Спосіб діагностики шизофренії, пара праймерів для використання в способі, набір для визначення алелі er

1 Спосіб діагностики шизофренії, який відрізняється тим, що визначають in vitro наявність алелі Ер мікросателіта HUMTH01 в гені ТН 2 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що дозволяє виявити генетичні маркери шизофренії 3 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що дозволяє виявити схильність до шизофренії 4 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що визначення алелі Ер здійснюють шляхом секвенування та/або шляхом розділення на гелі та/або шляхом SSCP 5 Спосіб за п 4, який відрізняється тим, що алель Ер визначають шляхом розділення на гелі 6 Спосіб за будь-яким з пп 3-5, який відрізняється тим, що визначення здійснюють, використовуючи ДНК, одержану від пацієнта 7 Спосіб за п 6, який відрізняється тим, що ДНК отримують із мононуклеарних клітин 8 Спосіб за п 6 або п 7, який відрізняється тим, що ДНК перед визначенням ампліфікують 9 Спосіб за п 6, який відрізняється тим, що ампліфікована ДНК включає повний або частину першого інтрону гена ТН 10 Спосіб за п 9, який відрізняється тим, що ампліфікована ДНК являє собою фрагмент розміром до 300 пар основ, який включає мікросателіт HUMTH01 та фланкуючі ПОСЛІДОВНОСТІ 11 Спосіб за п 9, який відрізняється тим, що ампліфікована ДНК являє собою фрагмент розміром до 200 пар основ і переважно до 160 пар основ 12 Пара праймерів для використання в способі за п 9, яка відрізняється тим, що призначена для ампліфікації фрагмента величиною до 200 пар основ, який включає принаймні один мікросателіт HUMTH01 та фланкуючий район 13 Пара праймерів за п 12, яка відрізняється тим, що праймери мають довжину від 10-мера до 40-мера, переважно від 15-мера до 30-мера 14 Пара праймерів за п 13, яка відрізняється тим, що вона вибирається з групи А 1) 5'GGC ААА TAG GGG GCA ААА З' (SEQ ID N1), 2) 5' ТТА ТСС AGC CTG GCC CAG З' (SEQ ID N2), групи Б 3) 5' GGC ААА TAG GGG GCA ААА З' (SEQ ID N3), 4) 5' GGC TTC CGA GTG CAG GTC 3' (SEQ ID N4), групи В 5) 5' GTT CCT CCC ТТА ТТТ ССС З' (SEQ ID N5), 6) 5' AGG GAA CAC AGA СТС CAT З' (SEQ ID N6) 15 Набір для визначення алелі Ер мікросателіта HUMTH01, який відрізняється тим, що включає пару праймерів за п 12 16 Набір за п 15, який відрізняється тим, що його використовують для діагностики шизофренії Цей винахід відноситься до методу діагностики шизофренії Більш конкретно, він відноситься до способу визначення змін в одній з послідовнос тей, які повторюються, ДНК, яка знаходиться в гені ТН, деякі форми яких специфічно з'являються у пацієнтів, хворих на шизофренію Винахід також (21)97105318 (22)29 04 1996 (24)15 10 2002 (46) 15 11 2000, Бюл № 6, 2000 р (86) PCT/FR96/00650, 29 04 1996 (31)95/05264 (32)03 05 1995 (33) FR О 00 49827 відноситься до праимерів, які використовуються для визначення специфічних алелей цієї ПОСЛІДОВНОСТІ, яка повторюється, пов'язаних з шизофренією Наявність мутацій у всіх класах послідовностей ДНК, які повторюються, представляє собою відоме явище Однак, функціональне значення цих мутацій є невизначеним Так, мікросателіти представляють собою багаточисленний клас послідовностей ДНК що повторюються та володіють високим поліморфізмом, пов'язаним зі змінами в КІЛЬКОСТІ ланок, що повторюються (посилання 1) та/або в ПОСЛІДОВНОСТІ цих ланок В зв'язку з цим ці мікросателіти використовують в якості генетичних маркерів для конструювання генетичних карт та для ідентифікації локусів, які приймають участь в патолопях (посилання 2) Величина різних