Спосіб виготовлення індикаторних смуг для визначення глюкози в крові

Изобретение относится к медицине, а именно к способам изготовления индикаторных полос для определения глюкозы в крови. Цель изобретения - упрощение способа и повышение качества индикаторного слоя полос. , Форфатцеллюлоэную бумагу пропитывают 1%-ным раствором омыленного сополимера винилхлорида с винилацетатом в ацетоне и высушивают. Полученную бумагу пропитывают раствором о-толидина в этаноле и сушат. На полученную бумагу наносят смесь, содержащую ферменты, поливинилацетат и буфер. После высушивания полученную индикаторную бумагу наклеивают на полимерную основу и нарезают. 3 з.п, ф-лы, 9 табл. ._.-•' (Л CD 1269021 I Изобретение относится к медицине, а именно к способам изготовления индикаторных полос для количественного определения глюкозы в крови, "Цель изобретения - упрощение способа и повышение качества индикаторного слоя полос. Цель достигается тем, что вместо желатины используется один или несколько синтетических полимеров в виде растворов или дисперсий, при изготовлении индикаторных полос не требуется термостатирования наносимого состава, сушка индикаторной полосы занимает 1,5-2 ч. Способ осуществляют следующим образом. Наносят на полимерную подложку индикаторного слоя, включающего впитывающую целлюлозную основу (в том числе модифицированную катионообменную целлюлозу), глюкозооксидазу, пероксидазу, хромогенный реагент о-толидин, с последующей сушкой слоя или отверждением и нарезкой. При этом вместо желатины используют один или несколько синтетических или искусственных полимеров в виде растворов иди дисперсий. соотношении пропиточного раствора к бумаге 0,7-1,0 г на 100 см 2 . 0,3%-ный раствор триацетатцеллк»лозы в диоксане готовят при комнат5 ной температуре растворением 0,9 г , мелко нарезанной триацетати,еллюлозной пленки в 300 см диоксана, предварительно перегнанного над металлическим натрием. Получаемый раствор 10 характеризуется плотностьюР = = 1,035 г/см' и вязкостью? =2,102 сП. Полученную индикаторную бумагу высушивают в течение 20 мин при комнатной температуре, наклеивают на 15 полимерную основу с помощью двухсторонней липкой ленты и разрезают на полосы необходимых размеров . 20 25 30 П р и м е р 1. Бумагу карбоксиметилцеллюлозную пропитывают 1%-ным раствором о-толидина в этиловом спирте и. высушивают при комнатной температуре 20-30 мин. Готовят смесь 35 следующего состава: Вода 55 мл Глюкозооксидаза из Penicilliura v i t a l e Pidopl. et B i l a i Пероксидаза Фосфатный буфер 2 М (РН 5,5) 0,16 г 0,04 г 4,8 мл 40 Индикаторная зона полученных полос в исходном состоянии имеет белый цвет с кремовым оттенком. Коэффициент отражения полос в области ^'600 нм равен 61-63%, После контакта в течение 1 мик с кровью, содержащей глюкозу, и последующего смывания крови водой индикаторный слой приобретает голубую окраску. При концентрации глюкозы в крови 5,5 ммоль/л коэффициент отражения полос 44%. При концентрации глюкозы в крови 11,2 ммоль/л коэффициент отражения полос 37%. Окраска устанавливается сразу после смывания пробы и сохраняется в течение по крайней мере 20 мин. П р и м е р 2, Хроматографическую бумагу, содержащую карбоксильные или фосфатные группы, пропитывают 2%-ным раствором триацетатцел-" люлозы в смешанном растворителе аце-* тон - диоксан при расходе пропитывающего раствора 1,0-1,5 г на 100 см бумаги, Смесь при комнатной температуре 2%-ный раствор триацетатцеллюлозы 45 готовят растворением при комнатной перемешивают с помощью стеклянной палочки или магнитной мешалки в тетемпературе 6 г мелко нарезанной чение 5-7 мин, В результате должен триацетатцеллюлозной пленки в 300 см получиться гомогенный раствор желсмеси диоксана с ацетоном, взятых в товато-коричневого оттенка, который объемном соотношении 1:1 (диоксан 50 предварительно перегоняется над мехарактеризуется плотностью р = 1,015 г/см 1 и вязкостью 2*° =1,02сП. таллическим натрием). Получаемый раНаносят смеоь на карбоксиметилцеллюствор характеризуется плотностью Р10 =0,9248 г/см' и вязкостью? 