Спосіб біотестування токсичності ґрунтів та донних відкладів прісноводних водойм

Реферат: Спосіб біотестування токсичності ґрунтів та донних відкладів прісноводних водойм передбачає виявлення потенційної небезпеки дії акумульованих в них забруднюючих речовин на живі організми у гострих та хронічних дослідах шляхом введення у відібрані проби ґрунтів і донних відкладів та їх водних витяжок тваринних форм тест-об'єктів з використанням реакції іммобілізації особин. Біотестування здійснюють за допомогою двох тест-наборів, кожен з яких включає тваринну та рослинну форми і дозволяє визначати, поряд з гострою та хронічною неспецифічною токсичністю ґрунтів і донних відкладів за участю обох форм організмів, окремо на рослинах - їх цито- та генотоксичність, а також специфічну токсичність на присутність у ґрунтах та донних відкладах важких металів і кислот. UA 121873 U (12) UA 121873 U UA 121873 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до сфери біологічних методів тестування об'єктів навколишнього середовища і може бути застосована у таких галузях як екологія, охорона довкілля, природокористування, водне, сільське та лісове господарство для визначення загальної (неспецифічної) токсичності (гострої і хронічної, цито- і генотоксичності) ґрунтів та донних відкладів прісноводних водойм і їх специфічної токсичності (на дію кислот та деяких важких металів). Ґрунти та донні відклади водойм внаслідок високих сорбційних властивостей відіграють суттєву роль у процесах самоочищення довкілля. Проте, акумулюючи токсичні сполуки у великих кількостях, вони самі перетворюються на небезпечне середовище, здатне за певних умов сприяти забрудненню територій та акваторій, що знаходяться поряд. Тому, оцінюючи стан ґрунтового покриву та якість вод прісноводних водойм, необхідно враховувати можливу небезпеку щодо їх вторинного забруднення [1, 2]. Найбільш перспективними методами визначення якості ґрунтів та донних відкладів вважаються біологічні методи досліджень, зокрема біотестування, здатне оперативно оцінювати їх небезпеку для живих організмів. Будучи інтегральним методом виявлення сукупної дії шкідливих чинників [2], біотестування дозволяє визначати рівні токсичності певного середовища за допомогою уніфікованих груп організмів (дафній і церіодафній, салату посівного, цибулі звичайної та ін.) [2-4]. Проте існуючі способи біотестування мають ряд недоліків, що обмежує здійснення ефективної оцінки токсичності ґрунтів та донних відкладів: для виявлення того чи іншого виду токсичності найчастіше застосовуються поодинокі тести [5-8]; за використання тест-наборів токсичність часто визначається за допомогою організмів лише певного рівня біологічної організації (пропонуються виключно рослинні або тваринні форми) [9, 12]; за формування тест-наборів з організмів, що належать до різних рівнів організації, практично ніколи не звертається увага на те, що є більш доцільним для тестування, самі ґрунти та донні відклади чи їх водні витяжки [10]; відсутність інтегральної оцінки токсичності, яка б враховувала небезпечну дію ґрунтів або донних відкладів одночасно по відношенню до рослинних і тваринних організмів, такої, що пропонується, наприклад, за визначення якості води [11]. Отже, біотестування ґрунтів та донних відкладів досі не набуло належної системної організації і часто залежить від кваліфікації дослідника. Серед загальноприйнятих способів біотестування ґрунтів та донних відкладів [3-5, 7-10] було виділено декілька найбільш подібних до запропонованого нами способу. Г.М. Франчук, Л.С. Кіпніс, С.М. Маджд, Я.