алелей мікросателітів залежить від змін в КІЛЬКОСТІ повторюваних ланок Експерименти по секвенуванню димерів, які повторюються, та в їх ПОСЛІДОВНОСТІ ЦІ ЗМІНИ можуть особливо відповідати "повним" повторенням, тобто без переривання ПОСЛІДОВНОСТІ основ, або "неповним" повторенням, яке включає одно або декілька переривань в ПОСЛІДОВНОСТІ ланок, коли мова йде про делецію (делеціях) або інсерцію (інсерціях) (посилання 3) Таким же чином в повторюваних тримерних або тетрамерних ланках, що повторюються, спостерігають зміни довжини та/або ПОСЛІДОВНОСТІ Так, зміни цього типу спостерігають в мікросателітах HUMHPRTB (посилання 4) та HUMTHO1 (посилання 5) двох більш довгих, які відрізняються однією парою основ Секвенування цих різних алелей дозволяє показати, що ланка мікросателіта HUMTHO1, яка повторюється, ПОСЛІДОВНІСТЬ ТСАТ, повністю повторюється в алелях А, В, С та D, які містять, ВІДПОВІДНО, 6, 7, 8 та 9 ланок, які повторюються Замість цього, алель Е, який містить 10 ланок, які повторюються, в більшості випадків має одну і ту ж делецію тімідину в пиятій ланці, яка повторюється Ця делеція приводить до неповного апеля з ПОСЛІДОВНІСТЮ (ТСАТ)4 (CAT) (TCATJs, який позначається як Еі (у значенні неповний) Алель Еі являє собою алель, який досить часто зустрічається у жителів Кавказу (посилка 5) Навпаки, повний алель Е з ПОСЛІДОВНІСТЮ (ТСАТ)-іо (позначають як Ер) досить рідко зустрічається Так, в випадку сукупності досліджуваної популяції хворих на шизофренію, тільки 5 пацієнтів мали повний алель Отримані результати несподівано показують, що всі суб'єкти, які володіли апелем Ер, являються пацієнтами, хворими на шизофренію, тоді як цей алель відсутній у 145 здорових людей, які були в якості контролю (дав таблицю 1) Ці результати демонструють в більшому ступені значний зв'язок між наявністю алеля Ер та шизофренією Крім того, 5 пацієнтів з шизофренією, які мають алель Ер, представляють собою одиничні випадки шизофренії, КЛІНІЧНИМ підтипом яких є параноідна шизофренія в одному випадку, недиференційна шизофренія в трьох випадках та дезорганізована шизофренія в одному випадку Більш конкретно, заявник займався пошуком генетичних змін, пов'язаних з шизофренією 3 цією метою замовник досліджував зв'язок між геном тірозинпдросилази (ТН) та шизофренією, орієнтуючись переважно на мікросателіт HUMTHO1 ТН являє собою фермент, який обмежує спосіб біосинтезу катехоламшів Були проведені різноманітні генетичні дослідження психічних та неврологічних патолопй при використанні маркерів, локалізованих в гені ТН (посилання 6 та 7) Однак, аж до теперішнього часу, в літературі немає ніяких повідомлень про генетичну асоціацію з шизофренією Мікросателіт HUMTHO1 локалізований в першому інтроні гену тірозинпдроксилази Цей мікросателіт утворений тетрамерними ланками ТСАТ, які повторюються Він ВОЛОДІЄ деяким поліморфізмом, причому описані різні алелі, які мають число ланок, що змінюється та повторюється Найбільш часто зустрічається алель, який включає 10 ланок, які повторюються, та делецію пари основ в п'ятій ланці, яка повторюється і включає ПОСЛІДОВНІСТЬ CAT Заявник таким чином дослідив причетність гена ТН до шизофренії шляхом пошуку наявності змін ПОСЛІДОВНОСТІ та довжини в мікросателіті HUMTHO1 Отримані результати дозволяють показати, що повний алель досить рідко зустрічається і буває присутнім тільки у хворих на шизофренію Ці результати були відтворені на групах пацієнтів різного етнічного походження Так, у випадку групи французів з 239 суб'єктів, 94 із яких хворі на шизофренію, було