середньому припадає на 0,223±0,004 m площі клітини раку молочної залози, то клітини раку молочної залози оцінюють як такі, що є резистентними до дії доксорубіцину, і якщо середнє значення фрактальної розмірності клітин раку молочної залози становить 2 =1,250±0,007, та одна БМН в середньому припадає на 0,247±0,003 m площі клітини раку молочної залози, то клітини раку молочної залози оцінюють як такі, що є чутливими до дії доксорубіцину, кількість та просторову локалізацію магнітовпорядкованої фази у формі біогенних магнітних наночастинок у клітинах у складі резистентних та чутливих до дії протипухлинних препаратів клітин та фрактальну розмірність контуру клітин визначають за допомогою атомно-силової (АСМ) та магнітно-силової мікроскопії (МСМ), а розрахунки площі поверхні та визначення кількості біогенних магнітних наночастинок у межах кожної із обраних клітин здійснюють за допомогою модульної програми аналізу зображень. Саме поєднання наведених відомих ознак і сукупність суттєвих ознак способу, що заявляється, забезпечує оцінку резистентності клітин до дії доксорубіцину за фрактальною розмірністю контуру клітин, а також за кількістю магнітовпорядкованої фази у формі біогенних магнітних наночастинок, які припадають на одиницю площі клітини. Переваги способу, що заявляється, відносно відомого: - не потребує застосування витратних матеріалів, в тому числі, створення умов для роботи з біологічним матеріалом; - спосіб є більш швидким в реалізації (результат можна отримати протягом 30 хвилин); - спосіб є простішим в реалізації, так як виключає стадії біологічного дослідження зразка. Доведено існування відмінностей у морфологічних властивостях поверхонь нормальних клітин, а також пухлинних клітин, чутливих і резистентних до дії протипухлинних препаратів. Відомо, що пухлини й пухлинні клітини є «самоподібними» фігурами - фракталами [Dokukin М.Е., Guz N.V., Gaikwad R.М., Woodworth C.D. Cell surface as a fractal: normal and cancerous cervical cells demonstrate different fractal behaviour of surface adhesion maps at the nanoscale // Phys. Rev. Lett. - 2011. - P. 107]. Фрактальна розмірність - це характеристика, яка найкраще кількісно описує властивості розгалуженості і самоподібності кривої або поверхні. В способі, що заявляється, запропоновано використовувати значення фрактальної розмірності контуру клітини на предметному склі, як потенційний маркер резистентності до протипухлинних препаратів. В способі, що заявляється, розраховано фрактальні розмірності контурів резистентних та чутливих до дії протипухлинних препаратів на клітини раку молочної залози (РМЗ) лінії MCF. Магнітна силова мікроскопія - один із способів детектування біогенних магнітних наночастинок (БМН) в клітинах, саме цей спосіб використано для виявлення кількості та просторової локалізації БМН у складі резистентних та чутливих до дії протипухлинних препаратів клітин РМЗ лінії MCF. Відомо, що пухлинні клітини містять магнітовпорядковану фазу у формі БМН. Суть запропонованого винаходу пояснюється кресленнями: Фіг. 1 - Фіг. 6. Спосіб, що заявляється, може бути реалізований наступним чином. 1. Методом атомно-силової (АСМ) та магнітно-силової мікроскопії (МСМ) одержують зображення пухлинних клітин. Методом АСМ та МСМ досліджують локалізацію магнітовпорядкованої фази у формі БМН поблизу поверхні пухлинних клітин за допомогою скануючого зондового мікроскопа SOLVER PRO-M. У зондовому мікроскопі використовують двопрохідний напівконтактний спосіб вивчення зразка. Під час першого проходу магнітного зонда над поверхнею зразка (АСМ режим) одержують АСМ зображення рельєфу поверхні (Фіг. 1, 2). Цей рельєф запам'ятовують, і під час другого проходу (в МСМ режимі) вимірюють зсув фази коливань кантилеверу, що характеризує 2 UA 115249 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 силу магнітодипольної взаємодії робочої зони магнітного зонда з магнітовпорядкованою фазою в складі досліджуваних пухлинних клітин, за постійної відстані між зондом та поверхнею зразка. БМН в складі клітини може представляти собою окремі наночастинки і/або їх кластери. 