Композиція вакцини та спосіб її одержання

1. Композиция вакцины, содержащая антиген и адъювант, отличающаяся тем, что в качестве антигена она содержит иммунологически эффективное количество поверхностного антигена гепатита В и ряд (n) других антигенов, при этом в качестве адъюванта она содержит одну или более солей алюминия, причем значение n составляет 1 или выше, а адъювант с адсорбированным на нем поверхностным антигеном гепатита В представляет собой фосфат алюминия при условии, что, когда n равно 1, то другой антиген представляет собой антиген, отличный от антигена против гепатита А. 2. Композиция вакцины по п.1, отличающаяся тем, что указанные другие антигены выбраны для обеспечения иммунитета против одного или более следующих заболеваний: дифтерии, столбняка, коклюша, полиомиелита, Haemophilus influenzae b, гепатита А, менингита А, менингита В, менингита С и отита. 3. Композиция вакцины по п.1 или 2, отличающаяся тем, что по меньшей мере один из указанных других антигенов адсорбирован на фосфате алюминия. 4. Композиция вакцины по п.1 или 2, отличающаяся тем, что по меньшей мере один из указанных других антигенов адсорбирован на гидроксиде алюминия. 5. Композиция вакцины по одному из пп.1 - 4, отличающаяся тем, что n равно 2, 3, 4, 5 или 6. 6. Композиция вакцины по п.5, отличающаяся тем, что указанные другие антигены обеспечивают иммунитет против дифтерии, столбняка и коклюша. 7. Композиция вакцины по п.6, отличающаяся тем, что коклюшный компонент представляет собой цельноклеточный коклюшный или бесклеточный коклюшный антиген. C2 (54) КОМПОЗИЦІЯ ВАКЦИНИ ТА СПОСІБ ЇЇ ОДЕРЖАННЯ 40596 17. Способ получения композиции вакцины по пп.1 - 16, включающий смешивание компонентов вакцины, отличающийся тем, что поверхностный антиген гепатита В, адсорбированный на фосфате алюминия, смешивают с другими антигенами, ад сорбированными на гидроксиде алюминия или фосфате алюминия. 18. Способ по п.17, отличающийся тем, что в вакцину вводят бесклеточный коклюшный компонент, включающий пертактин. _______________________ нии иммуногенных характеристик между моновалентной вакциной (Engerix B) содержащий адсорбированный на гидроокиси алюминия поверхностный антиген гепатита В, и моновалентной вакциной, имеющей в своем составе адсорбированный на фосфате алюминия тот же антиген. В Европейской патентной заявке за номером 0339667 описана бивалентная вакцина, содержащая поверхностный антиген гепатита В и гепатита А, в которой в качестве адъюванта используется гидроокись алюминия или фосфат алюминия. Казалось бы не существует конкретной оценки необходимости избегать использования гидроокиси алюминия в качестве адъюванта при приготовлении мультивалентной (многофункциональной) вакцины, включающей поверхностный антиген гепатита В. Более того ни в описании данной публикации, ни где-либо еще нет данных о бивалентной или мультивалентной вакцине гепатита В, в которой, по меньшей мере один антиген, но не антиген гепатита В (ПАГ "В"), адсорбируется на гидроокиси алюминия, а поверхностный антиген гепатита В адсорбируется на фосфате алюминия. И действительно до сих пор, по-видимому не было возможности описать стабильную и эффективную многовалентную вакцину, содержащую поверхностный антиген гепатита В. В одном из аспектов настоящего изобретения представляется комбинированный состав вакцины, содержащий поверхностный антиген гепатита В (ПАГ "В") и некоторое количество других антигенов в сочетании с адъювантом, включающим одну или несколько солей алюминия, в котором "n" представляет собой число 1 или более и в котором адъювант, используемый для адсорбции поверхностного антигена, не является гидроокисью алюминия, при условии что если "n" равняется одному, то другие антигены не являются антигенами против гепатита А. Предпочтительно, если "n" представляет собой целое число 2,3,4,5 или 6. Преимущество изобретения состоит в том, что не происходит существенного снижения иммуногенности ПАГ "В", что имеет место в комбинированных составах вакцин. Избегая использования гидроокиси алюминия для адсорбции компонента поверхностного антигена гепатита В в составах вакцин можно также придать продукту заметно более высокую стабильность. Другое преимущество изобретения состоит в том, что упомянутые выше проблемы, связанные с множеством инъекций, удается решить или, по крайней мере, значительно смягчить, обеспечив при этом высоко эффективный иммуногенный стабильный комбинированный состав. Представляемые изобретением составы практически приемлемы для введения детям. Настоящее