визначено 6 різних алелей, що позначаються як А, В, С, D, Еі та Ер Ці різні алелі розрізняються між собою чотирма парами основ (одна повна ланка), за виключенням Заявник потім поширив це дослідження на іншу популяцію іншого етнічного походження Так, дослідження подібного зв'язку було проведено на групі із 88 жителів Тунісу Отримані результати показують, що частота різних алелей А - Е, які зустрічаються у досліджуваної групи жителів Тунісу, значно відрізняється від тої, яку спостерігали в групі французів (див Таблицю 1) Але, тільки 4 індивідуума виявилися носіями повного алеля Ер, причому, всі є пацієнтами хворими на шизофренію (1 параноідна шизофренія та 3 недиференційовані шизофренії), і форми в цьому випадку також є спорадичними формами Ці результати представляють собою першу демонстрацію зв'язку між ТН та шизофренією Вони ясно доводять, що повний алель Ер мікросателіта HUMTHO1 з ПОСЛІДОВНІСТЮ (ТСАТ)-іо може бути в значній мірі асоційований з шизофренією і тим самим являє собою генетичний інструмент для виявлення цього типу патології Специфічність зв'язку цього алеля з шизофренією, крім того, була доведена вивченням на групі із 100 пацієнтів, уражених спорадичним маніакально-депресивним психозом Наявність алелю Ер не було виявлено в жодного з цих пацієнтів Виявлення зв'язку між цим алелем та шизофренією надає багаточисленні можливості використання в діагностиці та терапії Таким чином, цей винахід зараз відкриває можливість діагностики шизофренії шляхом біологічного теста, а не тільки за рахунок КЛІНІЧНИХ аргументів Одним із обєктів цього винаходу більш конкретно є метод діагностики шизофренії, який полягає в виділенні наявності алеля Ер мікросателіта HUMTHO1 в гені ТН Цей метод може також застосовуватися для діаг 49827 ностики патолопй спектра шизофренш, таких, як особливо ШИЗОТІПІЯ, індивідууми з шизоідною конституцією, і т д Таким чином винахід дозволяє удосконалювати діагностичні критерії цих патолопй, які зараз мають тільки клінічну природу Крім того, винахід дозволяє також виявляти нахил до цього типу психічного розладу шляхом ідентифікації генетичної вразливості в групах пацієнтів, які є носіями цього алеля Ер 3 терапевтичної точки зору, винахід дозволяє переважно призначати більш відповідне медикаментозне лікування в залежності від типа шизофренії Підтверджуючи гіпотезу про причетність доспособу синтеза катехоламінів, винахід дозволяє застосовувати більш направлену терапію Крім того, якщо функціональні втручання за рахунок наявності алеля Ер кінцево не з'ясовані, то слід зауважити, що мікросателіт HUMTHO1 локалізований в першому інтроні гена ТН, ділянки, в якій показана альтернативна асоціація, яка приводить до 4 ізоформ ТН (посилання 8) Отже, можливо, що генетичні зміни в цій ДІЛЯНЦІ впливають на регуляцію експресії гена ТН і це пов'язано з появою шизофренії Згідно З першим аспектом, винахід, отже, відноситься до методу діагностики шизофренії, який відрізняється тим, що проводять визначення ш вітро на наявність алеля Ер мікросателіта HUMТНО1 в гені ТН Виявлення цього алеля, ПОСЛІДОВНОСТІ (ТСАТ)ю, є характеристикою деяких видів шизофренії Відсутність цього алеля не виключає наявності шизофренії, причому, цей алель зустрічається приблизно в 5% випадків Спосіб винаходу також може застосовуватися дня генетичної характеристики видів шизофренії та підтипу шизофренії Як зазначено вище, алель Ер, напевно, присутній в випадках спорадичних шизофренш Спосіб, згідно з винаходом, може, також, застосовуватися для виявлення схильності до шизофренії Згідно