Засіб для посилення функції макрофага та лікування людини з послабленим імунітетом

УКРАЇНА 26770 „„С1 (19) * А 61 К 31/445, А 61 К 31/40, А 61 К 31/38 ДЕРЖАВНЕ ПАТЕНТНЕ ВІДОМСТВО ОПИС ДО ПАТЕНТУ НА ВИНАХІД (54) ЗАСІБ ДЛЯ ПОСИЛЕННЯ ФУНКЦІЇ МАКРОФАГА ТА ЛІКУВАННЯ ЛЮДИНИ З ПОСЛАБЛЕНИМ ІМУНІТЕТОМ 1 2 94129193 19 12.94 12.11 99 08/170.605 21 12.93 US 12.11.99. Бюл. № 7 І. Патент США № 4133814, 1979. 2. Патент США № 4380635, 1983. 3. Патент США № 4418068, 1983. 4 Патент США № 5075321, 1991. 5. Black et al. Antagonism of estrogen action with a new benzothiophene derived antiestrogen // Life Sciences, 1983, 32, 10311036 (72) Цукерман Стівен Гарольд (US) (73) ЕЛІ ЛІЛЛІ ЕНД КОМПАНІ (US) (57) 1. Применение соединения, имеющего формулу 2. Применение по п. 1, при котором указанным соединением является его гидрохлоридная соль. 3. Применение по п. 1, осуществляемое в профилактических целях 4. Применение по п 1, при котором указанным соединением является соединение формулы: (21) (22) (24) (31) (32) (33) (46) (56) OCHJCHJ-N \ ОСН 2 СН 2 —R 2 (I) или его гидрохлоридная соль. 5. Применение соединения, имеющего формулу ОСН2СН2—R 2 где R' и R3 обозначают независимо водо (I) 0 род, -СН3, -С (С, Сьалкил) или С-Аг, где Аг - необязательно замещенный фенил, R2 выбран из группы, состоящей из пирролидино, гексаметиленимино и пиперидино; или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата; для усиления функции макрофага. где R1 и R3 обозначают независимо водо 0 II род,-СН3, - С - (С,-С 6 алкил) или О II С - Аг, о 26770 где Аг - необязательно замещенный фенил; R2 выбран из группы, состоящей из пирролидино, гексаметиленимино и пиперидино; или его фармацевтически приемлемой соли или сольвата; для лечения человека с ослабленным иммунитетом. 6. Применение по п. 5, при котором указанным соединением является соединение формулы или его гидрохлоридная соль. Макрофаги играют центральную роль в иммунной защите организма посредством различных эффекторных механизмов, затрагивающих как связанные с мембраной, так и секреторные события (Gordon et al. Curr. Opin. Immunol., 1992, 4, 25; Brit. Med. J., 1992, 48, 65). Фагоцитоз, хемотаксис и представление антигена являются процессами, связанными с мембраной, вовлеченными в механизмы иммунной защиты, необходимые для выживания организма. Важность макрофагов в защите от микробов, иммунологическом надзоре, разрушении раковых клеток и в очистке от стареющих эритроцитов была показана на моделях человека и животных, характеризующихся избирательным удалением макрофагов (Classen et al. J. Immunol. Meth., 1990, 134, 153). Макрофаги также способствуют защите организма посредством секреции бактериостатических и бактерицидных протеинов, цитокинов и липидных медиаторов, а также кис лород- и азот-реакционноспособных промежуточных продуктов. Секреторная способность макрофага является центральной в его функции, поскольку эти клетки секретируют более 100 различных медиаторов и локализуются в каждом органе (Nathan, J. Clin. Invest., 1987, 79, 319). В то время, как отклоняющаяся от нормы активация функций макрофага связана с аутоиммунными заболеваниями, а также как с хроническими, так и с острыми воспалительными процессами, реципрокным состоянием, подавление эффекторных функций макрофага связано с вновь происходящими заражениями как благоприятными, так и неблагоприятными патогенами и способствует увеличению заболеваемости и смертности. Группы, связанные с состоянием ослабленного им мунитета, включаю^ ожоговых пациентов, трансплантаты, ВИЧ-инфицированных индивидуумов, подвергающихся химиотерапии раковых пациентов и хирургических пациентов, особенно пациентов с высоким риском заражения, как это наблюдается у торакабдоминальных пациентов (с внутренними болезнями). Текущая терапия при подходе к таким пациентам включает применение внутривенного вливания макрофагпроизводных цитокинов, особенно, стимулирующих колонии факторов G-CSF, GM-CSF и M-CSF (Nemunaitis, Transfusion, 1993, 33:70). Применяется также поддерживающая терапия антибиотиками и жидкостями, однако, ограниченные