Спосіб визначення імунопротекторної дії препарату регоплант проти раку картоплі synchytrium endobioticum (schilb.) perc.

Реферат: Спосіб визначення імунопротекторної дії препарату РЕГОПЛАНТ включає зараження картоплі зооспорами збудника раку Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc., обробку заражених зразків, аналіз реакції рослин на зараження. На 20-й день після обробки визначають активність окисновідновних ферментів, що дозволяє визначити імунопротекторну дію препарату проти хвороби. UA 117094 U (12) UA 117094 U UA 117094 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до захисту рослин, зокрема до захисту картоплі проти раку. Відомі способи визначення дії препаратів проти раку картоплі з метою отримання високих врожаїв. Останньою тенденцією сучасного насінництва картоплі є використання елітних сортів даної культури та використання мінеральних добрив. Вони відпрацьовані відповідно їх призначення і відрізняються між собою [4, 5]. Найбільш близьким аналогом до нашої корисної моделі є визначення дії ефективності дії препаратів проти хвороб (прототип) [5]. Спосіб, що вирішується у прототипі, полягає в тому, що включає зараження зразків картоплі збудником раку Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. В штучно створеному інфекційному фоні (клімокамера - 11-13 °С), обробка препаратами та визначення ефективності їх дії проти патогену [2, 5, 6]. Згадані способи та спосіб-прототип мають такі недоліки: 1. Вони є трудомісткими. 2. Отримані результати не розкривають механізм імунопротекторної дії препаратів. Аналіз літературних джерел засвідчив, що дослідження стосовно поведінки препарату РЕГОПЛАНТ розкриті фрагментарно [4]. Дослідженнями науковців УкрНДСКР ІЗР НААН встановлена стимулююча дія препарату РЕГОПЛАНТ, тому була поставлена задача вивчити їх імунопротекторну дію при зараженні рослин картоплі збудником раку Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. Поставлена задача вирішується тим, що у запропонованому способі перед зараженням бульб картоплі зооспорангіями збудника раку їх обробляють 0,05 % розчином біостимулятора РЕГОПЛАНТ та після 20 діб після обробки та зараження сортів картоплі патогеном шляхом визначення активності окисно-відновного ферменту пероксидази визначають не тільки ефективність, а й імунопротекторну дію препарату проти збудника хвороби. 1. Запропонований спосіб не трудомісткий. 2. Спосіб дозволяє визначити імунопротекторну дію препарату проти раку на 20 день після зараження збудником хвороби. ПРИКЛАДИ ЗДІЙСНЕННЯ СПОСОБІВ Приклад 1 (прототип). Для визначення імунопротекторної дії препарату РЕГОПЛАНТ (вміщує продукти біотехнологічного культивування грибів-мікроміцетів з кореневої системи женьшеню і продуктів життєдіяльності бактерій Streptomyces Avermetilis - аверсектину з хелатними мікроелементами) проти збудника раку картоплі Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. бульби з паростками сортів картоплі Поліська рожева, Лорх та Лугівська заражали зооспорами зі свіжих ракових пухлин. Для цього навколо паросткової частини зразків бульб картоплі прикріплювали паперове кільце за допомогою підігрітої суміші парафіну та вазеліну (1:1). В кільце наливали 3 дистильовану воду і додавали свіжий наріст раку розміром 0,5 см , який вміщував літні зооспори збудника. Зразки залишали для зараження патогеном у темряві в клімокамері за температури +11 °C. Час експозиції - 24 години. На Фіг. 1 Зараження паростків бульб картоплі (сорти Лорх, Поліська рожева, Лугівська) літніми зооспорами збудника раку Synchytrium endobioticum (Schibersky) Perc. у кліматорі та обробка препаратом Регоплант). На Фіг. 2 Кліматокамера для зараження селекційного матеріалу картоплі зооспорами збудника раку Synchytrium endobioticum (Schibersky) Perc. На Фіг. 3. Паростки сорту картоплі Поліська рожева, уражені збудником раку Synchytrium endobioticum (Schibersky) Perc. Інфекцію з паперовими кільцями знімали з бульб і зразки картоплі залишали у клімокамері за температури +17-18 °С. Після зараження бульби обробляли 0,02; 0,04 та 0,05 % розчином препарату РЕГОПЛАНТ, у контрольних зразків замість препарату використовували воду і контейнери з обробленими зразками картоплі залишали на 20 діб, після чого відмічали реакцію паростків зразків картоплі на зараження патогеном. Для цього їх аналізували під бінокулярною лупою і визначали ступінь ураження збудником раку: 1 ступінь - некротизована тканина, одиничні соруси (до 5 штук); 2 ступінь - розсіяні