способу винаходу, визначення алелю Ер можливо здійснювати різними способами Із способів, що використовуються, можна переважно назвати секвенування, розділення на гелі або ще метод SSCP Що стосується секвенування, то може бути використаний будь який метод, відомий спеціалісту Особливо переважно використовувати автоматичний секвенатор ДНК Секвенування переважно виконувати на двониткових матрицях методом термінацм ланцюгів, використовуючи флуоресцентні праймери Відповідаючий цій ЦІЛІ набір являє собою набір для секвенування Taq Dye Primer Kit фірми Applied Biosystem (Applied Biosystem, Foster City CA) Секвенування мікросателіта HUMTHO1, або, біль конкретно, виділеного фрагменту, який несе цей мікросателіт, дозволяє прямо розпізнати алель, який є у пацієнта, і таким чином виявити присутність або відсутність апеля Ер в ПОСЛІДОВНОСТІ (ТСАТ)ю Отримані шляхом секвенування результати наведені, наприклад, на фіг 2 Способом виявлення алеля Ер, якому слід віддавати перевагу, є розділення на гелі Цей спосіб володіє тією перевагою, що дозволяє робити різницю між різними алелями в залежності від їх величини без необхідності секвенувати фрагменти ДНК Цей спосіб заснований на міграції, при умові денатурації, денатурованих фрагментів ДНК в ак ріламідному гелі (переважно 6%-ному) Появлення смуг може бути досягнуто будь-яким, відомим спеціалісту способом, який базується, наприклад, на застосуванні маркірованих праймерів (особливо в вигляду ]-32фосфора), на введення L dCTP в фрагменти що досліджуються, на використанні альфанерадюактивних зондів, на проявленні за допомогою етідіумброміда, або ще шляхом гібридизації (блотінг) з міченим радіоактивним ізотопом зондом Вищезазначена методика розділення на гелі в якості ілюстрації представлена в прикладах Як показано на фіг 3, цей спосіб дозволяє швидко і без секвенування робити ВІДМІННОСТІ МІЖ алелями А, В, С, D, Еі та Ер мікросателіта Що стосується способа ідентифікації за допомогою SSCP, то мова йде також про метод розділення на акриламідному гелі, але в неденатурованих умовах Цей спосіб дозволяє розрізняти різні фрагменти в залежності від їх конформації (див приклади) Спосіб згідно винаходу здійснюють на зразку ДНК пацієнта Цей зразок повинен вміщувати, хоча б, один мікросателіт HUMTHO1 Переважно він містить весь або частину першого інтрона гена ТН Ще більш переважно, він включає фрагмент гену ТН, який містить мікросателіт HUMTHO1 з фланкуючими послідовностями на кінцях Зразок ДНК, що досліджується може бути отриманий із відібраних у пацієнта клітин Мова йде переважно про клітини крові (наприклад, мононуклеарні клітини), які легко отримують простим взяттям крові для аналізу Можуть бути використані ІНШІ ТИПИ КЛІТИН, такі, як особливо фібробласти, епітеліальні клітини, кератиноцити і т п Потім із клітин екстрагують ДНК і використовують для визначення алелю Ер Для цього отримана геномна ДНК може бути перетравлена рестрикційними ферментами, тонована в ВІДПОВІДНИХ векторах, вибрана, наприклад, по ТН або шляхом гібридизації з ВІДПОВІДНИМ першому інтрону ТН зондом, потім проаналізована, як описано вище Особливо переважно виділена ДНК попередньо підлягає одній або декільком реакціям ампліфікації для того, щоб отримати значну КІЛЬКІСТЬ матеріалу, який відповідає ДІЛЯНЦІ, яка несе мікросателіт HUMTHO1 Ампліфікацію можливо проводити будь-яким, відомим спеціалісту способом, і особливо способом ланцюгової реакції (ПЛР), яка каталізується полімеразою (Saiki R К та ІНШІ, Science, 230, 1350-1354 (1985), Mulhs К В і Falona FA, Meth, Enzym , 155, 335-350 (1987)) 3 цією метою ампліфікацію можливо здійснювати при використанні "ДНК -термального циклера" (Perkm Elmer Cetus) згідно рекомендаціям виробника Умови температури та середовища, що використовуються для ампліфікації, являють собою звичайні умови, такі, як описані, наприклад, у Маmatis та інших, 1989 Специфічні умови також наведені в прикладах Для здійснення цього винаходу, віддають перевагу використанню фрагменту ДНК, який несе мікросателіт HUMTHO1 достатньо малих розмірів Це дозволяє переважно проводити різницю між алелями без необхідності проведення секвенування Крім того, якщо здійснюють контрольні досліди по секвенуванню, то також переважно секвенувати тільки фрагменти обмеженого розміру Переважно, фрагментом ДНК, що ви 49827 8 користовується, є ампліфікований фрагмент величиною меньше 300 пар основ Цей фрагмент містить мікросателіт HUMTHO1 і фланкуючі ПОСЛІДОВНОСТІ гена ТН, такі, як приведено на фіг 1 Ще більш переважно ампліфікований фрагмент включає менше 200 пар основ Особливо прекрасних результатів досягають з ампліфікованими фрагментами величиною менше 160 пар основ і навіть 100 пар основ 3 цією метою в цьому винаході також описуються специфічні праймери, які дозволяють проводити ампліфікацію ДНК маленьких розмірів, які несуть мікросателіт HUMTHO1 Так, в винаході описуються, зокрема, 3 пари праймерів, які дозволяють проводити, ВІДПОВІДНО, ампліфікацію фрагментів величиною 192 пари основ, 156 пар основ та 11 пар основ ПОСЛІДОВНІСТЬ ЦИХ праймерів наведена в прикладах, також, як ПОСЛІДОВНІСТЬ та положення в гені ТН ампліфікованого фрагменту Будь-який інший праймер, який дозволяє проводити ампліфікацію фрагмента величиною меншою 300 пар основ, який несе, принаймні, один мікросателіт HUMTHO1 і який містить франкуючу ділянку, що походить від наведеної на фіг 1 ПОСЛІДОВНОСТІ, також становить частину цього винаходу Переважно, праймери згідно винаходу мають довжину від десятимерів до сорокамерів та переважно 15 - 30-мерів ПОСЛІДОВНІСТЬ ЦИХ праймерів може бути визначена із ПОСЛІДОВНОСТІ, наведеної на фіг1, в залежності від величини ампліфікованого фрагменту, його локалізації навкруги мікросателітута вибраної довжини праймерів значено положення праймерів ампліфікації, фіг 2 Виявлення шляхом секвенування алеля Ер мікросателіта HUMTHO1, фіг 3 Виявлення шляхом розділення на гелі алеля Ер мікросателіта HUMTHO1 Таблиця 1 Розподіл алелей мікросателіта HUMTHO1 у людей, які досліджувалися, вражених або не вражених шизофренією Приклади 1 Отримання ДНК Зразки крові розміщують на гепарин і мононуклеарні клітини виділяють на градієнті Ficoll hypaque (Pharmacia, Upsala, Швеція) ДНК потім екстрагують стандартним способом Для прямої екстракції ДНК використовують наступну методику Зібрану кров виливають в пробірки МІСТКІСТЮ 50мл і добавляють лізуючий буфер для руйнування еритроцитів (лізуючий буфер 40мл ТР1С-НС1, 1н, рН-7,5 + 20мл 0,5М ЕДТУ + Н2О до загального обєму 2л), кінцевий об'єм становить 50мл Суспензію потім центрифугують на протязі 15 хвилин при температурі 4°С та швидкості 2500 обертів на хвилину, супернатант відкидають, до осаду після центрифугування знову добавляють 50мл лізуючого буфера Ту ж саму операцію (центрифугування, видалення супернатанта, обробка осаду після центрифугування лізуючим буфером) повторюють ДВІЧІ По закінченню цих трьох центрифугувань осад достають Праймери, що використовуються в межах винаходу, можуть бути синтезовані будь-яким, відомим фахівцю способом і особливо при використанні хімії фосфорамідів, можливо