Спосіб визначення рівня поліамінів для експресної діагностики раку молочної залози в умовах in vitro

Реферат: Спосіб визначення рівня поліамінів для експресної діагностики раку молочної залози в умовах in vitro люмінесцентним методом, із використанням біосенсора у вигляді жорсткої підкладкиносія, поверхня якої оброблена розчином наночастинок оксиду цинку, включає нанесення на підкладку-носій біоселективного шару на основі антитіла, специфічного до досліджуваної біологічної речовини-антигену, та детекцію, за допомогою лазера, інтенсивності фотолюмінесценції, що виникає при утворенні кон'югату антитіло-антиген. Діагностування розвитку раку молочної залози здійснюють методом визначення концентрації щонайменше двох видів біогенних поліамінів в суспензії культури клітин раку молочної залози людини MCF-7. При цьому для створення біоселективного шару додатково модифікують поверхню підкладкиносія біосенсора розчином білка А і попередньо досліджують модельні розчини біогенних поліамінів в різних концентраціях як антигени, шляхом їх нанесення на біоселективний шар підкладки-носія біосенсора, та визначення залежності рівня люмінесцентного сигналу від рівня концентрації відповідного антигену. Після цього досліджують різні концентрації суспензії культури клітин раку молочної залози людини MCF-7, яку використовують як речовину-антиген, шляхом її нанесення на біоселективний шар підкладки-носія біосенсора, і, за рівнем люмінесцентного сигналу біосенсора, при опроміненні в діапазоні довжини хвилі 375-380 нм, оцінюють рівень концентрації біогенних поліамінів у відповідному розчині суспензії культури клітин раку молочної залози, на основі попередньо визначеної залежності у модельних розчинах, та, за рівнем накопичення поліамінів, роблять висновок про початок малігнізації. UA 118303 U (12) UA 118303 U UA 118303 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі біології, онкології та біотехнології та може бути використана для ранньої діагностики раку молочної залози. Сучасні методи діагностики раку молочної залози є фінансово-затратними, вимагають часу і ресурсів, а також не дозволяють провести діагностику захворювання на його ранніх етапах, тому пошук економічно доступного, високоточного експрес-способу діагностики раку молочної залози є дуже актуальним. Добре відома роль поліамінів та особливостей їхнього метаболізму в пухлинному процесі. У 1971 р. американський біохімік Діан Рассел уперше виявив у хворих з поширеними формами злоякісних пухлин підвищений вміст поліамінів і припустив, що визначення їх вмісту може слугувати "маркером раку". Поліаміни - це низькомолекулярні органічні полікатіони, які утворюються в організмі внаслідок обміну протеїнів. Найбільш поширеними є спермін (має 4 групи NH2), спермідин (3 групи NH2), путресцин і кадаверин, які є діамінами. Результати подальших експериментальних досліджень у галузі біології та онкології показали, що поліаміни у великих концентраціях інгібують різні біохімічні процеси, тобто інтоксикація онкологічних хворих також зумовлена постійним надходженням поліамінів та їхніх метаболітів із пухлини у кров. Отже, накопичення поліамінів є характерною ознакою пухлинного росту, а дослідження обміну поліамінів та контролю їх вмісту дозволить здійснити діагностування онкологічного захворювання на ранніх його стадіях (Р.П. Виноградова; В.М. Данилова. Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України. БІОТЕХНОЛОГІЯ, 2012. - Т. 5, № 6,). Відомим загальним методом виявлення та визначення концентрації біогенних поліамінів у розчині є імуноферментний аналіз (ELISA), який широко застосовується для діагностики різноманітних інфекційних захворювань, ракових процесів. Основний принцип ELISA - реакція антиген-антитіло. Якщо антиген (молекула-мішень) являє собою білок, то його очищений препарат звичайно використають для одержання антитіл, за допомогою яких потім і виявляють дану мішень. Так, відомий спосіб діагностики антигенів, зокрема спермідину, основною особливістю якого є використання хімічної реакції між субстратом і ферментом для візуалізації наявності або відсутності імунної реакції між антигеном та специфічним йому антитілом (Fujiwara, К., et al. "A new enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for studying immunocytochemical procedures using an antiserum produced against spermidine as a model. " Histochemistry 99.6 (1993): 477-483). Як антитіла використовували анти-спермідинову сироватку, яку було синтезовано з двох кролів, імунізованих спермідином, який був кон'югований з меркаптосукцинованим бичачим сироватковим альбуміном. Також використовували додаткове антитіло - анти-кролячий IgG кози, Fab, кон'югований з пероксидазою хрону (HRP). Наявність або відсутність імунохімічної реакції в такій методиці відмічали за наявністю, а концентрацію за інтенсивністю коричневого забарвлення, яке виникало під час поєднання антигенів, мічених субстратом (ортофенілендіаміном) зі специфічними антитілами (анти-спермідиновою сироваткою, або антикролячим IgG кози) попередньо мічених ферментом - пероксидазою хрону. Даний метод дозволяє виявляти поліаміни в дуже низьких концентраціях (1 μМ/мл), також він є досить простим у застосуванні, хоча й має ряд суттєвих недоліків, а саме: тривалий час аналізу - не менше 2-х годин, який до того ж, потребує послуг висококваліфікованого персоналу в умовах добре обладнаної лабораторії; необхідність використання великої кількості реактивів, що робить методику досить коштовною; можливість досить значного рівня (у 25 % випадків) перехресної реакції поліамінів сперміну та спермідину зі специфічними антитілами; низька чутливість - 1 μМ/мл. Відомий також спосіб визначення концентрації біогенних проламінів за методом імуноблотингу, що має багато спільного із вищеописаним методом ELISA. Зокрема те, що, для візуалізації реакції антиген-антитіло, також використовується хімічна реакція ферменту із субстратом, яка викликає забарвлення розчину при виникненні реакції антиген-антитіло. Основними особливостями є використання імунохімічної реакції із застосуванням діамінобензидину-НСІ як субстрату і пероксидази хрону (HPR) - ферменту до даного субстрату, яким маркували специфічні антитіла до молекул інтересу. Які, у свою чергу, кон'югували із субстратом, а потім додавали до такого кон'югату специфічні антитіла, мічені ферментом. Утворений комплекс являв собою реакцію антиген-антитіло, при чому взаємодія субстрату із 1 UA 118303 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ферментом давала коричневе забарвлення. В аналізі використовували два види антитіл: антикролячий lgG кози з пероксидазою хрону (HRP) та анти-спермідинову сироватку. Відмінністю даної методики є те, що дослідження проводили на нітроцелюлозному папері. Результати аналізували за інтенсивністю коричневого забарвлення на нітроцелюлозному папері (Hodgson AJ, Репке В, Erdei A, Chubb IW, Somogyi P (1985) Antisera to 7-aminobutyric acid. 1. Production and characterization, using a new model system. J Histochem Cytochem 33: 229-239; Fujiwara, K., et al. "A new enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for studying immunocytochemical procedures using an antiserum produced against spermidine as a model." Histochemistry 99.6 (1993): 477-483.) Недоліками даного аналога є досить тривалий час аналізу (близько 60 хв.), необхідність використовувати вищі концентрації антитіл, можливість перехресної реакції зі сперміном та іншими поліамінами складає 25 %, висока вартість реагентів, та низька чутливість, нижній поріг якої складає 0,5μМ. Найбільш близьким до заявленого способу діагностики є люмінесцентний метод ідентифікації та визначення кількості клітин біологічної речовини-антигену із використанням біосенсора у вигляді жорсткої підкладки-носія, поверхня якої оброблена розчином наночастинок оксиду цинку. Для визначення також використовується принцип антиген-антитіло. Тобто, такий метод включає взаємодію біологічної речовини-антигену із нанесеним на підкладку-носій біоселективним шаром на основі специфічного до неї антитіла, та детекцію інтенсивності фотолюмінесценції, що виникає при утворенні кон'югату антитіло-антиген, за допомогою лазера. Таким чином, на відміну від вищеописаних аналогів, за даним методом, для візуалізації реакції антиген-антитіло використовуються оптичні властивості наночастинок