В. Загоруй (2006) виявляли гостру токсичність ґрунтів, донних відкладів та інших ланок довкілля, а також їх цито- і генотоксичність шляхом використання уніфікованих тест-об'єктів (Daphnia magna Straus, Allium сера L. та Lactuca sativa L.). Недоліком способу є те, що у ньому не враховуються хронічні ефекти дії ґрунтів і донних відкладів (у тому числі їх специфічна хронічна токсична дія) [4]. У дослідженнях, проведених О.В. Абросимовою, М.А. Виковою, М.Ю. Меркуловою та ін. (2013), токсичність ґрунтового та сніжного покривів визначали за використання тест-набору у складі D. magna, Lemna minor L., Raphanus sativus L. (сорт Червоний з білим кінчиком), Triticum durum Desf. (сорт Фаворит). На основі даних біотестування, поєднаних з результатами хімічного та мікробіологічного аналізів, здійснено оцінювання екологічного стану і ступеня антропогенного навантаження урбосистем [10]. Недоліком зазначеного способу є обмеженість у використанні тваринних форм організмів за тестування проб ґрунту, зокрема відсутня тваринна форма, за допомогою якої можливо здійснювати тестування у цільному ґрунті, а не лише у його водній витяжці. Також у дослідженнях взагалі не приділяється увага необхідності виявлення генотоксичності ґрунтового покриву. За прототип корисної моделі нами було вибрано спосіб біотестування донних відкладів, запропонований І.І. Топіліною (2000), яка показала, що Ceriodaphnia affinis Lilljeborg є оптимальним тест-об'єктом для оцінки токсичності водної витяжки донних відкладів, а за біотестування цільних ґрунтів найбільш чутливими, інформативними та зручними виявились Chironomus riparius L. і Hyalella azteca Saussure [12]. Основним недоліком способу є те, що біотестування проведено виключно на тваринних формах гідробіонтів і не враховує токсичну дію ґрунтів, донних відкладів та їх витяжок по відношенню до рослинних форм організмів. У зв'язку з цим, для розробки корисної моделі способу біотестування ми пропонуємо порівняно з прототипом сформувати два тест-набори організмів, у яких поряд з тваринними формами, будуть використані рослини (наземний вид - цибуля та водний - ряска), причому такі, 1 UA 121873 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 що мають специфічні реакції на кислотну дію ґрунтів та донних відкладів, а також на вплив важких металів, що входять до їх складу. Запропонована нами корисна модель полягає у біологічному тестуванні ґрунтів та донних відкладів за допомогою двох наборів тест-об'єктів, кожен з яких складається з рослинної і тваринної форм; один з наборів (цибуля звичайна A. сера, дзвінець опушений Chironomus plumosus L.) використовується для біотестування безпосередньо ґрунтів та донних відкладів, а інший (ряска мала L. minor, церіодафнія афініс С. affinis) - для біотестування їх водних витяжок. Використання цих наборів дозволяє виявляти декілька видів загальної токсичності (гостру, хронічну, цито- та генотоксичність) і оцінювати їх рівні за допомогою розрахунку інтегральних індексів. В залежності від поставлених завдань кожен з тест-наборів може бути використаний окремо. Однак для отримання більш повної інформації з високим ступенем вірогідності щодо забруднення ґрунтів та донних відкладів, є більш доцільним використання одночасно обох наборів. Задачею корисної моделі є розробка способу біотестування ґрунтів і донних відкладів прісноводних водойм, здатного забезпечити високу інформативність за виявлення небезпечної дії на тваринні і рослинні організми забруднюючих речовин, акумульованих у цих ґрунтах і донних відкладах, за рахунок їх комплексної оцінки за показниками неспецифічної та специфічної токсичності. Задача реалізується шляхом визначення тест-реакцій організмів щодо дії на них забруднюючих речовин, зосереджених у ґрунтів та донних відкладів, таких як: порушення