изобретение касается новых составов вакцины, способов их получения и их использования для лечения. В частности, настоящее изобретение касается новых составов комбинированной вакцины, включающих компонент противовирусного гепатита В для лечения инфекций гепатита В. Инфекции, вызванные вирусом гепатита В, представляют собой весьма серьезную проблему, но вакцины, которые могут быть использованы для массовой иммунизации, уже существуют, например, вакцина типа Engerix (Смитклайн Бичам Байолоджикалс). Engerix B1 содержит в качестве антигенного компонента гепатита В поверхностный антиген гепатита В (ПАГ "В") получаемый в соответствии с методами генной инженерии. Однако в ряде случаев возникает необходимость или желание вводить вакцину гепатита В в одно время с другими вакцинами, и это может носить форму многократных инъекций. Проблемы, связанные с многократными инъекциями, влекут за собой более сложную процедуру введения лекарственного средства и большой общий объем инъекций. Поэтому возникла необходимость в комбинированной вакцине, включающей антиген гепатита В в сочетании с другими антигенами. Другие антигены, в частности, представляют собой антигены, способные в вакцинных составах предотвращать или предупреждать гепатит А (ГА), дифтерию (Д), столбняк (С), цельноклеточный коклюш (Кц), аклеточный коклюш (Ка) Hаеmophillus influenzае эпидемический грипп d (Гэ) и полио (П). При получении вакцин в качестве адъюванта широко используется гидроокись алюминия (ГА). Например, в вакцине типа Engerix B используется поверхностный антиген гепатита В, адсорбированный на гидроокиси алюминия. Успешным оказалось также использование гидроокиси алюминия при получении вакцины гепатита А, а также комбинированных вакцин (ДС), (ДСКц) и ДСКв. Однако было установлено, что при соединении адсорбированного на гидроокиси алюминия поверхностного антигена гепатита В с другими вакцинами в комбинированных составах происходит существенное снижение иммунной реакции на поверхностный антиген гепатита В, вследствие чего отмечается низкая или несущественная серозащита после вакцинации. Кроме того устойчивость компонента поверхностного антигена в комбинированных вакцинах невелика. Фосфат алюминия (ФА), адсорбирующий поверхностный антиген гепатита В, применяется для приготовления моновалентной вакцины (HEPPACI № Е) выпускаемой Korean Cheil Sugar Co. Ltd. и имеющейся на мировом рынке. Нам удалось установить, что нет существенной разницы в отноше 2 40596 Предпочтительно, если поверхностный антиген гепатита В адсорбируется на фосфате алюминия. В частности при клинических исследованиях людей было установлено, что поверхностный антиген гепатита В, адсорбированный на фосфате алюминия, при соединении с одним или несколькими антигенами, адсорбированными на гидроокиси или фосфате алюминия, в комбинированном составе вакцины не дает существенного снижения иммуногенных характеристик. К тому же устойчивость адсорбированного на фосфате алюминия поверхностного антигена гепатита В выше чем при адсорбции указанного антигена на гидроокиси алюминия. В соответствии с другим аспектом предмета изобретения представляется состав вакцины по пунктам изобретения, в котором, по меньшей мере один из антигенов, но не поверхностный антиген гепатита В, адсорбируется на фосфате алюминия. В другом предпочтительном варианте, что также входит в предмет изобретения, по меньшей мере, один из антигенов адсорбируется на гидроокиси алюминия. Кроме того настоящее изобретение представляет комбинированный состав вакцины, включающий поверхностный антиген гепатита В, адсорбированный на фосфате алюминия, и антигены, адсорбированные на фосфате алюминия или гидроокиси алюминия и выбранные из числа антигенов, обеспечивающих иммунитет против одного или более следующих вирусов, а именно: дифтерии, столбняка и коклюша, а также убитой поливакцины, эпидемического гриппа "б" и гепатита А. В составы вакцин, используемые в педиатрии, могут быть включены также другие совместимые антигены, например, антигены, известные с точки зрения своей эффективности против менингита В, менингита А и С, а также отитной среды. Используемый здесь термин "бивалентный" относится к составам вакцин, включающим комбинацию двух антигенов в общей сложности (в том числе поверхностного антигена гепатита В). Термин "мультивалентный" относится к составам вакцин, содержащим более двух антигенов, например, три, четыре или шесть антигенов. Значения терминов "фосфат алюминия" или "гидроокись алюминия", используемые здесь, включают все формы