цинку, які здатні випромінювати світло при збудженні з певною довжиною хвилі, інтенсивність якого буде змінюватись в залежності від концентрації відповідної досліджуваної речовини (Viter R., Smyntyna V., Starodub N. ZnO Nanorods Room Temperature Photoluminescence Biosensors For Salmonella Detection //Frontiers in Optics. - Optical Society of America, 2012. - C. FTu3A. 61). За даним методом визначали, зокрема кількість клітин бактерії роду сальмонела (Salmonella sp.). Спочатку на підкладку-носій, у вигляді скляної пластинки, з попередньо нанесеним цинком наносили антитіла - анти-сальмонельну сироватку, специфічну до клітин сальмонели. А потім, як антиген, наносили суспензію клітин бактерії Samonella typhimurium розведених в 0,85 % NaCl 1 6 (фіз. розчину), в концентрації від 10 до 10 клітин. Спочатку, при осадженні шару антитіл на шарі оксиду цинку, спостерігалося підвищення інтенсивності фотолюмінесценції, а при внесенні та іммобілізації шару клітин сальмонели (тобто антигену) спостерігалося поступове зниження інтенсивності фотолюмінесценції, у зв'язку з блокуванням вільних місць зв'язування з антитілами. Що свідчило про збільшення концентрації досліджуваних клітин, а отже, про можливість визначати як наявність клітин Samonella typhimurium, так і їх кількість, та попереджати їх розвиток. У порівнянні з аналогами, такий метод візуалізації для ідентифікації та визначення кількості клітин біологічної речовини-антигену є значно простішим, більш швидшим, оскільки вимагає менше часу на підготовку і проведення самого аналізу, а також не потребує великої кількості реактивів, що робить його економічнішим. Однак для ідентифікації та визначення кількості молекул біогенних поліамінів (сперміну та спермідину), які є значно менші за клітину, зокрема клітину бактерії роду Salmonella, такий спосіб є недостатньо чутливим, з огляду необхідності визначення саме мінімальної концентрації молекул поліамінів, при якій зберігається стабільний сигнал люмінесценції. Оскільки чутливість біосенсора визначається за показником зміни рівня люмінесценції - чим менша молекула інтересу тим менше буде змінюватись люмінесценція. Тобто, саме показники чутливості біосенсора, які і визначають точні/максимально достовірні дані дослідження, пов'язані з молекулярною масою досліджуваних агентів. Окрім цього кон'югація антитіл, згідно з даним способом, безпосередньо на поверхні скляної підкладки-носія біосенсора, з попередньо нанесеним оксидом цинку, відбувається лише за рахунок фізичної сорбції, тобто осадження антитіл на поверхні підкладки-носія з наночастинками оксиду цинку. Такий метод не є достатньо надійним, оскільки після аналізу зразка з досліджуваними клітинами відбувається промивка підкладки-носія, яка сприяє вимиванню молекул поліамінів. Що, у свою чергу, спричинює отримання недостовірних даних та сприяє зниженню точності досліджування. В основу корисної моделі поставлена задача удосконалити спосіб діагностики раку молочної залози на його ранніх етапах, за рахунок підвищення точності дослідження обміну біогенних 2 UA 118303 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 поліамінів (сперміну та спермідину), та можливості їх визначення в модельних розчинах і контролю їх вмісту в суспензії культури клітин молочної залози людини. Поставлена задача вирішується тим, що визначення рівня поліамінів для експресної діагностики раку молочної залози в умовах in vitro, здійснюють люмінесцентним методом із використанням біосенсора у вигляді жорсткої підкладки-носія, поверхня якої оброблена розчином наночастинок оксиду цинку. Спосіб включає нанесення на підложку-носій біоселективного шару на основі антитіла, специфічного до досліджуваної біологічної речовини-антигену, та детекцію, за допомогою лазера, інтенсивності фотолюмінесценції, що виникає при утворенні кон'югату антитіло-антиген, Згідно з корисною моделлю, діагностування розвитку раку молочної залози здійснюють методом визначення концентрації щонайменше двох видів біогенних поліамінів в суспензії культури клітин раку молочної залози людини MCF-7. При цьому, для створення біоселективного шару, додатково модифікують поверхню підкладки-носія біосенсора