соруси (якщо більше 5); 3 ступінь - щільні соруси без деформації паростка картоплі; 4 ступінь - щільні соруси з деформацією паростка картоплі; 5 ступінь - раковий наріст [3], (рис. З, додаток 3). Визначення ефективності дії препаратів проводили за формулою: Ед=100×(Рк-Рд/Рк), де 1 UA 117094 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Рк - показник розвитку хвороби у контролі, відповідно, до обробки; Рд - показник розвитку хвороби у досліді після обробки [5]. При використанні препарату РЕГОПЛАНТ в нормі витрати 50 мл/га на трьох сортах (Лорх, Поліська рожева та Лугівська) (таблиця 1, 2, 3, додатки 4, 5, 6) спостерігалось зниження розвитку хвороби до 60 % (для сортів Лорх та Поліська рожева) та 50 % (для сорту Лугівська), тоді як у контролі цей показник складав 100 % для всіх сортів картоплі. У результаті збільшення норми витрати імунопротектора до 70 та 100 мл/га розвиток хвороби зменшився відповідно до 40 та 50 % у всіх досліджуваних сортів (Лорх, Поліська рожева та Лугівська) (таблиця 1, 2, 3). Ефективність застосування біопрепарату РЕГОПЛАНТ проти раку картоплі складала від 40 до 60 % (для досліджуваних сортів) (табл. 1, 2, 3, додатки 4, 5, 6). Приклад 2. Бульби з паростками сортів картоплі Поліська рожева, Лорх та Лугівська заражали зооспорами зі свіжих ракових пухлин як за прикладом 1 (прототип). Для цього навколо паросткової частини зразків бульб картоплі прикріплювали паперове кільце за допомогою підігрітої суміші парафіну та вазеліну (1:1). В кільце наливали 3 дистильовану воду і додавали свіжий наріст раку розміром 0,5 см , який вміщував літні зооспори збудника. Зразки залишали для зараження патогеном у темряві в клімокамері за температури +11 °C. Час експозиції - 24 години (рис. 1, 2, додатки 1, 2). Інфекцію з паперовими кільцями знімали з бульб і зразки картоплі залишали у клімокамері за температури +17-18°°С. Після зараження бульби обробляли 0,05; 0,07 та 0,1 % розчином препарату РЕГОПЛАНТ, у контрольних зразків замість препарату використовували воду і контейнери з обробленими зразками картоплі залишали на 20 діб, після чого відмічали реакцію паростків зразків картоплі на зараження патогеном. Для цього їх аналізували під бінокулярною лупою і визначали ступінь ураження збудником раку: 1 ступінь - некротизована тканина, одиничні соруси (до 5 штук); 2 ступінь - розсіяні соруси (якщо більше 5); 3 ступінь - щільні соруси без деформації паростка картоплі; 4 ступінь - щільні соруси з деформацією паростка картоплі; 5 ступінь - раковий наріст [6], (рис. 3, додаток 3). Окисно-відновні ферменти (пероксидаза та інш.) - мають значну функціональну роль в життєдіяльності рослин в екстремальних умовах. Пероксидаза є неспецифічним універсальним ферментом з широким спектром дії. Вона приймає участь в окислювально-відновлювальних реакціях фотосинтезу, в процесах дихання, метаболізмі білків і регулювання процесів росту, детоксикації перекису водню, катаболізмі фенольних сполук, в утворенні супероксидного радикалу O2 , руйнуванні високо активного радикалу ОН в реакціях з Н2О2 [1]. Фермент приймає участь в утворенні фітоімунітету [1]. Це дає підставу назвати пероксидазу "аварійним" ферментом [1] і признати актуальними дослідження його активності у рослин при дії різних стресових факторів, у тому числі і патогенів. 3 5 г паросткової частини бульб картоплі сортів Лорх, Поліська рожева та Лугівська виділяли білковий екстракт шляхом розтирання з 5 мл трис- боратним буфером та центрифугуванням при 6000 об./хв. на протязі 10 хвилин. Для визначення пероксидазної активності 1 мл екстракту інкубували з 1 мл 0,1 % розчином перекиси водню та фарбували 0,01 % розчином бензидином на протязі 5-10 хвилин. Визначали величину екстинкції на спектрофотометрі «Ломо-46» при 600 нм. Активність пероксидази визначали за формулою: А = Е К/ t (у моль/хв.) за методом Починка Б.А. [7, 8]. У результаті проведених досліджень встановлено, що у оброблених препаратом РЕГОПЛАНТ сортів картоплі активність пероксидази коливалась у межах 0,38-0,51 мкмоль/хв., а у необроблених уражених збудником раку сортів картоплі - вона склала 0,59-0,72 мкмоль/хв. (табл. 4, додаток 7). Чим вища активність пероксидази, тим більше уражений збудником раку сорт картоплі. За такою ознакою можна визначити механізм імунопротекторної дії препарату. Таким чином, шляхом визначення активності окисно-відновних ферментів (пероксидази) на 20-й день після зараження картоплі зооспорами збудника раку вдається визначити імунопротекторну дію препарату РЕГОПЛАНТ на картоплі проти хвороби. Запропонований спосіб визначення імунопротекторної дії препарату РЕГОПЛАНТ було підтверджено експериментальною перевіркою, яка здійснювалась при обробки заражених збудником раку сортів картоплі, отриманих з Інституту картоплярства НААН. Джерела інформації: 2 UA 117094 U 5 10 15 20 1. Витол И.