возможности этих подходов проявляются в непрерывных проблемах заражения пациентов с ослабленным иммунитетом и появления более смертоносных штаммов организмов, устойчивых к антибиотикам. Кроме того, заражения пациентов с ослабленным иммунитетом благоприятными патогенами, включая инфекции Pneumocystis и Oryptococcal, остаются значительными и приводят к осложнениям, несмотря на различные схемы лечения антибиотиками. Ясно, что новые лекарства, которые могут избирательно усиливать эффекторные функции макрофага для усиления сопротивляемости организма, могли бы сыграть центральную роль при клиническом ведении таких пациентов. Сообщалось, что эстроген повышает избирательные эффекторные функции макрофага, включая Fc-опосредованный фагоцитоз, экспрессию антигена второго класса и секрецию IL-1. Эти наблюдения в сочетании с известной способностью женщин обладать большей устойчивостью к различным инфекциям (Ahmed et al. Am. J. Path., 1985, 121, 531) предполагают, ОСН,ГН г -П 26770 что эстроген-подобные соединения могут усиливать эффекторные функции макрофага и, таким образом, быть благоприятными при болезненных состояниях, связанных с подавленной сопротивляемостью S организма. Изобретение относится к способу повышения функции макрофага, включающий назначение человеку, нуждающемуся в этом, эффективного количества соеди- 10 нения формулы I активации, которое усиливает защиту человека. Соединение формулы (I) может быть полезным при лечении, как профилактическом, так и терапевтическом, субъектов с ослабленным иммунитетом и, в частности, при внутриполостных хирургических инфекциях, пациентов с миеломой после химиотерапии, ожоговых пациентов, ВИЧ-инфицированных индивидов и трансплантатных пациентов, подвергающихся иммуноподавляющей терапии. Дополнительные области использования могут включать профилактическое и терапевтичес15 кие применения при повторяющихся бактериальных, протозойных и грибковых заражениях, а также для пациентов с миелодиспластическим синдромом и апластической (лишенной протоплазмы-пер.) 20 анемией, у которых миелоидные клетки нефункциональны. Ожидается, что соединения формулы (I) также полезны в отношении любого клинического объекта, к которому используются факторы, стиму1 3 лирующие колонии. где R и R обозначают независимо водо- 25 Ралоксифен является предпочтитель0 0 ным соединением по изобретению и яви к ляется гидрохлоридной солью соединения род, -СН3, -CXCj-Cg алкил) или -С-Аг, формулы (I), где R1 и R3 являются оба где Аг - необязательно замещенный феводородом и R2 является 1-пиперидининил; 30 лом. R2 выбран из группы, состоящей из Обычно, по крайней мере, одно соепирролидино, гексаметиленимино и пипединение формулы (I) формулируется или ридино; вводится в готовую форму препарата или и его фармацевтически приемлемых солей и сольватов. 35 состав вместе с обычными добавками, разбавителями или носителями, и прессуется Изобретение также охватывает способ в таблетки, или указанные формы приголечения человека с ослабленным иммунитовляют в виде эликсиров или растворов тетом, включающий назначение соедине'Для удобного орального назначения (ввения формулы (I) указанному человеку. Данное изобретение касается обна- 40 дения) или вводятся внутримышечным или внутривенными путями. Соединения могут ружения того, что определенная группа 2назначаться трансдермально и могут форфенил-3-ароилбензотиофенов (бензотиомулироваться в виде дозированных форм фенов) формулы (I) является полезной с замедленным высвобождением и анадля улучшения функции макрофага. Полалогичных. гают, что описанные бензотиофены улуч- 45 Соединения, используемые в спосошают функции макрофага, включая экспбах по данному изобретению, могут быть рессию антигенов второго класса (следополучены согласно известным способам, вательно, представление антигена), Fcтаким, как подробно описанным в Патенопосредованный фагоцитоз и/или высвобождение цитокина. Терапевтическое и 50 тах США № 4133814, 4418068 и 4380635, которые все упомянуты здесь для ссылки. профилактическое лечение, охватываемое В