гидроокиси алюминия или фосфата алюминия,приемлемые для использования в вакцинах, содержащих адъюванты. Например, фосфат алюминия может представлять собой осадок нерастворимого фосфата алюминия (аморфного, полукристаллического или кристаллического), который модно, но необязательно, получать путем смешивания растворимых солей алюминия и солей фосфорной кислоты. "Гидроокись алюминия" может представлять собой осадок нерастворимой (аморфной, полукристаллической или кристаллической) гидроокиси алюминия, которую можно, но не обязательно, получать путем нейтрализации раствора солей алюминия. Практически приемлемыми можно считать различные формы гидроокиси алюминия или алюминий фосфатные гели, доступные из коммерческих источников, например, алгидрогель (гидроокись алюминия, 3% суспензия в воде) и адьюфос (фосфат алюминия, 2% суспензия в соляном раст воре), производимые фирмой Суперфос (Ведбек, 2950 Дания). Считается, что впервые мы способны представить стабильную и эффективную мультивалентную вакцину, включающую поверхностный антиген гепатита В. В соответствии с еще одним предметом изобретения представляется стабильный и эффективный состав вакцины, направленный на предупреждение более двух заболеваний, включая поверхностный антиген гепатита В и, по меньшей мере, два других антигена. Что касается выбора адъюванта, то наилучшие результаты были получены в том случае, когда поверхностный антиген гепатита В был адсорбирован на фосфате алюминия и, по меньшей мере, один из антигенов, но не ПАГ "В", был адсорбирован на гидроокиси алюминия. Однако допускается использование и других приемлемых адъювантов. Например, один из антигенов, но не ПАГ "В", может быть адсорбирован на фосфате алюминия. Предпочтительными устойчивыми комбинациями вакцин по изобретению являются вакцины, содержащие противоинфекционные компоненты: дифтерии-столбняка-коклюша-гепатита В, дифтерии-столбняка-гепатита В, дифтерии-столбняка-коклюша - убитой инактивированной поливакцины - гепатита В. Установлено, что для вакцины, содержащей компонент противоэпидемического гриппа, соответствующий антиген можно использовать для немедленного приема при приготовлении вакцины непосредственно перед введением. Таким образом можно приготовить следующие комбинированные составы вакцин в рамках предмета изобретения, например: Эпидемический грипп-вирус в, – гепатит В Дифтерия-столбняк-коклюш-эпидемический грипп б-гепатит В. Инактивированная убитая поливакцинадифтерия-столбняк-коклюш-грипп, вирус в-гепатит В. Более специфические виды вакцин в рамках предмета изобретения, в частности, представляют собой вакцины, содержащие компоненты дифтерии-столбняка-коклюша /адсорбированных на гидроокиси алюминия или фосфате алюминия/ - гепатита В (поверхностного антигена гепатита В, адсорбированного на фосфате алюминия), дифтерии-столбняка (адсорбированных на фосфате или гидроокиси алюминия гепатита В (поверхностного антигена, адсорбированного на фосфате алюминия). Под термином "стабильные" вакцины, используемым здесь, следует понимать в соответствии с предметом изобретения вакцины, которые можно хранить при 37оС в течение одной недели без сколько-нибудь существенного снижения иммуногенности компонента поверхностного антигена гепатита В. Под термином "эффективные вакцины", используемым здесь, имеются ввиду составы вакцин, отличающиеся тем, что иммуногенность поверхностного антигена гепатита В в комбинированных составах вакцин такова, что средний геометрический титр составляет, по меньшей мере, 3 40596 200 мМЕ, предпочтительно 300 мМЕ или более, как было установлено на примере детей через месяц после введения третьей дозы вакцины при вакцинировании по соответствующему плану с введением вакцины с интервалом в один месяц. Кроме того в настоящем изобретении представляется мультивалентная вакцина, содержащая поверхностный антиген гепатита В и стабилизирующий адъювант, выбранный из числа таких адъювантов, которые обеспечивают хранение вакцины в течение недели при 37оС без сколько-нибудь существенного изменения или снижения иммуногенности компонента ПАГ "В". Предпочтительный вариант мультивалентной вакцины характеризуется кроме того повышением значения среднего геометрического титра до 200 мМЕ (через месяц после введения третьей дозы), предпочтительно 300 мМЕ и более при вакцинировании детей с интервалом в один месяц по соответствующему плану вакцинации. Используемый здесь термин "соответствующий план вакцинации" подразумевает план, известный каждому специалисту по проведению курса вакцинирования, особенно