7 0 лозную бумагу, предварительно обра=13,32 сП. ботанную раствором о-толидина. После высушивания при комнатной темпе- 55 ратуре в течение 40-60 мин полоса После высушивания в течение 10 мин пропитывается в 0,3%-ном растворе при 50 С бумагу пропитывают в смеси триацетатцеллюлозы в диоксане при следующего состава: 1269021 4 Вода 84 мл Глюкозооксидаза из Penicillium vitale Pidopl. et Bilai Э,4 г Пероксидаза 0,1 г Фосфатный буфер 2М (рН 5,5) 12 мл Поливинилацетат (50%-ная водная дисперсия) J9 г 9-толидин {1%-ный раствор в этаноле) 58 мл Смесь, содержащую указанные компоненты, перемешивают с помощью стеклянной палочки или магнитной мешалки при комнатной температуре в течение 5-7 мин. Получаемая смесь должна представлять собой однородную эмульсию кремового цвета, которая Получается носитель с хромягенным реагентом. Готовят смесь следующего состава: Вода 50 мл Глюкозооксидаза из Гепісііііит vitale Pidopl et Bilai 0,4 г Пероксидаза 0,1 г Фосфатный буфер 2М 10 (рН 5t5) 1 2 мл Поливинилацетат (50% водная дисперсия) 50 г Носитель с хромогенним реагентом 20 г Смесь, содержащую указанные компоненты, перемешивают стеклянной палочкой или магнитной мешалкой при комнатной температуре в течение 1015 мин. В результате должна полу20 читься однородная паста кремового характеризуется плотностью р цвета, характеризуемая плотностью =0,9846 г/см* и вязкостью £20 =5,25 сП. р =1,173 г/см и вязкостью^=20 П. Смесь наносят в количестве 3,0Полученную пасту при комнатной тем3,5 г на 100 см бумаги. После высупературе наносят через фильеру или шивания в течение 15-20 мин при 50 С получается индикаторная лента кремо- 25 с помощью кисти - на активированную полимерную подложку. вого цвета, которую наклеивают на Смесь тщательно перемешивают и подложку с помощью двусторонней липнаносят на активированную полимерную кой ленты и нарезают на полосы. Посподложку в количестве 6-7 г на 100 см ле контакта с кровью в течение 1 мин и смывания крови водой полосы окра- 30 подложки, сушат при комнатной температуре в течение 1,5-2 ч и нарезашиваются в голубой цвет. Зависимость ют на полосы. интенсивности окраски от концентраАктивированную полимерную подложции глюкозы в крови (коэффициент отку получают путем погружения триацеражения Т при Я У 600 нм) показана в татцеллюлозной пленки в ванну с 30%табл. 1 35 ным раствором щелочи (гидроокиси Интенсивность окраски полос уста-» натрия) при 50 С на 10 мин. После навливается в течение I мин и не мещелочной обработки пленку промывают няется по крайней мере в течение водопроводной водой в течение 10 мин 30 мин.' при 15-2О°С до нейтральной реакции 40 промывной воды, а затем прополаскиП р и м е р 3. 