основном, способ осуществляют, исхоэтим изобретением, осуществляется пудя из бензо[Ь]тиофена, имеющего 6-гидтем назначения человеку, нуждающемуся роксильную группу и группу 2-(4-гидрокв лечении, дозы соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой со- 55 сифенил). Исходное соединение защищают, ацилируют, и подвергается снятию ли или сольвата, эффективной для улучзащитной группы с образованием соедишения функции макрофага. нений формулы (I). Примеры получения Термин "улучшение функции макротаких соединений представлены в патенфага" включает такое повышение или уситах США, указанных выше. Термин "неоление функции макрофагов или скорости 26770 бязательно замещенный фенил" включает фенил, моно- или дизамещенный С, -С6 алкилом, С,-С4 алкокси, гидрокси, нитро, хлором, фтором или три(хлор или фтор)метилом Соединения, используемые в способах настоящего изобретения, образуют фармацевтически приемлемые соли присоединения кислот и оснований с широким спектром различных органических и неорганических кислот и оснований и включают физиологически приемлемые соли, которые часто используются в фармацевтической химии. Такие соли являются также частью данного изобретения. Типичные неорганические кислоты, используемые для образования таких солей, включат соляную, бромистоводородную, йодводородную, азотную, серную, фосфорную, гипофосфорную и тому подобное. Также могут использоваться соли, производные органических кислот, таких, как алифатические моно и дикарбоновые кислоты, фенилзамещенные алкановые кислоты, гидроксиалкановые кислоты и гидроксиалкандиоловые кислоты, ароматические кислоты, алифатические и ароматические сульфоновые кислоты. Так, такие фармацевтически приемлемые соли включают ацетат, фенилацетат, трифторацетат, акрилат, аскорбат, бензоат, хлорбензоат, динитробензоат, гидроксибензоат, метоксибензоат, метилбензоат, о-ацетоксибензоат, нафталин-2-бензоат, бромид, изобутират, фенилбутират, (5-гидроксибутират, бутин-1,4-диоат, гексин-1,4-диоат, капрат, каприлат, хлорид, циннамат, цитрат, формиат, фумарат, гликолят, гептаноат, гиппурат, лактат, малат, малеат, гидроксималеат, малонат, манделат, мезилат, никотинат, изоникотинат, нитрат, оксалат, фталат, терефталат, фосфат, моногидрофосфат, дигидрофосфат, метафосфат, пирофосфат, пропиолат, пропионат, фенилпропионат, салицилат, себацинат, сукцинат, суберинат, сульфат, бисульфат, пиросульфат, сульфит, бисульфит, сульфонат, бензолсульфонат, п-бромфенилсульфонат, хлорбензолсульфонат, этансульфонат, 2-гидроксиэтансульфонат, метансульфонат, нафталин-1 -сульфонат, нафталин-2-сульфонат, п-толуолсульфонат, ксилолсульфонат, тартрат и тому подобное. Предпочтительной солью является хлористоводородная соль. Фармацевтически приемлемые соли присоединения кислоты обычно образуются взаимодействием соединения формулы (I) с эквимолярным или избыточным количеством кислоты. Реагенты обычно 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 8 взаимодействуют в растворителе таком, как диэтиловый эфир или бензол. Соль обычно высаживается из раствора в течение около от одного часа до 10 дней и может быть отделена фильтрацией, либо растворитель может быть отогнан общепринятыми методами. Основания, обычно используемые для образования солей, включают гидроксид аммония и гидроксид щелочного или щелочноземельного металла, карбонаты и бикарбонаты, а также алифатические и первичные, вторичные и третичные амины, алифатические диамины. Основания, предпочтительно используемые для получения солей прибавления, включают гидроксид аммония, карбонат калия, метила*мин, диэтиламин, этилендиамин и циклогексиламин. Фармацевтически приемлемые соли обычно имеют улучшенные характеристики растворимости по сравнению с соединениями, производными которых они являются, и поэтому, они часто более удобны для приготовления составов в виде жидкостей или эмульсий. Фармацевтические составы могут быть приготовлены способами, известными специалистам Например, соединения могут быть включены в состав с обычными добавками, разбавителями или носителями и изготовлены