Спосіб виготовлення індикаторних смуг для визначеня глюкози в крові

1. СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ИНДИКАТОРНЫХ ПОЛОС ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛЮКОЗЫ В КРОВИ, предусматривающий нанесение на полимерную подложку индикаторного слоя, включающего впитывающую целлюлозную основу, глюкозооксидазу, перексидазу, хромогениый реагент (19) (И) 415« G 01 N 33/50; С 12 Q 1/26;' Г, і 2 Q 1/54 , о-толидин, с последующей сушкой слоя • или отверждением и нарезкой, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения процесса, в качестве впитывающей целлюлозной основы используют модифицированную катионообменную. целлюлозу, которую перед нанесением на подложку первоначально пропитывают спиртовым растворомО-толидина, а затем вводят в контакт со смесью растворов указанных ферментбв и желатины. 2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что модифицированную катионообменную целлюлозу используют в виде бумажной ленты или порошка. 3. Способ по п. \, о т л и ч а тощ и й с я тем, что в качестве модифицированной катионообменной целлюлозы используют карбоксиметилцеллюлозу или фосфатцеллюлозу. 4. Способ по п, 1, о т л и ч а ющ и и с я тем, что, с целью повышения качества и увеличения сроков использования получаемых индикаторных полос, используют глюкозооксидазу Peniciilium vitale Pidopl. et Bilai» СЛ С 1 2 1155944 относится к медицине, * ^ ды, например ортотолуиднновый, не обладают высокой специфичностью, поа именно к способу изготовления инди(скопьку определеніпо мешают окисляюкаторных полос для опредепения глюкощиеся вещества, содержащиеся в крови, зы в цельной крови. Широкое распространение сахарного Наиболее точным методом определения диабета создает определенные трудносглюкозы является ферментнвныи, закти для проведения большого количестлючающийся з окислении глюкозы глюва анализов в лабораториях в нужные коз ооксидазой слоки. Кроме того, применяемые метоглюкоза глкжозо- _ . оксидаза глгоконовзт: кислота пероксид водорода Образующий пероксид водорода в ная бумага, волокнистый холст), пропитанный смесью глюкозооксидази, присутствии пероксндазы окисляет ттероксидазы, и хромогенного реаген•кромогєиньнї реагент. Интенсивность та - о-толпдипа ('иногда в совокупобразующейся окраски пропорциональна ности с нейтральным твердым связуюсодержанию глюкозы в крови. щим), с последгощеи сушкой или отвержОднако этот метод требует длидением нанесенного слоя, после тельного времени (АО мин), специаль20 чего ил индикаторный слой наносят ной аппаратупы i осуществление его f тонкоячеиступ сетку из синтетической возможно только в лабораторных усткани» закрепляют ее путем нагрева ловиях . и/или давления. Попученную индикаБолее быстрым и удобным является торную лепту нарезают на полосы неметод определения концентрации глю25 обходимой ширины. козы крови с ломоцью индикаторных В способе используют обычно глюполос. Время проведения анализа с козооксидазу Aspergillus niger С ЗІ, помощью индикаторных полос 2-3 мип. 'Получаемые таким образом индикаИзвестны способы изготовления торные полосы позволяют определять индикаторных полос для ферментатив- 30 содержание глюкозы в цельной крови, ного определения глюкозы в бпологиудобны в использовании, так как ческюг жидкостях, заключающиеся в имеющаяся на них тоикоячекстая сетка пропитке соответствующими растворазащищает лсжлщігіт под нсГг индикаторШ Ї фильтровальной бумаги. Такие ный слои от неблагоприятных внешних полоски пригодны для определения воздействии, повышает надежность опглюкозы в моче 111 ГЇЛІІ плазме и сыределения. воротке кровїі [2L. Недостатком способа является его сложность, так как технологический Однако тот факт, что кровь необпроцесс лрсдуматрігчает нанесение спеходимо предварительно обработать, циального связуюіцего слоя, скрепляюзначительно усложняет проведение цего индикаторный слои с полимерной анализа. подложкой, который допжен быгь высуИ'ЗКеСТИЫ СИОСОбЫ ИЗГОТОВЯЄІШЯ. шен ЛІШО ОТВЄРЛЩЄН. к-ндшсатор№к полос для определения количества глюкозы в цельной крови, Данный способ требует дополнительзаключающиеся в обработке фильтроных операций ао изготовлению указанвальной бумаги специальными реактиной сетки и прикреплению ее к индикавами и прикреплении полученной инторному слою» діпсаториой бумаги на подложку, чаше всего па прозоачнуго пластиковую Кроме гого, применяемая глюкозопкенку. оксидаза, выделенная ні штамма Asper50 gillus nigor, нестабильна и проявляНаиболее близким к предлагаемому ет ферментативную активность в узком по технической сущности является интервале рН, что требует введения способ изготовления индикаторных в пропитшаюнше составы буферных полос дня определенияхчиокозы в кровн путем нанесения из полимерную 55 смесегг» подножку спол связующего^ индикаторЦепь изобретения - упрощение споного сипя, ітедстакчяющего собой соба изготовления инликаторішх полос ттигпн-'ГЛІІДП носпхечъ (фтшьтровальдля определения глюкозы в крови. з 1155944 4 цированной бумаги неводным р а с т в о р о м Указанная цель достигается тем, хромогенного р е а г е н т а , высушивания что согласно способу изготовления и дальнейшей пропитки водным р а с т индикаторных полос для определения вором, содержащим желатину и ферменглюкозп в крови, предусматривающему нанесение на полимерную подложку ин- 5 ты. После высушивания индикаторная бумага н а к л е и в а е т с я на упругую п о д дикаторного слоя, включающего впитыложку с помощью двухсторонней л и п вающую целлюлозную основу, глюкозооксидазу, пероксидазу, хромогенный кой ленты и р а з р е з а е т с я д о нужных реагент - о-толидин, с последующей размеров. сушкой или отверждением слоя и на'О Если модифицированную б у м а г у , с о резкой, в качестве впитывающей целлюдержащую карбоксильные группы, п р и лозной основы используют модифицироменяют в виде порошка с определенным ванную катионообменную целлюлозу, размером частиц^ такой порошок п р о которую перед нанесением на подложку питывается неводным р а с т в о р о м хромопервоначально пропитывают спиртовым 15 г е н н о г о реагента,, после удаления раствором о-толидина, а затем вводят растворителя приготавливается паста в контакт со смесью растворов укаиз р а с т в о р о в ферментов, желатины и занных ферментов и желатины. носителя (порошок модифицированной целлюлозы» пропитанной хромогенным Модифицированную катгюнообменную целлюлозу обычно используют в виде 20 р е а г е н т о м ) . Паста тщательно п е р е бумажной ленты или порошка. мешивается и ч е р е з фильеру н а н о с и т ся на полимерную о с н о в у , п о с л е ч е г о В качестве указанной целлюлозы обычно исппльЗуют карбоксиметилцелсушится. Далее нарезаются полоски люлозу или фосфат-целлюлозу, нужных р а з м е р о в . С целью повышения качества полу- 25 Глюкозооксидаза, выделяемая и з чаемых индикаторных полос и увелиштамма P e n i c i l l i u m v i t a l e P i d o p l . чения сроков их использования* испольet B i l a i , выгодно отличается от друзупт ггаокозооксидазу PenicU H u m viгих видов тем, что специфическая tale Pidopl.et Bilai, активность данного фермента проявляУпрощение способа достигается в з ется в широком интервале рН (рН 5-8) первую очередь за счет создания двухпричем