Спосіб індикації динітроортокрезолу

6 МПКА61 g5/0205 СПОСІБ ІНДИКАЦІЇ ДИНІТРООРТОКРЕЗОЛУ Винахід відноситься до медицини, а саме до вирішення питання про способи індикації токсичних речовин, зокрема динітроортокрезолу в різних органах та тканинах. Кількість нових хімічних сполучень, у тому числі і пестицидів, що циркулюють у навколишньому середовище збільшується вражаючими темпами. Збільшення кількості аестицидних препаратів, які застосовуються у сільському господарстві є однією з необхідних мір підвищення сільськогосподарського виробництва. Однак загальновідомі і негативні боки впливу хімічних засобів захисту рослин, зокрема динітроортокрезолу (ДНОК) на організм осіб, які контактують з ними як в умовах промислового виробництва, так і використання в аграрному секторі. Надходячи до організму теплокровних, у тому числі і людини, пестициди мають здатність до матеріальної і функціональної кумуляції, викликаючи несприятливий в токсикологічному відношенні, вплив на різноманітні, і, особливо, на життєво важливі органи і системи організму, що у кінцевому підсумку реалізується виникненням і розвитком важких гострих і хронічних інтоксикацій. З метою вишукування і розробки високоефективних засобів лікування та профілактики гострих і хронічних отруєнь ксенобіотиками різноманітної хімічної будови надзвичайно важливе значення мають дані всебічних токсикокінетичних досліджень, спрямованих передусім на оцінку вмісту токсичних речовин у різноманітних біосередовищах організму. Все це в повній мірі стосується і до динітрофенольних пестицидів, серед яких особливою небезпекою в плані розвитку гострих смертельних отруєнь відрізняється ДНОК. Існує відомий спосіб визначення ДНОК в крові і сечі [1], який заснований на екстракції даного пестициду з плазми крові метілетилкетоном з наступним визначенням його концентрації фотоелектрокалорімет ричним засобом та обраний нами як прототип. Однак він не придатний для індикації даного сполучення в органах і тканинах. Основним недоліком прототипу є те, що цей спосіб не дозволяє визначити вміст вищезазначеної речовини в органах і тканинах, що необхідно для більш повного та правильного судження про долю ксенобіотику в організмі і його депонування. Це, з нашої точки зору, може бути пояснене зв'язуванням ДНОК як біполярної сполуки з високомолекулярними молекулами і передусім з тканинними білками, що є ключовою перешкодою для проведення необхідної екстракції речовини, що аналізується меті летилкето но м. Мета нинішнього винаходу - розробка високочутливого та точного способу кількісної індикації ДНОК в різноманітних органах і тканинах. Зазначена мета досягається тим, що для кількісного визначення динітроортокрезолу в органах або тканинах до їх суспензії попередньо додають 0,1 мл 1% розчину хімопсину / фармакопейного препарату з групи протеолітичних ферментів (виробництва п/о «Ленмясокомбинат»), що містить комбінацію а-хімотрипсину і трипсинуга інкубують в термостаті на протязі 8-12 годин при температурі 37°С. Принцип запропонованого нами способу заснований на розщепленні високомолекулярних білків та липопротеідів, що складають основу клітинних та субклітинних мембран органів і тканин хімотрипсином і наступної екстракції ДНОК метілетилкетоном з органів і тканин відомим способом. Теоретичним обгрунтуванням доцільності та ефективності використання такого методичного підходу можуть бути дані літератури [2, 3], згідно з якими, саме хімотрипсин надто активно гідролітично розщеплює як низько -, так і високомолекулярні білки. Він особливо легко розщеплює зв'язки, в утворенні яких беруть участь карбоксильні групи аргініну та лізину. Якщо