50 г порошковой вают в течение 2-3 мин в дистиллирокарбоксиметилцеллюлозы обрабатывают ванной воде. Промытую активированную 150 мл 1%-ного раствора о-толидина полимерную подложку сушат при комв этиловом спирте, перемешивая до натной температуре 30-40 мин. Полу45 полного удаления растворителя, ченная пленка отличается от обычной исходной триацетатцеллюло-чной подПропитку порошковой карооксимеложки слабым матовым налетом. тилцеллюлозы этанольным раствором Индикаторная зона полос в исходо-толидина проводят под вытяжкой при ном состоянии имеет кремовую окраскомнатной температуре путем пёреме- 50 ку. При контакте с кровью в течение тивания стеклянной палочкой смеси 1 мин и последующем смывании крови карбоксиметилцеллюлозы с раствором водой полосы приобретают голубой 0-толидина до полной ее однородности. цвет, интенсивность которого возрасПеремешивание (под вытяжкой) продолжают на водяной бане при 50 С в ши- 55 тает с ростом концентрации глюкозы в крови. рокой фарфоровой чашке в течение 2030 мин до получения сухого однородРезультаты испытаний приведены ного порошка кремового цвета. в табл. 2 . \ь S 1269021 Интенсивность окраски полос устаПример 5. Фосфатцеллюлозную навливается спустя 1 мин после смыбумагу пропитывают 1%-ным раствором вания крови и сохраняется постояномыленного сополимера вннилхлорида ной по крайней мере в течение 30 мин. с винилацетатом А-15-0 в ацетоне при) Пример 4. Фосфатцеллюлозную 5 соотношении 1,5-2,0 г раствора на 100 см 1 бумаги, высушивают в течебумагу пропитывают 1%-ным раствором ние 10 мин при. 50 С. этилцеллюлозы. 1%-ный раствор омыленного сополи1%-нын раствором этилцеллюлозы мера винилхлорида с винилацетатом получают растворением 2 г порошковой этилцеллюлозы в 200 см смеси толуо- № А-15-0 готовят растворением при комнатной температуре 2 г сополимера ла и этанола, взятых в объемном сов 200 см ацетона. Полученный растотношении 1:1. Раствор характеризувор характеризуется плотностью р ется р м =0,832 г / с м \ 2 г о =0,893 сП. 2 =0,7895 г/см и вязкостью f = Этим раствором пропитывают фосфат15 =0,547 СП. целлюлозную бумагу при соотношении Полученную бумагу пропитывают 1%1,5-2,0 г указанного раствора на ным раствором о-толидина в этаноле 100 см бумаги. Высушивают при 50 С при соотношении 0,7-1,0 г раствора в течение 10 мин. 2 на 100 с м бумаги, сушат при 50 С в Полученную бумагу пропитывают 1%20 течение 10 мин. На полученную бумагу, ным раствором б-толидина в этаноле наносят смесь, содержащую ферменты, при соотношении 0,7-1,0 г раствора поливинилацетат и буфер, как в прина 100 см 3 бумаги,высушивают при 3(fc в мере 4. После высушивания при 50 С течение 15 мин.На полученную бумагу нав течение 20мин полученную индиканосят смесь следующего состава. Вода 60 мл Глюкозооксидаза из Penicillium vitale Pidopl. et Bilai 0,2 г j Пероксидаза 0,05 г Фосфатный буфер 2М (рН 5,5) 10 мл Поливинилацетат (50% водная дисперсия) 22 г Смесь, содержащую указанные компоненты, при комнатной температуре перемешивают стеклянной палочкой или с помощью магнитной мешалки в течение 5-7 мин, В результате должна получиться однородная эмульсия кремового цвета, которая характеризуется плотностью р20 =1,038 г/см' и вязкостью Iго =2,957 сП. Соотношение смеси к бумаге 1,01,5 г на 100 см . После сушки в течение 40 мин при комнатной темпера'туре получают индикаторную бумагу кремового цвета, которую наклеивают с помощью двусторонней липкой ленты на полимерную подложку и наре'зают на отдельные полосы» При контакте с кровью в течение 1 мин и последующем смывают крови водой коэффициент отражения полученных полос при •\>Ь00 нм изменяется в зависимости от концентрации глюкозы в крови, Зависимость коэффициента отражения полос от концентрации глюкозы в крови дана в табл. 3. 