педиатрических доз. Используется, например, план, рассчитанный на 3,4 и 5 месяцев. Это, в частности, соответствует, например, комбинированному составу ДСКПАГ"В", представляющему собой вакцину в соответствии с предметом изобретения. В одном из аспектов изобретения представлено, что ПАГ "В" может быть адсорбирован на соли алюминия, но не на гидроокиси алюминия. В предпочтительном варианте изобретения для адсорбции используется фосфат алюминия. Другие антигены в мультивалентной вакцине могут быть адсорбированы на фосфате алюминия или гидроокиси алюминия (или на том и другом), причем более перспективной считается адсорбция на гидроокиси алюминия, как показано в примерах, приведенных ниже. Благоприятным считается вариант, когда представляемая изобретением вакцина содержит компонент противококлюшевой направленности. Приемлемым является цельноклеточный коклюшевый компонент, а также аклеточный компонент вакцины, содержащий частично или высокоочищенный антиген. Указанные выше комбинации необязательно могут включать компонент, предупреждающий гепатит А, например В"А" - антиген. Предпочтительно, если содержащий антиген В состав вакцины представляет собой педиатрическую вакцину. Получение антигенов и методика адсорбции на адъювантах хорошо известны специалистам и представлены в примерах, приведенных ниже. Получение поверхностного антигена гепатита В (ПАГ"В") изложено в целом ряде публикаций. См., например, Harford и сотр., (1983) в Develop. Biol. Standard, 54, cтр. 125, Cregg и сотр. (1987) в Biotechnology, 5, стр. 479, ЕР А-0226 846, ЕР А0299 108 и соответствующие ссылки. Используемый здесь термин "поверхностный антиген гепатита В" или ПАГ "В" включает любые антигены поверхностного характера гепатита В или их фрагменты, проявляющие антигенность поверхностного антигена гепатита В. Понятно, что в дополнение к 226 аминокислотной последовательности ПАГ "В" S(см. Tiollaіs и сотр. Nature, 317, 489 (1985) и ссылки к указанной публикации) описываемый здесь ПАГ "В" может содержать, по желанию, целую или часть пред-S-последовательности, как указано в приведенных выше ссылках и ЕР-А-0 278940. В частности, ПАГ "В" может содержать полипептиды, включающие аминокислотный ряд, в том числе остатки 12–52, за которым следуют остатки 133–145 и далее 175–400 L-протеина ПАГ "В", относящегося к открытому остову на вирусе гепатита В серологического типа (этот полипептид упоминается как L+, см. ЕР 0414374). Поверхностный антиген гепатита В в пределах предмета изобретения может включать также пре S1пре S2-S-полипептид, описанный в ЕР 0198 474 (Эндотроникс) или его аналоги, такие как описаны в ЕР 0 304 578 (Mc Cormick и Jones). Описанный здесь поверхностный антиген гепатита В может относиться также к мутантам, например, таким "ускользающий" мутант, описанный в WO 91/14703 или Европейской патентной заявке № 0511 855 А1, особенно поверхностный антиген гепатита В, в котором аминокислотное замещение в положении 145 проходит от глицина к аргинину. Обычно ПАГ "В" имеет форму частиц. Частицы могут включать, например, S-протеин один или в виде состава частиц, например, (L, *S), где L* имеет указанные выше значения, S представляет собой S-протеин поверхностного антигена гепатита В. Указанные частицы предпочтительны в форме, в которой они проявляются в дрожжах. Антигены, приемлемые для использования в представляемых в изобретении вакцинах, обычно имеются в продаже и, в частности, могут быть получены из фондов Всемирной организации здравоохранения. Например, компонент инактивированной убитой поливакцины представляет собой инактивированную Солком поливакцину. Противококлюшевая вакцина может включать цельноклеточный продукт, аклеточный продукт или продукт рекомбинации. В частности, противококлюшевый компонент может представлять собой токсины коклюша или его фракции, филаментный гемагглютинин, агглютиногены (фимбриальные) и поверхностные мембранные белки, в том числе 69 кДапротеин (пертактин, не фимбриальный агглютиноген). Ссылки: A. Robinson, L.I. Irons и A.E. Ashworth 3, 1985, 11–22 и H.J. Brennan, S.M. Cowell, M.E. Bishen, A.C. Steven, A.C. Novothy, C.R. Manclarck, Infection and Immunity, 56, 1988, 3189–3195. Предпочтительно, если компонент, обеспечивающий предупреждение от гепатита А представляет собой продукт, известный под названием "Хаврикс" (Смитклайн Бичам Байолоджикалс), являющийся убитой разбавленной вакциной, полученной из НМ-175-штамма вируса гепатита А (см. Inactivated Candidate Vaccines for Hepatitus А, F.E. Andre, A. Hepburn и E.D. Hondt (1980), Prog. Med. Virol. т. 37, стр. 72–95 и монографию "Havrix", опубликованную Смиткляйн Бичам Байолоджикалс (1991). Fleming и сотр. (см. там же, стр. 56–71) рассмотрели клинические аспекты, вирологию, иммунологию и эпидемиологию гепатита А и обсудили подходы к разработке вакцин против обычной вирусной инфекции. 