захищених в положенні (% цианоетильною групою (Sinha та ін , 1984, Giles, 1985), за допомогою автоматичного синтезатора ДНК, такого, як синтезатор фірми Applied Biosystem, модель 394 (Applied Biosystem, Foster City CA), згідно рекомендацій виробника Праймери можуть також бути марковані будь-яким відомим фахівцю способом Випробованим зразком ДНК може бути геномна ДНК, кДНК, або також РНК Більш переважно мова йде про продукт ампліфікації геномної ДНК, ампліфікованої за допомогою специфічних праймерів, таких, як описані вище ві), Іншим об'єктом цього винаходу є набір для визначення алеля Ер, який включає пару праймерів, таких, які зазначені вище Цей набір переважно являє собою набір для діагностики шизофренії Як зазначено вище, цей винахід, по-перше, відноситься до генетичного метода визначення та генетичної характеристики захворювань спектра шизофренії Крім зазначеного застосування для діагностики, цей метод також надає широкі терапевтичні можливості, пов'язані особливо з найкращою направленістю лікування в залежності від ВІДПОВІДНОГО лікування Цей винахід описується нижче більш докладно за допомогою нижченаведених прикладів, які потрібно розглядати як ілюстровані, але необмежуючі обсягу вимог Перелік фігур фіг 1 ПОСЛІДОВНІСТЬ частини першого інтрона гена ТН, яка включає мікросателіт HUMTHO1 За Після ЦЬОГО добавляють 5мл лізуючого буферу (на 5мл начальної кро125мкл 20%-ного лаурілсаркозілу, 50мкл протеїнази К (20нг/мл) Отриманий розчин перемішують і витримують на водяній бані на протязі ночі при температурі 55°С і при помішуванні На наступний ранок додають 2 об'єми 95%ного етилового спирту (якщо об'єм = 5мл, то кінцевий об'єм становить 15мл), потім розчин осаджують шляхом інверсії аж до утворення пластівців Потім ДНК витягують за допомогою піпетки Р 1000 (зі зрізаним конічним кінцем) і поміщають в пробірку об'ємом 5мл Після ЦЬОГО додають 80%-ний етиловий спирт і суміш помішують в холодильник На наступний ранок етиловий спирт замінюють, потім, ввечері, спирт видаляють, а пластівці залишають висихати (пробірку розміщують в перевернутому положенні на паперову хустинку) ДНК потім обробляють за допомогою ТЕ 1Х, в залежності від об'єму пластівців КІЛЬКІСТЬ ТЕ змінюється від 200мкл до 1мл Витримують всю сукупність на протязі ночі при температурі 37°С в апараті, який крутиться, потім концентрацію ДНК визначають шляхом спектрометрії 2 Французи Вивчають 94 пацієнта різного походження, уражених хронічною шизофренією (62 чоловіка та 32 жінки середнього віку 42 ± 12,3), включаючи 21 випадок родин Діагностику проводять згідно критерію DSM III (посилання 9), використовуючи данні із медичних таблиць та прямих відомостей (інтерв'ю) згідно французькому перекладу "Таблиці афективних розладів і шизофренічного турбування" (SADS - LA, посилання 10) Кожному пацієнту приписують КЛІНІЧНИЙ підтип згідно з описаною 10 49827 процедурою Вивчають 145 здорових людей, яких використовують для контролю (84 чоловіки та 61 жінка, середній вік 48 ± 8,3), які не мають ніяких психічних розладів 3 Жителі Тунісу Вивчають 44 пацієнта різного походження, уражених хронічною шизофренією (33 чоловіки та 11 жінок, середній вік 37 ± 8,2), включаючи 13 випадків родин Діагностику проводять згідно критерію DSM IIIR (посилання 11), використовуючи данні із медичних таблиць Цих пацієнтів порівнюють з 44 пацієнтами, яких використовують для контролю, не пов'язаних між собою (37 ЧОЛОВІКІВ та 7 жінок, середній вік 35 ± 5,9), які не мають ніяких психічних розладів 4 Праймери, які використовують для