С. Использование пероксидазы и глютоматдегидрогеназы в качестве биохимических маркеров в биотехнологических исследованиях на картофеле // И.С. Витол, B.C. Мелик-Саркисов, В.Н. Аветисов, И.Г. Дубровский // Доклады ВАСХНИЛ. - 1989. - № 10. - С. 1415. 2. Зеля А.Г. Стійкість картоплі проти збудника раку Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc, методи його виявлення і диференціації: Авт. дис. канд. біол. наук: 06.01.11. /А. Г. Зеля - К., 2009. - 24с. 3. Маслов Ю.И. Статистическая обработка данных биохимических исследований // Методы биохимического анализа растений. /Ю.И. Маслов. - Л., 1986. - С. 163-178. 4. Мельник П.О. Етіологія раку картоплі, біоекологічне обґрунтування заходів його профілактики та обмеження розвитку./ П.О.Мельник. Ч.- Прут., 2003. - 284с. 5. Методика випробування і застосування пестицидів // С.О. Трибель, Д.Д. Сігарьова, М.П. Секун, О.О. Іващенко та ін. За ред. проф. С.О. Трибеля. - К.: Світ. - 2001. - 448 с. 6. Методика оцінки та відбору селекційного матеріалу картоплі стійкого до раку Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. гармонізована з вимогами EC. // Г.В. Зеля, Т.М. Олійник, А.Г. Зеля, В.М. Гунчак, - Чернівці, 2015. - 24 с. 7. Патент № 62605 А Україна, 7 А01С 1/00, А01G 1/00 Спосіб визначення стійкості картоплі до збудника раку Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. / Зеля А.Г., Мельник П.О., Бондарчук А.А., Зеля Г.В. Олійник Т.М., Осипчук А.А. - заявник і патентовласник Українська науководослідна станція карантину рослин НААН. - / Промислова власність. Офіційний бюлетень. заявл. 16.12.2010; опубл. 12.09.2011. - Бюл. № 17. 8. Починок Б.А. Методы биохимического анализа растений / Б.А. Починок. - М., 1986. - 286 с. Таблиця 1 Визначення ефективності препарату РЕГОПЛАНТ проти збудника раку картоплі Synchytrium endobioticum (Schilbersky) Perc. (лабораторний дослід 2016 р., сорт картоплі Лорх) Варіанти досліду Контроль препарату) Регоплант Регоплант Регоплант HIP05 (без Норма витрати Ураження рослин, Розвиток хвороби, % % Ефективність препарату, % 100 100 50 мл/га 70 мл/га 100 мл/га 60 50 40 3,5 60 50 40 1,5 40 50 60 1,0 Таблиця 2 Визначення ефективності препарату РЕГОПЛАНТ проти збудника раку картоплі Synchytrium endobioticum (Schilbersky) Perc. (лабораторний дослід 2016 р., сорт картоплі Поліська рожева) Варіанти досліду Контроль препарату) Регоплант Регоплант Регоплант НІР05 (без Норма витрати Ураження рослин, Розвиток хвороби, % % Ефективність препарату, % 100 100 50 мл/га 70 мл/га 100 мл/га 60 50 40 3,0 60 50 40 1,5 40,0 50,0 60,0 1,5 25 3 UA 117094 U Таблиця 3 Визначення ефективності препарату РЕГОПЛАНТ проти збудника раку картоплі Synchytrium endobioticum (Schilbersky) Perc. (лабораторний дослід, сорт картоплі Лугівська) Варіанти досліду Контроль препарату) Регоплант Регоплант Регоплант НІР05 Норма витрати (без Ураження рослин, Розвиток хвороби, % % Ефективність препарату, % 100 100 50 мл/га 70 мл/га 100 мл/га 50 50 40 3,0 50 50 40 1,5 50,0 50,0 60,0 1,5 Таблиця 4 Визначення ефективності препарату РЕГОПЛАНТ (прототип) та визначення активності пероксидази при зараженні картоплі збудником раку Synchytrium endobioticum (Schilbersky) Perc. (лабораторний дослід, 2016 р.) Сорти картоплі 10 Розвиток хвороби, % Лорх Поліська рожева Лугівська HIP05 5 Ураження рослин, % Ефективність препарату, % (прототип) 60 50 40 3,5 60 50 40 3,5 40 50 60 2,5 Активність Активність пероксидази (у пероксидази (у мкмоль/хв.) мкмоль/хв.) необроблених оброблених зразків зразків 0,63 0,42 0,59 0,38 0,72 0,51 0,03 0,02 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб визначення імунопротекторної дії препарату РЕГОПЛАНТ, що включає зараження картоплі зооспорами збудника раку Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc., обробку заражених зразків, аналіз реакції рослин на зараження, який відрізняється тим, що на 20-й день після обробки визначають активність окисно-відновних ферментів, що дозволяє визначити імунопротекторну дію препарату проти хвороби. 4 UA 117094 U 5 UA 117094 U Комп’ютерна верстка М. Мацело Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6