2S торную бумагу наклеивают на полимерную основу и нарезают. Аналитические характеристики получаемых таким образом полос выражаются следующей зависимостью коэффициента отражения 30 полос от концентрации глюкозы в крови, которая представлена в табл. 4. Окраска устанавливается через 1-2 мин после смывания пробы крови и сохраняется постоянной по крайней мере в течение 30 мин. 40 45 50 55 П р и м е р 6. Хроматографическую бумагу, содержащую карбоксильные или фосфатные группы, пропитывают 2%-ным раствором уретанового каучука в 'этилацетате при соотношении 1,01,5 г раствора на 100 см бумаги, высушивают при комнатной температуре в течение 30 мин» 2%-ный раствор каучука готовят растворением при комнатной температуре 4 г мелко нарезанного каучука в 200 см этилацетата. Получаемый раствор характеризуется плотностью р°=0,897 г/см и вязкостью 2 * = ° =0,772 сП. На полученную бумагу наносят смесь следующего состава: Вода 84 мл Глюкозооксидаза из Penicillium vitale Pidopl. et Bilai 0,4 г • Пероксидаза . 0,1г 269021 8 Фосфатный бусЬер 2М голубая окраска полос (Т приД>600нм) СрН 5,5) 12 мл зависит от концентрации глюкозы в Поливинилацетат крови следующим образом. (50%-ная водная дисРезультаты испытании даны в персия) 19 г 5 табл. 6 . О-толидин (1%-ныи Окраска полос стабильна в течераствор в этаноле) 58 мл ние 20-30 мин. Смесь готовят как в примере 2. П р и м е р 8, Бумагу карбоксиПри контакте полос с кровью в теметилцеллюлозную пропитывают 1%-ным чение 1 мин и последующем смывании 'О раствором б-толидина при соотношекрови коэффициент отражения полос в ний 1,0-1,5 г раствора на 100 см области Я>600 нм зависящий от конбумаги, высушивают при 300 С в течение 15 мин, после чего на нее нацентрации глюкозы в крови, представносят смесь следующего состава: лен в табл. 5, Вода 55 мл 15 Интенсивность окраски полос не Глюкозооксидаза из меняется по крайней мере в течение Penicillium vitalle 30 мин после смывания пробы. Pidopl. et Bilai 0,16 г П р и м е р 7. Бумагу карбоксиПероксидаза 0,04 г метилцеллюлозную пропитывают 2%-ным Фосфатный буфер 2М раствором нитрильного каучука в ме- 20 (рН 5,5) 4,8 мл тилэтилкетоне при соотношении 1-02 Смесь готовят как в примере 1, 1,5 г раствора на 100 см бумаги, Смесь наносят при соотношении высушивают при комнатной температу2 1,0-1,5 г на 100 см бумаги. После ре в течение 30 мин. 5 сушки при 50 С в течение 20 мин поДля приготовления 2%-ного растволученную бумагу пропитывают 0,1%ра каучука 4 г мелко нарезанного ным раствором ацетобутиратцеллншозы каучука растворяют при комнатной в этилацетате при соотношении 0,8температуре в 200 см' метилэтилкето1,2 г раствора на 100 см бумаги. на. Получаемый раствор характеризу30 1%-ный раствор ацетобутиратцеллюется плотностью р =0,806 г/см' и лозы готовят растворением при комвязкостью у20 =0,718 сП. натной температуре 0,2 г порошкообЗатем пропитывают 1%-ным растворазного полимера в 200 см этилацером О-толидина в этаноле при соотнотата. Получаемый раствор характеришении: 0,7-1,0 г раствора на 100см 2 7 бумаги, сушат при комнатной темпера- 35 зуется плотностью р =0,891 г/см и вязкостью 1 =0,668 сП. туре 20-30 мин. Индикаторную бумагу сушат при На полученную бумагу наносят смесь комнатной температуре в течение следующего состава: 20 мин, наклеивают на подложку и наВода 60 мл 40 резают на полосы. Глюкозооксидаза из При контакте с кровью в течение Penicillium vitale 1 мин и последующем смывании крови Pidopl. et Bilai 0,2 г водой интенсивность окраски полос Пероксидаза ' 0,05 г (Т при Л >600 нм) зависит от концент Фосфатный буфер 2М 45 рации глюкозы. (рН 5,5) 10 мл Результаты испытаний даны в Поливинилацетат табл. 7. (50%-ная водная Окраска полос сохраняется постодисперсия) 22 г янной в течение 20-30 мин. Смесь готовят как в примере 4. Сравнительная характеристика Наносимый состав и пропитываемую 50 предлагаемого способа изготовления бумагу берут в соотношении: 0,8-1,2 г индикаторных полос для определения смеси на 100 см 2 бумаги. После сушки глюкозы в крови и известного привепри комнатной температуре в течение дены в табл, 8, 1,5-2 ч индикаторную бумагу кремово55 го цвета наклеивают на подложку и 'Зависимость коэффициента отраженарезают как и в предыдущих примерах. ния {%) индикаторных полос от времеПри контакте с кровью в течение ни, прошедшего после смывания крови. 