2. Завантажують АСМ зображення пухлинної клітини в програму для розрахунку фрактальної розмірності її поверхні. Алгоритм програми для розрахунку фрактальної розмірності включає: завантаження АСМ зображення пухлинних клітин в форматі bmp; визначення змінних для перерахунку декартових координат поверхні клітини X, Y та Z в мікрони; створення фільтра для виділення 2D-кривої контуру клітини (Фіг. 3); створення блока розрахунку фрактальної розмірності контуру клітини, яка може змінюватися в діапазоні від 1 до 2; тестування програми на модельному фракталі кривій Коха. Програмний блок для визначення фрактальної розмірності контуру клітини включає побудову графіка залежності логарифму кількості квадратних комірок, необхідних для покриття контуру клітини, від логарифму розміру такої комірки. Лінійний графік такої залежності слугує підтвердженням фракталоподібної структури контуру клітини на відповідних масштабах (Фіг. 3). Формула для розрахунку фрактальної розмірності має вигляд: log NL  , D log L  де L - розмір комірки для покриття контуру клітини (Фіг. 3), NL  - кількість комірок розміру L , необхідних для покриття контуру клітини. Так як пухлинні клітини мають певний діапазон значень фрактальної розмірності, то обчислюють фрактальну розмірність клітин, отриманих методом АСМ. Розрахунок фрактальної розмірності дуже чутливий до шуму в експериментальних даних, особливо до обмежень в кількості даних. Для реалізації способу, що заявляється, для дослідження БМН було обрано 30 резистентних та 30 чутливих до дії протипухлинного препарату клітин раку молочної залози лінії MCF. 3. Визначають кількість БМН в пухлинних клітинах на основі аналізу МСМ зображень. Розраховують площу поверхні пухлинної клітини та визначають кількість БМН в її межах. Розрахунки площі клітин проводять за допомогою модульної програми аналізу зображень Gwyddion. Для демонстрації практичної реалізації способу, що заявляється представлені результати розрахунку фрактальних розмірностей резистентних і чутливих до дії протипухлинного препарату на пухлинні клітини в графічному вигляді на Фіг. 4. В якості протипухлинного препарату для демонстрації способу, що заявляється, використано цитостатичний препарат антрациклінової групи - доксорубіцин, який широко застосовується в хіміотерапії онкологічних хворих. На Фіг. 4. чітко видно, що фрактальна розмірність чутливих клітин є більшою за фрактальну розмірність резистентних клітин, причому діапазони значень цього показника для чутливих і резистентних клітин не перекриваються. Це свідчить про більш «розгалужену» структуру поверхні чутливих клітин, ніж резистентних, при цьому середнє значення фрактальної розмірності резистентних до дії доксорубіцину клітин РМЗ лінії MCF становить =1,126±0,003, а чутливих: =1,250±0,007. Кількість БМН у складі резистентних та чутливих клітин РМЗ лінії MCF одержані за допомогою способу, що заявляється, представлені в графічному вигляді на Фіг. 5. На діаграмі чітко видно, що кількість БМН на одну клітину не відрізняється для чутливих та резистентних клітин РМЗ лінії MCF. При цьому значення площі проекцій чутливих та резистентних клітин РМЗ лінії MCF на предметному склі відрізняються (Фіг. 6). Крім того, розраховано, що для 2 резистентних клітин РМЗ лінії MCF одна БМН в середньому припадає на 0,223±0,004 m площі 2 клітини, а для чутливих - на 0,247±0,003 m . За допомогою способу, що заявляється, розраховано та порівняно діапазони значень фрактальних розмірностей контурів резистентних та чутливих до дії доксорубіцину клітин РМЗ лінії MCF. Спосіб, що заявляється, дає можливість порівняти кількість БМН в складі чутливих та резистентних до дії доксорубіцину клітин РМЗ лінії MCF на основі аналізу їх зображень, отриманих методом АСМ та МСМ. Кількість БМН в перерахунку на одну клітину не є маркером визначення чутливості клітин до дії доксорубіцину. Але для резистентних клітин одна БМН в середньому припадає на меншу частку площі клітини. 