4 40596 Используемое здесь выражение "антиген гепатита А" относится к любым антигенам, способным стимулировать нейтрализацию антител по отношению к гепатиту вируса А у человека. Предпочтительно, если ВГА-антитела содержит инактивированные разбавленные частицы вируса или представляют собой, например, ВГА-капсид или ВГА-виральный протеин, которые обычно можно получить путем рекомбинантной биотехнологии ДНК. Вакцинные составы традиционно описываются в New Trend and Develoрments in Vaccines (1978), издаваемых Voller'om и сотр. Юниверсити Парк Пресс, Балтимор, Мериленд, США. Количество антигена в каждой дозе вакцины выбирают как количество, вызывающее иммунозащитную реакцию без значительных вредных побочных явлений в типовых вакцинах. Такие количества могут быть очень различными в зависимости от того, какие специфические иммуногены рекомендуются в том или ином случае. Обычно предполагается, что каждая такая доза содержит 1– 1000 мкг общего иммуногена, предпочтительно 2– 100 мкг, более предпочтительно 1–40 мкг, особенно предпочтительно 1–5 мкг. Оптимальное количество конкретной вакцины может быть установлено в ходе стандартных исследований, включающих наблюдение за титрами антител и контроль других реакций у пациента. Курс первичной вакцинации может включать 2–3 дозы вакцины, вводимые с перерывом в один-два месяца, в соответствии с рекомендациями Всемирной организации здравоохранения для иммунизации ДСК. Настоящее изобретение представляет также собой предупреждения гепатита В и других инфекций у человека, особенно у детей. Указанный метод состоит в лечении человека, нуждающегося в подобном лечении, иммунологически эффективной дозой, вакцины по любому из пунктов изобретения, описанных выше. Далее настоящее изобретение представляет состав вакцины, в соответствии с пунктами изобретения, используемый в целях лечения. Изобретение представляет также использование поверхностного антигена гепатита В для получения комбинированной вакцины в соответствии с изобретением для профилактики инфекций гепатита В. Кроме того изобретение касается применения фосфата алюминия, используемого в качестве стабилизатора и/или поддержания эффективности ПАГ "В" в мультивалентной вакцине по п.п. изобретения. В частности, изобретение представляет использование фосфата алюминия с целью получения стабильной комбинированной вакцины, содержащей ПАГ "В" и, по меньшей мере, один другой антиген (предпочтительно, однако два других антигена), в силу чего устойчивость и/или иммуногенность компонента поверхностного антигена гепатита В становится выше, чем в соответствующей комбинированной вакцине, где указанный компонент адсорбируется на окиси алюминия. без существенного снижения иммуногенных характеристик поверхностного антигена гепатита В. Представляется также использование, в силу которого среднегеометрические титры составляют более 200, предпочтительно более 300 мМЕ/м, через месяц после введения третьей дозы, являющей заключительной в курсе вакцинации проводимого по соответствующему плану вакцинации детей. Кроме того настоящее изобретение представляет способ получения комбинированной (например, бивалентной или мультивалентной) вакцины, эффективной для предупреждения гепатита В, иллюстрируемый примерами настоящего изобретения, приведенными ниже. В предпочтительном варианте все антигены, но не поверхностный антиген гепатита В, адсорбируется на гидроокиси алюминия. Таким способом можно, например, приготовить очень эффективную вакцину ДСКа-гепатит В. Обычно комбинированные составы вакцин по любому из пунктов представляемого изобретения можно получить по описанному ниже способу. Желаемые компоненты ДС, ДСКц, ДСКа и другие адсорбируют на подходящих адъювантах, особенно окиси алюминия или фосфата алюминия. ПАГ "В" адсорбируют на подходящем стабилизирующем адъюванте, выбранном из числа, описанных выше, в частности на соли алюминия, но не гидроокиси алюминия. Предпочтительно использовать для адсорбции фосфат алюминия. После того как произойдет полная и устойчивая адсорбция соответствующих компонентов, производят соединение различных компонентов, соблюдая при этом необходимые условия. Установлено, что некоторые компоненты, например ДС, ДСК в двух