трипсин розщеплює тільки 1/3 всіх пептидних зв'язків в білковій молекулі, то хімотрипсин гідролізує також і пептони з утворенням відносно низькомолекулярних пептидів. Цікаво, що хімотрипсин розщеплює здебільшого ті пептидні зв'язки, на які трипсин не діє. Хімотрипсин прискорює також гідроліз зв'язків, утворених залишками триптофану, тирозину та фенілаланіну. Слід відзначити і ту особливість хімотрипсину, що він має більш широку (у порівнянні з трипсином) субстратну специфічність, каталізуючи гідроліз не тільки пептидів, але й ефірів, гідроксаматів, амідів та інших ацилпохідних. Дослідження проводилися на моделі гострої інтоксикації, білих безпородних щурів обох статей масою 170-220 г, що розвивається при однократному пероральному введенні 1% розчину амонійної солі ДНОК в дозі, відповідної середньосмертельній (LDso) - 40 мг/кг. Контролем вважалася група інтактних тварин, яким вводили аналогічний обсяг питної води. Вміст ДНОК визначали в таких органах: нирках, серці, легенях, печінці і в м'язовій тканині через 6 годин від початку надходження отрути в організм. Експериментальним підтвердженням переваг розробленого способу над прототипом є дані, наведені у таблиці 1, з якої видно, що показники визначення ДНОК в крові і сечі по засобу, що використовується як прототип і, запропонований спосіб корелюють між собою і цілком порівняні. Це свідчить про адекватність та точність запропонованого способу і виключає помилку експерименту. В цій же серії досліджень також показане, що в різноманітних тканинах засобом-прототипом ДНОК не визначається. Запропонований же спосіб дає можливість визначити рівень ДНОК в усіх органах, що дає можливість судити про депонування і хемобіокинетику даного токсичного агенту в динаміці. Хід ведення кількісного визначення ДНОК в органах та тканинах може бути уявлений в наступному вигляді. Навіска біосередовища, що аналізується масою 0,5 г, піддається гомогенізації з використанням кварцового піску. До отриманого гомогенату додається 1 мл фосфатного буферу з рН 7,6-7,8 (при даних значеннях рН реалізується найвища актив Таблиця 1 ВМІСТ ДНОК (мкг/мл) В РІЗНИХ БЮСЕРЕДОВИЩАХ У ЩУРІВ ПРИ ГОСТРІЙ ІНТОКСИКАЦІЇ ЦИМ СПОЛУЧЕННЯМ п=6-8 Біосередовище, що досліджується Концентрація ДНОК Запропонований спосіб Прототип Сироватка крові 46,3±2,09* 47,9±3,14 Сеча 2,5±0,26* 2,7±0,31 Нирки 1,02±0,32 н/в М'язи 1,05±0,15 н/в Серце 1,40±0,14 н/в Легені 0,86±0,12 н/в Печінка 4,11±0,16 н/в Примітка: Н/В - не визначається * - Р>0,05 в порівнянні з прототипом ність протеолітичних ферментів). До цієї суспензії додають 0,1 мл 1% розчину хімопсину, ретельно струшують протягом 3-х хвилин і інкубують у термостаті при температурі 37±0,5°С протягом 8-12 годин. Після експозиції в пробу додають 1 мл метілетилкетону (ч. д. а.). З метою попередження випаровування метілетилкетону пробірки закривають пробками. Проводять екстракцію шляхом струшування пробірки протягом 58 хвил. Після цього проби центрифугують при 1500 об/хвил протягом 5-6 хвил. Надосадну рідину, що являє собою розчин ДНОК у метілетилкетоні переносять в кювету товщиною 0.8 мм. Спектрофотометрування проводять кількісно при довжині хвилі 440 нм на спектрофотометрі СФ-46. Концентрацію ДНОК у пробі визначають по калібрувальному графіку, що будується по результатах спектрофотометрування проб зі стандартними концентраціями ДНОК з використанням узвичаєних прийомів. Оптимальна кількість хімопсину та час необхідної інкубації отримані експериментально (див. табл. 2). Отримана таким чином концентрація ДНОК має вимірність мг/мл. З метою перекладу її в мг/г можна використати наступну формулу: -,г . , С[МГ/МЛ].