максимум активности находится фазной композиции в индикаторном в области физиологического рН крови. слое, что позволяет сократить число Кроме того t глюкозооксидаза P e n i c i l технологических операции» исключив lium v i t a l e P i d o p l . e t B i l a i свободтакие как нанесение связующего слоя, па от примесей каталаэы, которая закрепление покровной сетки, эффек- 35 катализирует разложение пероксида тивное разделение компонентов смеси водорода и тем самым может мешать в индикаторном слое* определению глюкозы. Глюкозооксидаза P e n i c i l l i u m v i t a l e может храниться Получаемая двухфазная композиция длительное время без изменения акявляется достаточно стабильной и на40 тивности (табл. 1). дежной и в то же время обеспечивает определение глюкозы в цельной П р и м е р 1, Бумагу из карбоккрови. симетилцеллгалозы пропитывают 2%-ным Эффективное разделение компоненраствором о-толидина в этиловом спиртов индикаторного состава достигаетте, высушивают до полного удаления ся rt,M, что используется двухфазная растворителя и пропитывают раствогомп^зицпя. ром следующего состава: Глюкозооксидаза из Первая фаза представляет собой Pen.vitale 300 мл 0,5%-но- , катионообменную бумагу (например, 'лого раствора содержащую карбоксильные группы па поверхности), на которой посредством ионного обмена удерживается кромогениьш реагент» Вторая фаза представляет собой пленку желатины, покрывающую волокна бумаги, в беттко- 55 вую матрицу которой вклиечены молеку ЛЫ ферМеНТОП. ТеЗКОЯ ДИ(*)фУ)1МЯ ма попучается ҐПГТЄ путей прогін і кп молпфи Перокстщаза 100 мл 0»1%-ного раствора Желатина 500 мл 47,-иого раствора Вода Ди объема 1 л г После ттого пыо* тм1'іюі при комнатной теппсрнтуг"'* f а ірсзлпт ил ленты* г.оторыс иль т< плаю г и-) трнацо HS5944 татцеплюлознуто пленку с помощью двухсторонней липкой ленты и разрезают на полосы нужных размеров. П р и м е р 2. Измельченную карбоксиметилцелпкшозу пропитьгаают 1%-ным спиртовым раствором о-толидина в соотношении 1:3 по весу. Удаляют растворитель нагреванием смеси до 40-60 С при перемешивании. 10 Смешивают 150 мл 0,5%-ного раствора глюкозооксидази из Pen.vitale и 50 мл 0,1%-ноговодного раствора пероксидазы. К полученной смеси при перемешивании приливают 200 мл 4%~ 15 ного раствора желатины и добавляют 80 г порошка карбоксиметшщеллгочозы, пропитанной о-толидином. Смесь тщательно перемешивают и с помощью поливочной машины наносят на основу, 20 выполненную из триацетатной пленки. После сушки разрезают на полости нужныж размеров. П р и м е р 3. 80 г порошковой карбоксиметилцеллгалозы (фосфатцеллюлозы) пропитьгаают 120 мл 2%-ного спир-25 тового раствора о-толидина, перемешивают и добавляют 150 мл 0,5^-ного раствора глюкозооксидазы из Pen.vitale и 50 мл 0,1%-ного раствора пероксидазы в воде. К полученной 30 смеси при перемешивании приливают 200 мл 4%-ного водного раствора желатины, подогретого до 40 С. Смесь тщательно перемешивают и через фильеру наносят на основу, выполненную из триацетатной пл°нки. После сутки при 30-40 С в течение 4-6 ч разрезают на полоски нужных размеров. Индикаторные полоски, полученные по предлагаемым способам, могут быть применены для определения концентрации глюкозы в цельной крови в пределах концентраций 1-40 ммоль/л глюкозы. Испытания проводились на крови, содержащей различную концентрацию глюкозы по следующей методике. На индикаторную полосу наносили равномерным слоем кровь, выдерживали 60 с, кровь смывали струей дистиллированной 'чоды, затем полоску промакивали фильіровальной бумагой. Далее полоску помещали в измерительную камеру спектрофотометра С