в форме таблеток, капсул, суспензий, порошков и тому подобное. Примеры добавок, разбавителей и носителей, которые являются подходящими для таких составов, включают следующие: наполнители экстендеры, такие как крахмал, сахар, маннитол и кремниевые производные; связующие агенты, такие как карбоксиметилцеллюлоза и другие производные целлюлозы, альгинаты, желатин и поливинилпирролидон; увлажняющие агенты, такие как. глицерин; разрыхляющие агенты, такие как карбонат кальция и бикарбонат натрия; агенты, затрудняющие растворение, такие как парафин; ускорители ресорбции, такие как четвертичные аммониевые соединения; поверхностно-активные агенты, такие как цетиловый спирт, моностеарат глицерина; адсорбционные носители такие, как каолин и бентонит; смазывающие агенты, такие как тальк, стеарат кальция и магния и твердые проиэтиленгликоли. Соединения могут также входить в состав эликсиров или растворов, подходящих для орального введения, или в качестве растворов, подходящих для парентерального введения, например, внутримышечным, подкожным или внутривенным пу 9 26770 тем. Дополнительно, соединения вполне пригодны для дозированных форм с замедленным высвобождением и тому подобных. Составы могут быть так составлены, что они высвобождают активный ингредиент только или предпочтительно в области кишечного тракта, возможно, в течение некоторого периода времени. Покрытия, оболочки и защитные матрицы могут быть изготовлены, например, из полимерных веществ или восков. Конкретная доза соединений формулы (I), требуемая для повышения функции макрофага или лечения индивидуумов с ослабленным иммунитетом, согласно изобретению, будет зависеть от серьезности состояния, пути введения и родственных факторов, определяемых наблюдающим врачом. Обычно допустимые и эффективные ежедневные дозы составляют от около 0,1 до около -1000 мг/день и более, обычно от около 50 до 200 мг/день. Такие дозы будут назначаться субъекту, нуждающемуся в лечении, примерно от одного до трех раз в день или более часто, как это требуется для эффективного лечения или профилактики заболевания(ий) или симптома(ов). 5 10 15 2© 25 Обычно предпочтительно вводить сое- 30 динение формулы (І) в форме кислотноаддитивной соли, как это делается обычно при введении фармацевтических препаратов, содержащих основную группу, такую, как пиперидиновое кольцо. Предпоч- 35 тительно назначать соединение по изобретению взрослому человеку (например, женщинам постклимактерического периода). Для таких целей подходят следующие оральные дозированные формы. 40 Готовые формы препаратов или составы. В составах, приведенных далее, "активный ингредиент" означает соединение 45 формулы (I). Состав 1. Желатиновые капсулы Твердые желатиновые капсулы получают следующим образом: Ингредиент Количество 50 (мг/капсула) Активный ингредиент 0,1-1000 Крахмал, NF 0-650 Сыпучий порошок 55 крахмала 0-650 Силиконовая жидкость 350 сСт 0-15 Ингредиенты измельчают, пропускают через сито № 45 меш US и заполняют в твердые желатиновые капсулы. 10 Примеры приготовленных конкретных капсулированных составов ралоксифена включают показанные далее: Состав 2. Ралоксифеновые капсулы Ингредиент Количество, мг/капсула Ралоксифен 1 Крахмал, NF 112 Сыпучий порошок крахмала 225,3 Силиконовая жидкость 350 сСт 1,7 Состав 3. Ралоксифеновые капсулы Ингредиент Количество, • мг/капсула Ралоксифен 5 Крахмал, NF 108 Сыпучий порошок крахмала 225,3 Силиконовая жидкость 350 сСт 1,7 Состав 4. Ралоксифеновые капсулы Ингредиент Количество, мг/капсула Ралоксифен „ 10 Крахмал, NF 103 Сыпучий порошок крахмала 225,3 Силиконовая жидкость 350 сСт 1,7 Состав 5. Ралоксифеновые капсулы Ингредиент Количество, мг/капсула Ралоксифен 50 Крахмал, NF 150 Сыпучий порошок крахмала 397 Силиконовая жидкость 350 сСт 3,0 Конкретные составы, указанные выше, могут модифицироваться в соответствии с желаемыми предусмотренными изменениями. Составы в виде таблеток получают с использованием ингредиентов, указанных ниже: Состав 6. Таблетки Ингредиент Количество, мг/таблетка Активный ингредиент 0,1-1000 