розчином білка А, і попередньо досліджують модельні розчини біогенних поліамінів в різних концентраціях як антигени, шляхом їх нанесення на біоселективний шар підкладки-носія біосенсора, та визначення залежності рівня люмінесцентного сигналу від рівня концентрації відповідного антигену. Після чого, досліджують різні концентрації суспензії культури клітин раку молочної залози людини MCF-7, яку використовують як речовину-антиген, шляхом її нанесення на біоселективний шар підкладки-носія біосенсора, і, за рівнем люмінесцентного сигналу біосенсора, при опроміненні в діапазоні довжини хвилі 375-380 нм, оцінюють рівень концентрації біогенних поліамінів у відповідному розчині суспензії культури клітин раку молочної залози, на основі попередньо визначеної залежності у модельних розчинах. За рівнем накопичення поліамінів роблять висновок про початок малігнізації, тобто процесу розвитку злоякісної пухлини. При цьому, як білок А використовують його розчин, отриманий з Staphylococcus aureus {Sigma) в об'ємі не менше 5-7 мкл і концентрації не менше 20-25 мкг/мл; як біогенні поліаміни використовують модельні розчини сперміну та спермідину; як специфічне антитіло до сперміну та спермідину використовують сироватки, отримані шляхом імунізації кролів спермідином або сперміном, кон'югованими з розчином бичачого сироваткового альбуміну. Отже, у заявленому способі діагностики, так само, як і в його вищезазначеному найближчому аналогу, використовуються оптичні властивості наночастинок цинку, нанесених на поверхню підкладки-носія біосенсора, які здатні випромінювати світло при збудженні з певною довжиною хвилі, інтенсивність якого буде змінюватись від концентрації доданої досліджуваної речовини. Нанесення на підкладку-носій досліджуваної біологічної речовини, перетворює такий оптичний біосенсор на аналітичну систему, яка здатна визначати в розчині окремі біологічні структури. Додаткова модифікація поверхні підкладки-носія біосенсора розчином білка А, згідно з заявленим способом, необхідна для правильної орієнтації антитіл, а саме, для того, щоб вони сорбувались на підкладку-носій таким чином, щоб залишились відкритими специфічні сайти зв'язування їх з поліамінами. Що, відповідно, покращує якість зв'язування молекул цинку з молекулами досліджуваних поліамінів і, відповідно, запобігає їх вимиванню під час подальших промивок підкладки-носія, і, як наслідок, підвищує точність аналізу. Наявність у заявленому способі підготовчого етапу, є принципово важливим задля попереднього вивчення залежності рівня люмінесцентного сигналу від рівня концентрації цільових біогенних поліамінів у модельних розчинах сперміну та спермідину. Від дозволяє визначити мінімальну та максимальну кількість досліджуваної речовини, за якої можна буде спостерігати відгук біосенсора (пік люмінесценції наночастинок оксиду цинку), тобто, визначити нижній та верхній пороги чутливості біосенсора. Під час подальшого дослідження клітин раку молочної залози, визначають концентрацію в них цільових біогенних поліамінів за рівнем люмінесцентного сигналу біосенсора на основі високоточних даних з попередньо визначеної залежності у модельних розчинах. Тобто, заявлений спосіб дозволить значно підвищити чутливість біосенсора, а відтак досягти високої достовірності дослідження, та виявити початок процесу розвитку злоякісної пухлини на досить ранній його стадії. Отже, заявлені суттєві ознаки корисної моделі є необхідними і достатніми для досягненні поставленої задачі. 3 UA 118303 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Заявлений спосіб діагностики раку молочної залози здійснюється наступним чином. Безпосередньо перед проведенням аналізу виконують модифікацію біосенсорної поверхні скляної пластинки з наночастинками оксиду цинку (ZnO). Для цього, на поверхню пластинки з розчином ZnO наносять розчин білка А, отриманий з бактерії Staphylococcus aureus, в об'ємі 5 мкл і концентрації 20 мкг/мл. Після чого інкубують білок А на поверхні ZnO протягом 40 хв., після чого виконують промивку 0,85 % розчином NaCL. Інкубацію проводять в скляній або пластиковій чашці Петрі, на дно якої спочатку укладають фільтрувальний папір, змочений