1 мин и последующем смывании водой 126902 і 0 связывающего компонента в индикаторный слой вводят один или несколько синтетических и (или) искусственных полимеров, при этом используют растворы полимеров в органических р а с т - . ворителях, 2. Способ по п. ^ о т л и ч а ю щ и й с я тем, что в качестве синтетических полимеров используют поливинилацетат, нитрильный каучук, уретановый каучук, омыленный сополимер винилхлорида с винилацетатом. показана в табл. 9,(время контакта = 154 мгХ). с кровью 60 с . , С г , Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я 1. Способ изготовления индикаторных полос для определения глюкозы в крови, включающий нанесение на полимерную подложку индикаторного слоя, в состав которого входят целлюлозная основа, выполненная в виде бумажной ленты либо в виде порошка, глюкозооксидаза из Р е п і с і і і і і л п v i t a l e Pidopl e t B i l a i , пероксидаза, 3 . Способ по пп. 1 и 2, о т л ихромогенный реагент о-толидин, буч а ю щ и й с я тем, что используют фер и связывающий компонент с последисперсию поливинилацетата в воде. дующим высушиванием слоя или его от4 . Способ по п. 1, о т л и ч а верждением и нарезкой, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что в качестве и с ю щ и й с я тем, ч т о , с целью упрокусственных полимеров используют щения способа и повышения качества 20 триацетатцеллюлозу, этилцеллюлозу, индикаторного слоя полос, в качестве ацетобутиратцеллюлозу. Т а б л и ц с, О ммоль/л 4,4 69 44 1 32 13,3 21,6 27 9,5 21 Т а б л и ц а С, ммоль/л 0 т;% Показатели Цельная кровь » ммоль/л 63 2,8 52 '63 Сухая полоса Т=70% Полоса, смоченная водой Т=69% 22,8 30 41 15,0 23 Т а б л и ц а і 2,8 6,7 2 3 Проба 5,0 58 7,8 -52 11,7 16,1 23,3 47 41 36 1269021 Т а б л и ц а I Показатели 4 Проба Цельная кровь > ммоль/л 3,9 8,3 Т, % 61 Сухая полоса 41 50 21,1 36 Т=71% Полоса, смоченная водой 14,5 Т=68% Т а б л и ц а т Показатели Цельная кровь С > ммоль/л 5 Проба 6, 3,3 Т, % 47 Сухая полоса 18,9 23,3 27 22 19 Т=68% Полоса, смоченная водой 12,8 Т=69% 38 Т а б л и ц а ммоль/л Т, % 0 68 6,1 48 10,5 15,5 20,0 41 37 33 Т а б л и ц а ммоль/л Т 7 0 70 5,0 58 6 22,2 "ЗІ 7 10,0 13,9 21,0 51о 46 40 /rf 14 1269021 І З Т а б лица Показатели Усгіовия процесса известному Время сушки бумажной ленты после нанесения индикаторного состава, способу п р едл а г аемому 4-6 Температура наносимого состава. °С ПО 40-45 Необходимость в термостатировании при нанесении индикаторного состава 8 1,5-2,0 10-60 Обязательно, поскольку вязкость наносимого состава зависит от температуры і Не надо, вязкость наносимого состава практически не зависит от температуры Т а б л и ц а 9 Коэффициент отражения, %, после смывания крови, мин Способ 0 ] 0,5 ] 1 1,5 ] 2 | 2,5 Предлагаемый 44 43 43 43 43 43 Известный 49 46 44 43 42 42 Редактор О. Головач Составитель М. Поэняк Техред л.Сердюкова Корректор М. Демчик Заказ 6028/46 Тираж 778 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-Э5, Раушская н а б . , д . 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г« Ужгород, ул, Проектная,