3 UA 115249 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Фрактальну розмірність контурів клітин та частку площі пухлинної клітини, на яку припадає одна БМН, можна використовувати як додаткові маркери для визначення чутливості пухлинної клітини до дії доксорубіцину. Джерела інформації: 1. Патент США № 5256555, опуб. 26.10.1993. 2. Патент США № 8343721, опуб. 01.06.2013. 3. Патент Російської Федерації № 2528247, опуб. 27.09.2013, бюл. № 27. Перелік фігур до заявки на винахід «Спосіб оцінки резистентності клітин до протипухлинних препаратів» Фіг. 1. - Топографія поверхні пухлинних клітин раку молочної залози MCF-7, чутливих до дії доксорубіцину, одержана з застосуванням АСМ. Фіг. 2. - Топографія поверхні пухлинних клітин раку молочної залози MCF-7, резистентних до дії доксорубіцину, одержана з застосуванням АСМ. Фіг. 3. - Виділення 20-кривої - контуру клітини за допомогою програмних блоків MathCAD. Фіг. 4. - Густина функції розподілу резистентних і чутливих до дії доксорубіцину клітин раку молочної залози лінії MCF за фрактальною розмірністю. Фіг. 5. - Зображення клітини раку молочної залози лінії MCF, одержаної за допомогою атомно-силового мікроскопа, під маскою в програмі Gwyddion. Клітини раку молочної залози: 2 2 чутлива (праворуч - =0,914±0,003 m ) та резистентна (ліворуч - =0,811±0,004 m ) до дії доксорубіцину. Фіг. 6. - Густина функції розподілу резистентних і чутливих до дії доксорубіцину клітин раку молочної залози за кількістю БМН. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 1. Спосіб оцінки чутливості клітин раку молочної залози до дії доксорубіцину, що включає дослідження клітин на стійкість до дії доксорубіцину, який відрізняється тим, що досліджують кількість та просторову локалізацію магнітовпорядкованої фази у формі біогенних магнітних наночастинок (БМН) у клітинах раку молочної залози, розраховують фрактальну розмірність контурів клітин раку молочної залози, а також розраховують площу поверхні клітин раку молочної залози та кількість БМН в їх межах, при цьому, якщо середнє значення фрактальної розмірності клітин раку молочної залози становить =1,126±0,003, та одна БМН в 2 середньому припадає на 0,223±0,004 m площі клітин раку молочної залози, то клітини раку молочної залози оцінюють як такі, що є резистентними до дії доксорубіцину, і, якщо середнє значення фрактальної розмірності клітин раку молочної залози становить =1,250±0,007, 2 та одна БМН в середньому припадає на 0,247±0,003 m площі клітин раку молочної залози, то клітини раку молочної залози оцінюють як такі, що є чутливими до дії доксорубіцину. 2. Спосіб оцінки чутливості клітин раку молочної залози до дії доксорубіцину за п. 1, який відрізняється тим, що кількість та просторову локалізацію магнітовпорядкованої фази у формі біогенних магнітних наночастинок у клітинах у складі резистентних та чутливих до дії протипухлинних препаратів клітин та фрактальну розмірність контуру клітин визначають за допомогою атомно-силової (АСМ) та магнітно-силової мікроскопії (МСМ). 3. Спосіб оцінки чутливості клітин раку молочної залози до дії доксорубіцину за п. 1, який відрізняється тим, що розрахунки площі поверхні та визначення кількості біогенних магнітних наночастинок у межах кожної із вибраних клітин здійснюють за допомогою модульної програми аналізу зображень. 4 UA 115249 C2 5 UA 115249 C2 Комп’ютерна верстка А. Крулевський Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6