водою, на нього кладуть алюмінієву підкладку, а потім пластинку. Чашку Петрі поміщають у холодильну камеру при температурі +4 °C. Надалі на поверхню скляної пластинки наносять 1 % глутаровий альдегід, розчинений в ОДМ фосфатно-сольовому буфері (ФСБ) в об'ємі 10 мкл, та інкубують протягом 20 хв. Після чого проводять промивку 0,85 % розчином NaCL. Глутаровий альдегід використовують для зв'язування різних молекул між собою. Після модифікації пластинки розчином білка А, на її поверхню наносять розчин специфічних антитіл - анти-сироватку, специфічну до спермідину у концентрації 100 мкг/мл і об'ємі 10 мкл, отриману шляхом імунізації кролів спермідином, кон'югованим з розчином бичачого сироваткового альбуміну (БСА). І проводять інкубацію протягом 40 хвилин, з подальшою промивкою 0,85 % розчином NaCL. При приготуванні до аналізу модельних розчинів сперміну етап повторюють, однак замість анти-спермідинової сироватки використовують анти-спермінову, як антитіла, а замість спермідину - спермін як антиген. Наступним етапом наносять на поверхню пластинки розчин БСА, в об'ємі 10 мкл і концентрації 10 мкг/мл, та інкубують протягом 20 хв, з подальшою промивкою 0,85 % розчином NaCL. Даний агент використовується для блокування неспецифічних місць зв'язування з антигеном. Після модифікації біосенсорної поверхні проводять підготовку досліджуваних речовин до аналізу. Для цього готують серію розведень досліджуваних речовин. У випадку ліофілізату культури клітин раку молочної залози MCF7, готують суспензії у 2 5 концентраціях від 10 до 10 в 0,85 % NaCl, а у випадку розчинів поліамінів (сперміну та спермідину) - від 10 до 100 нг/мл в 0,85 % NaCl. Фотолюмінесцентні дослідження підготовлених досліджуваних речовин виконують з використанням лазера LCS-DTL-374QT при опроміненні в діапазоні довжини хвилі 375-380 нм. Вимірювання проводять шляхом перенесення модифікованої скляної пластинки у камеру спектрометра, налаштування відповідної хвилі лазера і внесення досліджуваних речовин. В камеру поміщають речовини в об'ємі 20 мкл. Спочатку в камеру вносять 0,85 % розчин NaCl для калібрування приладу. Вимірювання проводять 2-3 хв. В разі незадовільних даних виконують повторне налаштування лазера. Надалі почергово вносять концентрації досліджуваних речовин. Після закінчення вимірювань кожної окремої концентрації, проводять промивку камери 0,85 розчином NaCl. Отримані дані аналізують за кількістю одиниць люмінесценції, які реєструються приладом, і передаються на комп'ютер. Прилад реєструє інтенсивність люмінесценції наночастинок оксиду цинку в залежності від концентрації та молекулярної ваги речовин, кон'югованих на їх поверхні. Так початкова люмінесценція на початку вимірювань може складати 6000-8000 одиниць люмінесценції, яка поступово згасає. Це пояснюється насиченням самої пластинки і блокуванням усіх специфічних (вільних) місць зв'язування на чутливому шарі, тобто поступово зменшується активна поверхня наночастинки, яка може випромінювати світло. Отже використання наночастинок оксиду цинку дозволяє як якісно, так і кількісно визначити рівень поліамінів, як в розчині поліамінів, так і у суспензії клітин. Результати тестування різних концентрацій поліамінів та клітин культури MCF7 представлені у нижченаведеній таблиці: 55 4 UA 118303 U Спермін Спермідин MCF-7 Концентрація, Фотолюмінесценція, Концентрація, Фотолюмінесценція, Концентрація, Фотолюмінесценція, μM Фл/од. мін. μМ Фл/од. мін. кл/мл Фл/од. мін. 0,01 6700 0,01 6500 100 6300 0,02 6450 0,02 6300 500 6000 0,03 6300 0,03 6200 1000 5800 0,05 6100 0,05 6000 5000 5700 0,07 5900 0,07 5850 10000 5500 0,1 5800 0,1 5700 100000 5000 5 10 15 20 25 30 Результати досліджень свідчать, що: 1. Концентрація поліамінів у їх модельних розчинах визначалася у межах норми (норма: 0.05-15 μМ/мл (або від 50 до 1500 nM: Buranaphalin, Sawanya. Pharmaceutical Analysis of Polyamines and Aminoglycosides. Diss. University Library, 2009). Що свідчить про те, що, вибрані у заявленому способі специфічні анти-сироватки до сперміну та пермідину достатньо якісно і надійно спроможні зв'язуватися з антигенами - досліджуваними поліамінами. А відтак, це дає можливість забезпечувати високоякісну ідентифікацію наявності та концентрації поліамінів в суспензії клітин MCF-7. 