Целлюлоза, микрокристаллическая 0-650 Диоксид кремния, измельченный в пыль 0-650 Стеариновая кислота 0-15 Компоненты измельчают и прессуют в виде таблеток. Альтернативно, таблетки, каждая из которых содержит 0,1-1000 мг активного ингредиента, получают следующим образом: 11 26770 Состав 7. Таблетки Ингредиент Количество, мг/таблетка Активный ингредиент 0,1-1000 Крахмал 45 Целлюлоза, микрокристаллическая 35 Поливинилпирролидон (в виде 10% раствора в воде) 4 Натрий карбоксиметилцеллюлоза 4,5 Стеарат магния 0,5 Тальк 1 Активный ингредиент, крахмал и целлюлозу пропускают через сито № 45 меш US и тщательно перемешивают. Раствор поливинилпирролидона перемешивают с полученным порошком и затем пропускают через сито № 45 меш US. Гранулы, полученные таким образом, сушат при 5060°С и пропускают через сито № 18 меш US. Затем к гранулам добавляют натрийкарбоксиметилкрахмал, стеарат магния и тальк, предварительно пропущенные через сито № 60 меш US, и после перемешивания прессуют в аппарате для изготовления таблеток с получением таблеток. Суспензии, каждая из которых содержит 0,1-1000 мг препарата на 5 мл дозы, получают следующим образом: Состав 8. Суспензии Ингредиент Количество, мг/5 мл Активный ингредиент 0,1-1000 мг Натрий карбоксиметилцеллюлоза 50 мг Сироп 1,25 мг Раствор бензойной кислоты 0,10 мл Вкусовая добавка q.v. Краситель q.v. Очищенная вода до 5 мл Активный ингредиент пропускают через сито № 45 меш US и смешивают с натрийкарбоксиметилцеллюлозой и сиропом до образования однородной пасты. Раствор бензойной кислоты, вкусовую добавку и краситель разбавляют некоторым количеством воды и добавляют при перемешивании. Затем добавляют достаточное количество воды для получения требуемого объема. Опытные исследования Анализ 1. Проводят испытания, как описано Freidman et at. J. Clin. Invest., 1985, 75, 162-167 (включено здесь в качестве ссылки) с некоторыми изменениями. Мышам в количестве от пяти до ста 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 12 особей вводят оральные дозы порядка 1 10 мг/кг соединения формулы (І) в течение дня. После введения собирают макрофаги и определяют количественно изменения как иммунного (Fc-опосредованного), так и неиммунного фагоцитоза с использованием конъюгированных с флюоресцеином дрожжевых частиц, полученных на основании Pagsdale, J. Immunol. Meth., 1989, 123:259. Для случая иммунноопосредованного фагоцитоза конъюгированные с флюоресцеином дрожжи предварительно инкубируют с сывороткой мыши, чтобы способствовать опсонизации. Увеличение поглощения флуоресценции макрофагами характеризуется количественно как флюоресцентное излучением с использованием длин волн возбуждения и излучения 482 и 520 нм, соответственно. Эту процедуру осуществляют с культурами макрофага ex vivo или in vitro и изменения характеризуют количественно в единицах флуоресценции. Увеличение в единицах флуоресценции по сравнению с контролем свидетельствует об активности соединений формулы (I). Анализ 2. Осуществляют процедуру, как описано Zuckerman et al., Cell. Immunol., 1986, 103-207; J. Immunol., 1988, 140-978 (включено здесь в качестве ссылки). Способность индуцировать антигены второго класса и, следовательно, промотировать презентацию антигена определяют на первичных перитональных макрофагах ex vivo и на клеточной линии P388D1 микрофага мышей in vitro. Пяти-ста мышам вводят дозы соединения формулы (I), собирают макрофаги и зондируют антителами против антигенов второго класса Dгаплотипа. Увеличение экспрессии антигена второго класса определяют поточной цитометрией с использованием соответствующих вторичных антител. Исследованиями in vitro оценивают эффект соединений по повышению основного уровня и индуцируемой гамма интерфероном экспрессии антигена второго класса путем поточной цитометрии. Увеличение экспрессии второго класса отражает повышение активации макрофага. Анализ 3. Осуществляют процедуру, описанную Seow et al., J. Immunol. Meth., 1987, 113 (включено здесь в качестве ссылки). Анализ используют для оценки усилений эффекторных функций макрофага, для которого