ІМЛ ҐЧТ і і ТПТҐЛІГ і і С[мг/кг]=— ----------------, де С[мг/мл] концентрація ДНОК в мг/мл; І мл- кількість метілетилкетону, який застосовується для екстракції ДНОК в одній пробі; 0,5 г - вага біоматеріалу, що досліджується. Таким чином, проведені комплексні дослідження дозволили розробити надто високочутливий і точний спосіб визначення дінітроортокрезолу в різних органах і тканинах організму при інтоксикації цим токсичним агентом. Чутливість способу складає 3,83- 10-3мг/г. При цьому умови проведення методики уніфіковані. В основу розробленого способу покладений принцип екстракції ДНОК метілетилкетоном з попереднім протеолітичним розщепленням білків гомогенізованих тканин хімотрипсином. При цьому уніфіковані умови проведення методики. є Таблиця 2 КОНЦЕНТРАЦІЯ ДНОК, ЩО ВИЗНАЧАЄТЬСЯ (мкг/г) У ЗАЛЕЖНОСТІ ВІД КІЛЬКОСТІ ХІМОПСИНУ ТА ЧАСУ ІНКУБАЦІЇ В ТЕРМІН ДОСЛІДЖЕННЯ 6 ГОД Орган, що досліджується Час інкубації, год Кількість хімопсину 0,05 мл 0,1 мл 10/ 1 /о 0,2 мл Н/В Н/В 1 0,40±0,01 0,50±0,03 2 1,ЗО±О,24 1,81±0,74 4 І,80±0,27 2,04±0,62 8 1,95±0,29 2,04±0,51 12 2,00±0,60 2,04±0,61 16 Н/В Н/В М'язи 1 Н/В 0,90±0,03 2 1,00±0,09 1,80±0,П 4 1,35±О,12 2,Ю±О,ЗО 8 1,19±0,26 2,10±0,25 12 1,69±0,33 2,Ю±0,38 16 Н/В Н/В Серце 1 0,85±0,06 0,90±0,05 2 1,62±0,12 1,95±0,31 4 2,51±0,26 2,80±0,28 8 2,68±0,23 2,79±0,31 12 2,75±0,31 2,80±036 16 Н/В Н/В Легені 1 0,90±0,05 1,03±0,30 2 1,34±0,21 2,31±0,41 4 2,42±0,38 2,80±0,28 8 2,51±0,43 2,79±0,31 12 2,73±0,36 2,80±0,4І 16 Н/В Н/В Печінка 1 3,62±0,31 4,51±0,31 2 5,87±0,31 8,22±0,32 4 6,12±0,21 8,23±0,21 8 7,02±0,41 8,23±0,39 12 8,00±0,23 8,21±0,47 16 Примітка: Н/В - не визначається Нирки 0,05 мл 0,1 мл 0,2 мл Н/В Н/В Н/В Н/В 0,51±0,02 1,41±0,35 2,00±0,6І 2,03±0,47 0,49±0,05 1,31±0,15 2,04±0,51 2,03±0,32 0,40±0,05 1,29±0,54 2,01±0,58 2,02±0,61 0,38±0,06 1,32±0,09 2,00±0,35 2,04±0,31 2,04±0,36 2,04±0,54 2,04±0,32 2,04±0,52 Н/В Н/В Н/В Н/В 1,10±0,31 0,91±0,05 1,11±0,23 1,12±0,34 1,95±0,53 2,10±0,23 2,10±0,61 2,10±0,31 1,81±0,32 2,П±0,51 2,09±0,46 2,10±0,75 2,00±1,51 2,10±0,36 2,11±0,50 2,10±0,32 2,09±0,39 2,10±0,21 2,10±0,61 2,11±0,39 Н/В Н/В Н/В Н/В 0,90±0,03 0,91±0,06 0,91±0,04 1,01±0,08 2,00±0,51 2,01±0,51 1,96±0,21 2,03±0,24 2,81±0,23 2,80±0,35 2,80±0,21 2,80±0,35 2,80±0,21 2,80±0,26 2,79±0,46 2,80±0,52 2,80±0,37 2,80±0,41 2,81±0,41 2,80±0,62 Н/В Н/В 1,П±0,21 2,45±0,35 2,80±0,31 2,81±0,35 2,80±0,14 Н/В 1,04±0,21 2,30±0,25 2,80±0,35 2,80±0,21 2,80±0,31 1,11±0,31 2,40±0,21 2,81±0,31 2,80±0,34 2,80±0,25 Н/В 1,13±0,31 2,52±0,32 Н/В Н/В Н/В Н/В 4,36іО,41 8,22±0,і7 8,20±0,36 5,11±0,26 8,22±0,40 8,22±0,32 4,30±0,26 8,21±0,23 8,22±0,22 4,37±0,25 8,2і±0,42 8,21±0,31 8,23±0,41 8,21±О,29 8,21±0,42 8,22±О,36 8,21±0,37 8,22±0,64 8,22±0,38 8,21±0,27 2,79±0,36 2,81±0,27 Раціональне використання розробленого способу дозволить досліджувати основні параметри хемобіокінетики ДНОК в організмі теплокровних і на цій основі проводити науково-обгрунтоване вишукування й розробку антидотно-лікувальних засобів ДНОК-інтоксикації, а також використовувати запропонований спосіб з метою діагностики гострих і хронічних отруєнь, в тому числі і в випадках виявлення передпатологічних станів, викликаних надходженням ДНОК до організму. ЛИТЕРАТУРА 1. Буркацкая Е.Н., Иванова З.В., Лысина Г.Г. Медицинское обследова ние лиц, работающих с пестицидами.- К.: Здоровья.- 1978.- 184 с. 2. Айсина Р.Б., Казанская Н.Ф., Лукашева Е.В. Получение и свойства микрокапсулированного а-химотрипсина // Биохимия.- 1976.- т.41, вып. 9, С. 1656-1661. 3. Веременко К.Н. Современное состояние и основные задачи медицин ской энзимологии // Врачебное дело.- 1982.- №8.-С. 8-14.