рухової активності, у тому числі іммобілізація (нерухомість), церіодафній та личинок хірономід, довжина кореневого пучка цибулі, довжина кореня та кількість утворених листців ряски (на гостру та хронічну токсичність); поява некротичних клітин у тканинах листців і кореня ряски (на цитотоксичність) та утворення мікроядер в клітинах зони росту корінців цибулі (на генотоксичність); морфофізіологічні зміни у тканинах листців (у тому числі кількість рослин із зміненим кольором, роз'єднаних на окремі листці, з відпалим коренем - на присутність та хронічну дію важких металів);зменшення кількості кореневих волосків на корінцях цибулі (на хронічну дію кислот). Для перевірки ефективності розробленої нами корисної моделі порівняно з прототипом було проведено лабораторне дослідження з біотестування токсичності донних відкладів. Експериментальні дані щодо небезпечності відкладів, відібраних у Денишівському водосховищі р. Тетерів, отримували методом біотестування на цибулі, личинках хірономід (дзвінців), рясці та церіодафніях. Для цього було сформовано по три групи організмів-аналогів (n=20). Проби 3 донних відкладів (ДВ) відбирали у вересні 2015 р. у об'ємі 1 дм на одну групу за загальноприйнятими методиками [5]. Кожну пробу розділяли на дві частини: для тестування цільних відкладів та їх водних витяжок. Для тестування безпосередньо самих донних відкладів проби перемішували і змочували дистильованою водою, після чого їх переносили частково у чашки Петрі, у які запускали личинки хірономід, а частково - у піддони, у які висаджували цибулини. Для виготовлення водних витяжок другу частину відібраних проб донних відкладів розводили дистильованою 3 водою (1:5) і розміщували у хімічних ємностях об'ємом 0,5 дм , які заповнювали церіодафніями і такі самі - рослинами ряски. Для спостереження за особинами і виявлення серед них іммобілозованих, загиблих, з порушенням розвитку використовували лупу. Експеримент проводили за такою схемою: Контрольна група К: проби ДВ - з р. Тетерів за 50 м до водосховища. Дослідна група Д1: проби ДВ - з літоралі водосховища за 30 м від берега. Дослідна група Д2: проби ДВ - з р. Тетерів, 50 м за греблею водосховища. Тест-об'єкти: цибуля звичайна А. сера, дзвінець опушений Chir. plumosus, ряска мала L. minor, церіодафнія афініс С. affinis. Біотестування - з 2-ої до 8-ої доби з визначенням індексів токсичності. Індекс токсичності донних відкладів розраховували за формулою: T 55 Ik  I0 100, Ik де: T - індекс токсичності, %; T - тест-реакція організмів на контролі; I0 - тест-реакція організмів у досліді. Індекс токсичності донних відкладів не повинен перевищувати 50 % незалежно від тестоб'єктів, що використовуються [4, 5]. Якщо його значення більше за цей критерій, забруднення відкладів вважаються небезпечними для водної екосистеми. 2 UA 121873 U 5 10 15 20 25 30 Вплив проб донних відкладів на тест-об'єкти (організми-аналоги за віком та розмірами), використані у базовому варіанті та запропонованому нами способі, був досліджений протягом 2ох діб на гостру токсичність і 8-ми діб - на хронічну, цитологічну та генотоксичність. З 2-ої до 8-ої доби щоденно визначали зміну кількості листців, а також дію важких металів на рослини ряски. Після 8-добового тестування виявляли ознаки хронічної дії кислот у складі відкладів та проводили мікроядерний тест за загальноприйнятим методом. Отримані дані порівнювали з контролем, у якості якого застосовували проби відкладів, відібрані з бенталі р. Тетерів за 50 м до водосховища. У проведеному нами біотестуванні на гостру та хронічну токсичність були визначені кількість іммобілізованих церіодафній та личинок хірономід, довжина кореневого пучка цибулі, довжина