используют измерение поглощения 2-деоксиглюкозы. Макрофаги ex vivo и in vitro помещают на 26770 13 пластинку с 96 углублениями при 105 клеток на каждое углубление и инкубируют в растворе фосфатного буфера в присутствии 0,78 ^іСі/мл ЗН-деоксиглюкозы, и в углубления помещают соединение (I). Уменьшение количества внеклеточной глюкозы отражает поглощение этого неметаболизируемого глюкозного аналога и, следовательно, обеспечивает независимый анализ по определению состояния активации макрофага посредством соединения формулы (I). Повышение поглощения деоксиглюкозы с помоиъю соединения (I) показывает способность соединения усиливать состояние активации макрофага. Анализ 4. Осуществляют процедуру, описанную Zuckerman., Circ Shock, 1986, 279 (включено здесь в качестве ссылки), для иллюстрации способности соединений формулы (I) к защите на моделях сепсиса и эндотоксиновой смертности мышей. Пяти-ста мышам вводят орально дозы 1-10 мг/кг соединения формулы (I) в течение 1 недели до вызываемого искусственно сепсиса. Сепсис вызывают, применяя инъекцию эндотоксина в условиях, при которых достигается ЛД 100 (200 \хг липополисахарида). Экзогенные глюкокортикоиды такие, как дексаметазон, в количестве 20 мг/кг служит положительным контролем по увеличению выживаемости. Действие соединения формулы (I) определяют также, используя модель сепсиса, включающую наложение лигатуры и прокол слепой кишки. Сепсис как грамположительными, так и грамот рицательными организмами приводит к ЛД 100 в течение 48 ч, несмотря на применение антибиотиков. Повышение числа выживших животных или времени выживания по сравнению с контролем показывает активность соединений. Анализ 5. Способность соединений формулы (I) увеличивать секрецию цитокинов таких, как TNF определяют количественно in vivo с помощью измерения сыворотки с использованием коммерчески доступного TNF ELISAs специфичного для TNF мышей. Пяти-ста мышам дают орально по 1-10 мг/кг соединения формулы (І) в течение 1 недели до введения 5 10 15 20 25 30 35 40 45 14 летальной или сублетальной дозы липополисахарида (LPS) (200 и 1 цгг соответственно). Спустя 1 ч после инъекции LPS мышам пускают кровь и определяют базальное и индуцируемое LPS количества TNF в сыворотке. Обычно уровни TNF ниже 10 пкг/мл наблюдается до введения LPS и уровни 5-20 нг/мл достигаются после введения LPS. Определяют способность соединений модулировать базальный и индуцируемый уровни TNF. Увеличения базального TNF без запуска массивного системного высвобождения TNF у мышей, обработанных соединением, показывает активность соединений промотировать секрецию цитокинов. Наконец, выполнялись также измерения ex vivo и in vitro высвобождения TNF из персональных макрофагов, подверженных действию 1-5 мкМ соединения in vitro, с помощью ELISA для определения степени увеличения цитокина, опосредованного соединением формулы (I). Анализ 6. От пяти до пятидесяти женщин были выбраны для клинических испытаний. Женщины были иммуноподавленными. Ввиду идиосинкразивной и субъективной природы этих заболеваний исследование включало контрольную группу с плацебо, то есть, женщины были разделены на две группы, одна из которых получала соединение формулы (І) в качестве активного агента, а другая получала плацебо. Женщины из опытной группы получали от 50-200 мг лекарства в день. Они продолжали это лечение в течение 3-12 месяцев. Велась аккуратная регистрация числа и тяжести симптомов в обеих группах, и в конце исследований эти результаты сравнивались. Результаты сравнивают между членами каждой группы, а также результаты для каждого пациента сравнивают с симптомами, сообщенными каждым пациентом перед началом исследований. Полезность соединений формулы (I) иллюстрируется положительным действием, которое они оказывают, по крайней 50 мере, в одном из вышеописанных анализов. Упорядник Техред М. Келемеш Коректор М.Самборська Замовлення 529 Тираж Підписне Державне патентне відомство України, 254655, ГСП, Київ-53, Львівська пл.е 8 Відкрите акціонерне товариство "Патент", м. Ужгород, вул, Гагаріна, 101