2. Інтенсивність люмінесценції в суспензії клітин MCF-7 значно нижча, навіть при мінімальній концентрації поліамінів (0,01 мМ) і при тому що кількість клітин у зразку також мала (100 клітин). Ця сама тенденція зберігається і надалі щодо різних концентрацій як поліамінів, так і клітин MCF-7. Що свідчить про значне перевищення концентрації поліамінів у досліджуваній суспензії клітин MCF-7. Це, у свою чергу, дає підстави стверджувати про можливий початок розвитку онкологічного захворювання. 3. Щодо відмінностей між інтенсивністю люмінесценції у розчинах самих поліамінів (сперміну та спермідину), то вони незначні, тому що останні схожі за молекулярною структурою. 2 4. Заявлений спосіб дозволяє виявляти чутливість близько 1×10 кл/мл, яка зростає до 5 1×10 клітин/мл. Мінімальна ж концентрація для виявлення поліамінів складає 10 нг/мл, максимальна 100 нг/мл. Таким чином, заявлений спосіб діагностики, на основі визначення рівня біогенних поліамінів в культурі клітин раку молочної залози в умовах in vitro, з використанням оптичних властивостей наночастинок цинку, дозволяє використовувати його для високочутливої швидкої і точної діагностики раку молочної залози. Також заявлений спосіб не потребує великої кількості коштовних реактивів, що робить його більш економічним, ніж відомі аналоги. При цьому витрачається менше часу на підготовку і проведення самого аналізу, завдяки відсутності необхідності у деяких операціях, що мають місце у способах-аналогах. Це дає важливу можливість скоротити час на прийняття рішення про початок процесу розвитку злоякісної пухлини, і своєчасне призначення відповідної терапії. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 35 40 45 50 1. Спосіб визначення рівня поліамінів для експресної діагностики раку молочної залози в умовах in vitro люмінесцентним методом, із використанням біосенсора у вигляді жорсткої підкладкиносія, поверхня якої оброблена розчином наночастинок оксиду цинку, що включає нанесення на підкладку-носій біоселективного шару на основі антитіла, специфічного до досліджуваної біологічної речовини-антигену, та детекцію, за допомогою лазера, інтенсивності фотолюмінесценції, що виникає при утворенні кон'югату антитіло-антиген, який відрізняється тим, що діагностування розвитку раку молочної залози здійснюють методом визначення концентрації щонайменше двох видів біогенних поліамінів в суспензії культури клітин раку молочної залози людини MCF-7, при цьому для створення біоселективного шару додатково модифікують поверхню підкладки-носія біосенсора розчином білка А і попередньо досліджують модельні розчини біогенних поліамінів в різних концентраціях у як антигени, шляхом їх нанесення на біоселективний шар підкладки-носія біосенсора, та визначення залежності рівня люмінесцентного сигналу від рівня концентрації відповідного антигену, після чого досліджують різні концентрації суспензії культури клітин раку молочної залози людини MCF-7, яку використовують як речовину-антиген, шляхом її нанесення на біоселективний шар підкладкиносія біосенсора, і, за рівнем люмінесцентного сигналу біосенсора, при опроміненні в діапазоні довжини хвилі 375-380 нм, оцінюють рівень концентрації біогенних поліамінів у відповідному розчині суспензії культури клітин раку молочної залози, на основі попередньо визначеної 5 UA 118303 U 5 залежності у модельних розчинах, та, за рівнем накопичення поліамінів, роблять висновок про початок малігнізації. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що як білок А використовують його розчин, отриманий з Staphylococcus aureus (Sigma) в об'ємі не менше 5-7 мкл і концентрації не менше 20-25 мкг/мл. 3. Спосіб за пп. 1, 2, який відрізняється тим, що як біогенні поліаміни використовують модельні розчини сперміну та спермідину. 4. Спосіб за пп. 1-3, який відрізняється тим, що як специфічне антитіло до сперміну та спермідину використовують сироватки, отримані шляхом імунізації кролів спермідином або сперміном, кон'югованими з розчином бичачого сироваткового альбуміну. 10 Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6