кореня та кількість утворених листців ряски. Дослідження на тваринних тест-об'єктах були проведені аналогічно до базового варіанту. Церіодафній і хірономід використовували в обох способах біотестування. Цитотоксичність виявляли за появою некротичних клітин, що утворились упродовж 8-ми діб на коренях та листцях ряски. Генотоксичність визначали, використовуючи клітини зони росту корінців цибулі, за мікроядерним індексом [3-5]. Дію важких металів досліджували за морфофізіологічними порушеннями, що відбуваються у рослинах ряски: зміною кольору листців, поділом рослин на окремі листці, відокремленням кореня. Хронічну дію кислот у складі відкладів досліджували за кількістю кореневих волосків цибулі у дослідних групах порівняно з контролем, застосовуючи таку саму формулу, що і для визначення індексу токсичності. На основі отриманих даних здійснювали комплексну оцінку небезпечності донних відкладів за визначеними для кожного тест-об'єкта індексами токсичності. Для інтегральної оцінки токсичної дії донних відкладів на організми (Іт) розраховували середньоарифметичні значення визначених у дослідженнях індексів токсичності (Т). Результати біотестування щодо небезпечності донних відкладів (ДВ) р. Тетерів та водосховища Денишівське за базовим та запропонованим нами способом наведено у таблиці. Представлені дані показали високу ефективність розробленого способу біотестування. Хоча запропонований спосіб є складнішим у виконанні порівняно з базовим, однак він більш чутливий та інформативний, дозволяє повніше охаратеризувати ступінь небезпеки ґрунтів та донних відкладів для живих організмів. За його допомогою можна виявляти чотири види загальної (неспецифічної) токсичності та ідентифікувати специфічну хронічну дію кислот та важких металів, що входять до складу донних відкладів, на рослинні і тваринні форми. Таблиця Порівняльний аналіз способів біотестування донних відкладів з різним ступенем забруднення (n=20) Дослідні групи Д-1 Д-2 Д-1 Д-2 Базовий спосіб Запропонований спосіб, Т (прототип), Т (%) (%) Іт, % Са Chr На Са Lm Chp Ac Гостра / хронічна токсичність: ПКЛ, Iм Iм Iм Iм Iм ПРК ПРК 58,0/ 54,7/ 54,3/ 58,0/ 56,9/ 55,0/ 59,8/ 69,8 62,9 64,0 69,8 66,2 67,7 68,4 38,9/ 22,5/ 30,2/ 38,9/ 32,1/ 20,0/ 30,8/ 43,0 32,0 38,0 43,0 35,0 33,3 50,0 Цитотоксичність (ЦТ) / генотоксичність (ГТ): 68,2 ГТ ЦТ 74,8 45,7 ГТ ЦТ 50,0 Специфічна токсична дія: важких металів (ВМ) / кислот (К) 35 3 Іт, % 57,43/ 68,03 30,45/ 40,33 68,2/ 74,8 45,7/ 50,0 UA 121873 U Продовження таблиці Д-1 48,1 11,5 Д-2 35,5 6,2 48,1/ 11,5 35,5/ 6,2 Примітка: Умовні позначення (скорочення): Д-1 - проби ДВ з водосховища; Д-2 - проби ДВ за 50 м за греблею; Са - С. affinis; Chr-Ch. riparius; Chp-Ch. plumosus; Ha-Hyalella azteca; Lm-L. minor, Ac -А. сера; Iм - іммобілізація церіодафній та личинок хірономід; ПРК - пригнічення росту корінців цибулі і кореня ряски; ПКл - порушення фізіологічного стану клітин листців ряски. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 За тестування донних проб, відібраних у водосховищі Денишівському, на личинках хірономід та церіодафніях, їх гостра і хронічна токсичність перевищували 50 %, що свідчить про небезпеку не тільки для бентосних та пелагобентосних тварин, але й про можливість вторинного забруднення вод токсичними складовими відкладів. Хоча зазначені тест-об'єкти і використовували в обох способах біотестування, введення нами до складу тест-наборів додатково до тваринних форм рослинні (цибулю і рясу), а також визначення за їх участю інтегральних індексів токсичності, дало можливість більш чітко і повно оцінити небезпечність донних відкладів для організмів різних рівнів біологічної організації. За допомогою