вариантах, можно соединять отдельно до добавления адсорбированного компонента ПАГ"В". Аналогичным способом можно готовить мультивалентные вакцины, включающие ПАГ "В" и другие дополнительные антигены, указываемые выше. В предпочтительном аспекте представляется способ получения комбинированных составов вакцин по изобретению; способ включает смешивание фосфата алюминия с адсорбированным на нем поверхностным антигеном гепатита В с одной или более гидроокисью алюминия или фосфатом алюминия с адсорбированными на них антигенами. Приведенные ниже примеры иллюстрируют предмет изобретения. Примеры 1–5. Составы. В соответствии с представленным ниже описанием были получены конкретные составы по изобретению. Пример 1. Адсорбция поверхностного антигена на АІРО4 как концентрат для приготовления комбинированных вакцин. Суспензию фосфата алюминия, содержащую 0,03–0,3 г алюминия (в виде фосфата алюминия) в изотоническом соляном растворе смешивают с концентратом поверхностного антигена гепатита В, содержащим 10 мг протеина ПАГ "В", в конечном объеме 10–100 мл. После установления рН на уровне 5–6,5 смесь выдерживают при ком Более конкретно изобретение представляет использование указанных компонентов, позволяющих хранить вакцину при 37оС в течение недели 5 40596 натной температуре при перемешивании в течение 10–24 часов. После этого необязательно добавляют антисептик (например, мертиолат, 1:20,000 до 1:10,000 или 2-феноксиэтанол, от 3 до 6 мг/мл) и доводят объем до 50 мл, используя для этой цели изотонический соляной раствор. Пример 2. Состав комбинированной вакцины, содержащий компоненты дифтерии-столбняка-гепатипа В. Концентрат, содержащий 25,000 Lf токсоида дифтерии и 10,000 Lf токсоида столбняка, адсорбированных на 0,35 г алюминия (в виде гидроокиси или фосфата алюминия), получают в конечном объеме 0,15 л изотонического солевого раствора и устанавливают значение рН в пределах 6–7 в соответствии с нормами В03 для ДС и ДСК-вакцин. Концентрат соединяют с 0,05 л концентрата гепатита В из примера 1. Смесь доводят до конечного объема 0,5 л с помощью изотонического соляного раствора. В образовавшуюся смесь можно, но необязательно добавить антисептик (антисептическую среду) (например, мертиолат 1:20,000 до 0:10,000 или 2феноксиэтанол, 3–6 мг/мл). Конечное значение рН поддерживают на уровне 6–7 по нормам В0З для ДС- и ДСК-вакцин. Одна 0,5 мл доза пузырька вакцины содержит в качестве активных ингредиентов: Д токсоид 25 Lf (ед.) Т токсоид 10 Lf (ед.) ПАГ"В" 10 мкг протеина LF – единица флокуляции (количество токсина, которое быстрее всего флокулирует с одной антитоксической единицей лошадиной сыворотки). Методику можно изменить при использовании более высоких или более низких количеств активных ингредиентов. Пример 3. Состав комбинированной вакцины, содержащий компоненты дифтерии-столбняка-коклюша (цельноклеточный вариант)-гепатита В. Концентрат ex Behringwerke, содержащий 7,500 Lf токсоида дифтерии и 3,250 Lf (ед.) токсоида столбняка и 15,000 единиц антигена коклюша b, адсорбированных на 0,45 мг алюминия (в виде гидроокиси или фосфата алюминия) получают в конечном объеме 0,4 л изотонического соляного раствора и устанавливают значение рН на уровне 6–7 в соответствии с нормами Всемирной Организации здравоохранения для ДСК-вакцин. Концентрат соединяют с 0,05 л концентрата гепатита В из примера 1. При использовании изотонического соляного раствора смесь доводят до конечного объема 0,5 л. Необязательно, но возможно добавление антисептической среды (например, мертиолата 1:20,000 до 0:10,000 или 2-феноксиэтанола, 3–6 мг/мл). Конечное значение рН составляет между 6 и 7 в соответствии с нормами В0З для ДС- и ДСК-вакцин. Одна 0,5 мл доза этого пузырька вакцины содержит в качестве активных ингредиентов: Д токсоид 7,5 С токсоид 3,25 Кц-антиген 15 ПАГ "В" 10 мкг протеина Методику получения можно изменить, используя более высокие или более низкие количества активных ингредиентов. Пример 4. Состав комбинированной вакцины, содержащий компоненты дифтерии-столбняка-коклюша (аклеточный вариант). Концентрат, содержащий 25,000 Lf (ед.) токсоида дифтерии и 10,000 Lf столбняка, адсорбированных на 0,35 г алюминия (в виде гидроокиси или фосфата алюминия (гель)), получают в конечном объеме 0,15 л изотонического соляного раствора и устанавливают значение рН между 6 и 7 в соответствии с нормами В0З для ДСК-вакцин. Добавляют 25 мг инактивированного токсина коклюша (ДСКа), 25 мг филаментного гемагглютинина и необязательно 8 мг 69 кДа внешнего оболочкового протеина (пертактин), каждый из которых соединен с 0,05 г Al (в виде гидроокиси алюминия или фосфата алюминия). B. pertussis антигены коклюша, филаментного гемагглютинина пертактина можно получать в соответствии с методиками, известными каждому специалисту, например, методиками, описанными в Европейской патентной заявке 427,462 и WO 91/12020 или других методики, дающих физиологически приемлемые и активные антигены В коклюша. С помощью изотонического соляного раствора смесь доводят до конечного объема 0,5 л. Можно, но не обязательно, добавлять антисептические среды (например, мертиолат 1:20,000 до 0:10,000 или 2-феноксиэтанол, 3–6 мг/мл). Конечное значение рН раствора составляет между 6 и 7 в соответствии с нормами В0З для ДС- и ДСК-вакцин. Одна 0,5 мл доза такого пузырька вакцины содержит в качестве активных ингредиентов: Д токсоид 25 Lf (ед.) С токсоид 10 Lf (ед.) ДС токсоид 25 мкг Токсоид филаментного гемагглютинина 25 мкг 69 кДа ОМР 8 мкг (необязательно). Методику можно изменить, используя более высокие или более низкие количества активных ингредиентов. Пример 5. Состав комбинированной вакцины, содержащей компоненты дифтерии-столбняка-коклюша (внеклеточный вариант)-гепатита В. Используют методику примера 4, за исключением того, что вводят дополнительно 50 мл адсорбированного ПАГ "В"-концентрата из примера 1. Полученную смесь доводят до конечного объема 0,5 л, используя для этой цели изотонический соляной раствор. Возможно, но не обязательно добавление антисептической среды (например, мертиолата 1:20,000 до 0:10,000 или 2феноксиэтанола, 3–6 мг/мл). Конечное значение рН устанавливают между 6 и 7 в соответствии с нормами В0З для ДС- и ДСК-вакцин. Одна 0,5 мл доза пузырька вакцины содержит в качестве активных ингредиентов: Д токсоид 25 Lf (ед.) С токсоид 10 Lf (ед.) КС токсоид 25 мкг Токсоид филаментного гемагглютинина 25 мкг 69 кДа ОМР 8 мкг (необязательно). 6 40596 Методику можно изменить в случае использования более высоких или более низких дозовых количеств активных ингредиентов. Примеры 6–10. Исследования на животных и добровольцах. Пример 6. Состав комбинированных вакцин, содержащих компонент гепатита А и гепатита В. По аналогии с примером 1 концентрат инактивированного вируса гепатита А (460,000 единиц, твердофазный иммуноферментный анализ), адсорбированный на 0,02 до 0,2 г, предпочтительно 0,04–0,1 г алюминия (в виде гидроокиси алюминия) в конечной концентрации до около 125 мл соединяют с 50 мл концентрата, содержащего 10 мг поверхностного антигена гепатита В, адсорбированного на фосфате алюминия. Полученную смесь разбавляют изотоническим соляным раствором и концентратом аминокислот (Тревазол, Векстер-Тревинол Инк.), получая конечный объем 0,5 л, содержащий 1,5 г аминокислот. Значение рН в полученном составе составляет между 6 и 7. Одна 1 мл доза такого пузырька вакцины содержит в качестве активных ингредиентов: Антиген вируса гепатита А 800 ед. (твердофазный иммуноферментный анализ) ПАГ "В" 20 мкг протеина Методику можно изменить, используя более высокие или более низкие количества активных ингредиентов. Результаты. Клинические исследования по сравнению активности поверхностного антигена гепатита В адсорбированного на гидроокиси и фосфате алюминия (моновалентная вакцина). Имеющим на начальном этапе сероотрицательную реакцию здоровым взрослым людям-добровольцам вводят 3 дозы по 20 мкг поверхностного антигена гепатита В с интервалом в один месяц. Определяют уровни антител в сыворотке после введения второй и третьей дозы, используя для этой цели тест Ausab'a Эббота. Определяют реакции для добровольцев со значениями титров значительно выше основного. Данные титров выражают в мМЕ/мл. Результаты представляют собой среднегеометрические титры в мМЕ/мл. Пример 7. Тесты на иммуногенность для мышей и результаты исследования возрастающей устойчивости комбинированных вакцин, включающих поверхностный антиген гепатита В на гидроокиси алюминия или фосфате алюминия в качестве адъюванта. Группам из 10 мышей 0F1 вводили подкожно 2 дозы по 2,5 мкг ПАГ "В" (одного компонента или в комбинации с другими) в дни 0 и 14. На 21 день отбирали кровь и титровали на анти-ПАГ "В", используя тест Эббота (Ausab). Количество реагирующих животных определяли как количество животных с уровнем антител, значительно более высоким, чем основные значения, приведенные выше. Рассчитывали также средний геометрический титр. Результаты, полученные для ДС-ГВ, ДСКцГВ, ДСКа-ГВ показывают, что ПАГ "В", адсорбиро ванный на фосфате алюминия значительно лучше, чем ПАГ "В", адсорбированный на окиси алюминия, как в отношении реакции животных, так и среднегеометрических титров. Реакция на ПАГ "В", адсорбированный на фосфате алюминия в комбинированном составе, сравнима с реакцией на введение моновалентной вакцины ПАГ"В". Пример 8. Иммуногенность ПАГ"В" в комбинации с ДСКц-компонентом в опытах на обезьянах. Результаты для антигенов, адсорбированных на гидроокиси алюминия (AF1) и фосфате алюминия. Обезьянам отряда Cerсopithenus' aethiops вводят две инъекции по 10 мкг ПАГ "В" (одного или комбинации) в дни 0 и 30. На 30–57 день производят отбор сыворотки и титруют (Авсеб, Эббот) на анти-ПАГ "В" животных с уровнем антител значительно выше основного (сыворотка перед вакцинацией) рассматривают как респондентов. Рассчитывают средние геометрические титры в мМЕ/мл. Полученные результаты показывают, что ПАГ "В", адсорбированный на гидроокиси алюминия, значительно лучше, чем ПАГ "В" адсорбированный на гидроокиси алюминия. Реакция сравнима с соответствующей реакцией, имеющей место при введении моновалентной вакцины ПАГ "В". Пример 9. Клинические исследования с комбинированными вакцинами, содержащими ПАГ "В", адсорбированный на гидроокиси алюминия и фосфате алюминия. Добровольцам вводят 3 дозы по 0,5 мл вакцины, содержащей компонент ДСКц и компонент протеина ПАГ "В" в течение 3,4 и 5 месяцев. На 6 месяц отбирают кровь и сыворотку крови титруют, используя тест Ausab'a. Процент респондентов распространяется на субъектов (сероконверсия) с уровнем антител значительно выше описанного основного уровня. Процент предупреждения распространяется на субъектов с титрами, равными или выше 10 мМЕ/мл. Значения среднегеометрического титра даются в мМЕ/мл. Результаты, полученные для ДСКц, показывают, что ПАГ "В" адсорбированный на фосфате алюминия, дает более хорошую реакцию в сравнении с ПАГ "В", адсорбированным на гидроокиси алюминия. Степень сероконверсии и среднегеометрический титр сравнимы с соответствующими данными, полученными при введении моновалентной вакцины ПАГ "В" (Engerix B). Пример 10. Иммуногенность и устойчивость ПАГ "В", адсорбированного на гидроокиси алюминия или фосфате алюминия в комбинированной вакцине, содержащей компоненты гепатита А и гепатита В. Группам из 10 мышей 0F1 вводят подкожно 2 дозы 2,5 мкг ПАГ "В" (одного или в комбинации) в дни 0 и 14. На 21 день производят отбор крови и титруют на анти-ПАГ "В" по аналогии с примером 7. Результаты, полученные для иммуногенности и устойчивость комбинированного состава ГАГВ, показывают, что ПАГ "В", адсорбированный на ФА дает более высокий уровень антител и обеспечивает более устойчивую форму. Пример 11. Дальнейшие клинические исследования на добровольцах. 7 40596 1. Иммуногенность вакцины ДСКц-гепатита В для детей. Эксперимент А. Исследования, проводимые в Словакии: План 3-4-5 месяцев 10 мкг ПАГ "В", ДСКц ех Берингверке (ДС на ГА, Кц на смеси ГА и ФО). В этом и других примерах Post II обозначает – "после второй дозы" и post III – соответственно "после третьей дозы". Среднегеометрические титры всегда измеряют через месяц после инъекции по соответствующему плану. SP обозначает степень сероконверсии. Титры для дифтерии-столбняка-коклюша В. Эксперимент В. Исследования, проводимые в Греции: План вакцинации 2–4-месяцев (та же самая вакцина, что и в примере А). Титры для анти-ПАГ "В" (предварительные результаты). Эксперимент С. Исследования, проводимые в Словакии: План вакцинаций 3-4-5 месяцев (ПАГ "В" = 5 мкг на фосфате алюминия, ДСК ех Берингверке те же, что и в примере А). Титры анти-Г "В". Эксперимент Д. Исследования, проводимые в Словакии: план вакцинации 3-4-5 месяцев (ПАГ "В" = 10 мкг на фосфате алюминия, ДСКц Берингверке, та же, что и в примере А). Титры анти Г "В" Антидифтерийные антитела. Противостолбнячные антитела. Противококлюшевые антитела. 2. Иммуногенность ДСКа-гепатит В-содержащих вакцин для детей. Исследования, проводимые Турции. ПАГ"В" = 10 мкг на фосфате алюминия. ДСК (аклеточный) на гидроокиси алюминия. Предварительные результаты. Группа 1 (ДСКа-Engerix B в комбинированном составе). Группа 2. (ДСКа плюс Engerix B, в отдельные одновременные инъекции). Ключ: N – количество исследуемых добровольцев, S + = количество добровольцев, имевших сероположительную реакцию в момент отбора пробы крови), % = степень сероконверсии и GMT = серосреднегеометрический титр антител у субъектов с сероконверсией. Тираж 50 екз. Відкрите акціонерне товариство «Патент» Україна, 88000, м. Ужгород, вул. Гагаріна, 101 (03122) 3 – 72 – 89 (03122) 2 – 57 – 03 8