рослин були визначені також цито- та генотоксичність відкладів, які виявились доволі високими. Щодо специфічної токсичної дії донних відкладів, їх хронічна кислотна дія була незначною, однак вплив важких металів, особливо у водосховищі, майже досягав небезпечного рівня 50 %. Також спостерігали поступову зміну кольору листців ряски: вони втрачали зелений колір і на 2-гу добу були безбарвними і одночасно пожовклими по краях. На 8-му добу майже половина рослин мали роз'єднані листці і втратили корінь. Це свідчить про сумісну хронічну дію іонів декількох видів важких металів, серед яких переважають іони Мангану, Феруму і Цинку. За даними біотестування щодо визначення індексів Т та Іт, нами використано шкалу рівнів токсичності, що є більш зручною, ніж у прототипі [12]: 1-25 % - допустимий рівень токсичності; 26-50 % - низький рівень токсичності; 51-75 % - середній рівень токсичності; 76-100 % - високий рівень токсичності. Використання інтегральних індексів (Іт), що визначаються за шкалою рівнів токсичності, з урахуванням комплексної тест-реакції усіх організмів, на яких тестується дія донних відкладів, дозволило у запропонованому способі біотестування більш точно, ніж у базовому варіанті, інтерпретувати отримані дані. Таким чином, запропонований нами спосіб біотестування у порівнянні з аналогічними є більш інформативним щодо виявлення потенційної небезпечної дії на тваринні і рослинні організми забруднюючих речовин, акумульованих у ґрунтах і донних відкладах прісноводних водойм. Підвищення інформативності способу було досягнуто завдяки включенню у тестнабори рослинних форм організмів, за допомогою яких вдалося здійснити комплексну оцінку ґрунтів і донних відкладів не тільки за загальноприйнятими гострою і хронічною неспецифічною токсичністю, але й за цито- і генотоксичністю, а також, що особливо цінно, за специфічною токсичністю (хронічною кислотною дією та дією деяких важких металів). Джерела інформації: 1. Линник П.Н. Донные отложения водоемов как потенциальный источник загрязнения вод / П.Н. Линник // Агроекологічний журнал. - 2015. - № 3. - С. 6-15. 2. Измайлова Н.Л. Биотестирование и биоиндикация состояния водных объектов: учебнометодическое пособие к лабораторным работам по прохождению учебной (ознакомительной) практики / Н.Л. Измайлова, О.А. Ляшенко, И.В. Антонов / СПбГТУРП. - СПб., 2014. - 52 с. 3. Руководство по определению методом биотестирования токсичности вод, донных отложений, загрязняющих веществ и буровых растворов. - М.: РЭФИА, НИА-Природа, 2002. 118 с. 4. Франчук Г.М. Екологічна оцінка стану довкілля в зоні аеропорту методами біотестування / Г.М. Франчук, Л.С. Кіпніс, С.М. Маджд, Я.В. Загоруй // Вісн. Нац. авіац. ун-ту. - 2006. - № 2. - С. 114-117. 4 UA 121873 U 5 10 15 5. Цаценко Л.В. Методика биотестирования почвы на основе ряскового теста в агроэкологическом мониторинге / Л.В. Цаценко, Н.Г. Малюга. - Краснодар. - КГАУ, 2003. - 43 с. 6. ISO 20079, 2004: Water quality-determination of the toxic effect of water constituents and waste water to duckweed (Lemna minor) - Duckweed growth inhibition test. International Standard ISO 20079: 2004. Geneva, Switzerland. 7. ДСТУ 11267:2003. Якість ґрунту. Пригнічення розмноження ногохвісток Folsomia Candida забруднюючими речовинами ґрунту (ISO 11267-1999, IDT). 8. ДСТУ 1268-2003. Якість ґрунту. Вплив забруднюючих речовин на гнійних черв'яків (Eisenia fetida). 4.2. Визначання впливу на розмноження (ISO 11268-2:1998, IDT). 9. ДСТУ 11269-2002. Якість ґрунту. Визначання впливу забруднюючих речовин на флору ґрунтів. 4.2. Вплив хімічних речовин на проростання і ріст вищих рослин (ISO 11269-2:1995, IDT). 10. Оценка экологического неблагополучия урбосистем на основе данных мониторинга снежного и почвенного покровов (на примере г. Саратова) / О.В. Абросимова, М.А. Быкова, М.Ю. Меркулова, Е.И. Тихомирова // Вестник СГТУ, 2013. - № 4 (73). - С. 239-244. 11. Скок С.В. Оцінювання якості питної води м. Херсона методом біотестування / С.В. Скок // Агроекологічний журнал. - 2015. - № 2. - С. 26-30. 12. Томилина И.И. Оценка токсичности грунтов озер Дарвинского заповедника / И.И. Томилина, В.Т. Комов // Информ. бюлл. Биология внутренних вод. - 1996. - № 100. - С. 62-65. 20 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 25 30 35 40 45 50 55 1. Спосіб біотестування токсичності ґрунтів та донних відкладів прісноводних водойм, що передбачає виявлення потенційної небезпеки дії акумульованих в них забруднюючих речовин на живі організми у гострих та хронічних дослідах шляхом введення у відібрані проби ґрунтів і донних відкладів та їх водних витяжок тваринних форм тест-об'єктів з використанням реакції іммобілізації особин, який відрізняється тим, що біотестування здійснюють за допомогою двох тест-наборів, кожен з яких включає тваринну та рослинну форми і дозволяє визначати, поряд з гострою та хронічною неспецифічною токсичністю ґрунтів і донних відкладів за участю обох форм організмів, окремо на рослинах - їх цито- та генотоксичність, а також специфічну токсичність на присутність у ґрунтах та донних відкладах важких металів і кислот. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що один з тест-наборів (цибуля звичайна Аllium сера L., дзвінець опушений Chironomus plumosus L.) використовують для біотестування безпосередньо токсичності ґрунтів та донних відкладів, а інший (ряска мала Lemna minor L., церіодафнія афініс Ceriodaphnia affinis Lilljeborg) - для біотестування токсичності виготовлених з них водних витяжок. 3. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що біотестування ґрунтів та донних відкладів і їх водних витяжок на гостру і хронічну токсичність здійснюють відповідно на 2-гу і 8-му добу досліджень за наступними тест-ознаками організмів: порушення рухової активності церіодафній та личинок хірономід, уповільнення росту кореневого пучка цибулі і кореня ряски, інгібітування утворення листців ряски. 4. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що біотестування ґрунтів та донних відкладів і їх водних витяжок на цито- і генотоксичність здійснюють на 8-му добу досліджень за наступними ознаками рослинних форм організмів: появою некротичних клітин у тканинах листців і кореня ряски та утворенням мікроядер в клітинах зони росту корінців цибулі відповідно. 5. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що дає можливість за допомогою рослинних тесторганізмів виявляти, починаючи з 2-ої до 8-ої доби, специфічну реакцію на дію важких металів (характерні зміни кольору і структури листців ряски, відокремлення кореня від рослин в залежності від присутності і хронічного впливу іонів металів), а також спостерігати за той самий період досліджень специфічну реакцію на хронічну дію кислот у складі ґрунтів та донних відкладів (зменшення кількості кореневих волосків на корінцях цибулі). 6. Спосіб за будь-яким з пп. 1-4, який відрізняється тим, що за вказаними тест-реакціями тваринних і рослинних форм у дослідних групах порівняно з контролем визначено індекси токсичності ґрунтів та донних відкладів і їх водних витяжок, середньоарифметичні значення яких розраховано як відповідні інтегральні індекси токсичності, перевищення яких понад 50 % свідчить про небезпечність забруднення ґрунтів та донних відкладів для живих організмів. 5 UA 121873 U Комп’ютерна верстка О. Гергіль Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6