реакцій ампліфікації Призначена для реакції ампліфікації матриця утворена алелем Ер мікросателіта HUMTHO1, ПОСЛІДОВНІСТЬ якого являє собою (ТСАТ)4 (ТСА) (ТСАТ)5 Мікросателіт локалізований в положенні 1070 ПОСЛІДОВНОСТІ гена ТН, такої, як опублікована і доступна із банка генів (№ DOO269) Для ампліфікації за допомогою ПЛР використовують різні пари праймерів Ці пари представлені нижче, також, як розмір ампліфікованого фрагмента Положення цих праймерів в ПОСЛІДОВНОСТІ гена ТН представлено на фіг 1 (див ПОСЛІДОВНІСТЬ №1) Пара А 1) 5' GGC ААА TAG GGG GCA ААА 3' (змістовна) (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 1), і 2) 5' ТТА ТСС AGC CTG GCC САС 3 і (антизмістовна) (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 2) Передбачена довжина після ампліфікації становить 192 пари основ Пара Б 3) 5 GGC ААА TAG GGG GCA ААА 3' (змістовна) (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 3), і 4) 5 і GGC ТТС CGA GTG CAG GTC 3' (антизмістовна) (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 4) Передбачена довжина після ампліфікації становить 156 пар основ Пара В 5) 5' GTT ССТ ССС ТТА ТТТ ССС 3 і (змістовна) (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 5), і 6) 5 і AGG GAA САС AGA СТС CAT 3' (антизмістовна) (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 6) Передбачена довжина після ампліфікації становить 77 пар основ 5 Протокол реакцій ампліфікації Суміш, що використовувана для реакції ПЛР, містить 40нг геномної ДНК, отриманої згідно прикладу 1, по 200 ммоль кожного із наступних сполук аденозин-5'-трифосфата, цитидин-5'трифосфат, гуанозш-5'-трифосфат і тимідин-5' трифосфат, 18 пмоль (ЮОнг) кожного із праймерів, 50 ммоль КСІ, 10 ммоль ТРИС-НСІ (рН = 8,5), 1,5 ммоль хлориду магнію та 1,0мКи (І_- 32 Р)цитидин-5'-трифосфата (Amersham, UK) в кінцевому об'ємі 15мл Після початкової денатурації на протязі трьох хвилин при температурі 96°С додають 0,75 одиниць Taq-полімерази до кожного зразку (ДНК + суміш) при температурі 92°С, за цією стадією слідують ЗО циклів, які включають гібридизацію на протязі ЗО секунд при температурі 56°С, елонгацію на протязі ЗО секунд при температурі 72°С та денатурацію на протязі ЗО секунд при температурі 92°С 6 Розділення на гелі Три мікролітра продукта, отриманого в результаті реакції ПЛР, що змішані з 3 мікролітрами "термінуючого розчину" (0,025 бромфенолового синього і 0,025 ксилолцианолу, 0,95 формаміду деіонізованого) вносять в денатуруючий гель (6%ний, акриламід/бісакриламід у відношенні 19 1) Після електрофоретичної міграції (2500 вольт, 55мА) гель виймають з форми та висушують Його пакують в касету (без екранізуючого ампліфікатора) за допомогою плівки ХОМАТ (Кодак) для ауторадюграфм та експонують на протязі ночі при кімнатній температурі 7 Протокол реакції ПЛР - SSCP Цю реакцію проводять в декілька стадій згідно наступного протоколу 1 Ампліфікація шляхом ПЛР (полімеразна ланцюгова реакція) цільової ПОСЛІДОВНОСТІ ДНК (150 200 пар основ) з радіоактивною маркіровкою двох ниток (використання І_-32Р-АТФ) або однієї нитки (використання одного із праймерів 3j-32P-AT Один мілілітр продукта ПЛР змішують з 2,5мл робочого (завантажувального) буфера (80% деіонізованого формаміду, 50 ммоль тетраброметану, 1 ммоль етилендіамштетраоцтової кислоти (ЕДТО), 0,5% ксилол-цианолу, 0,5% бромфенолового синього) 2 Денатурація ДНК при 96°С на протязі 3 - 5 хвилин 3 Швидке охолодження зразків в кризі, яка розтає 4 Швидке внесення в неденатуруючий поліакриламідний гель (6%-ний акриламід/бісакриламід у відношеннях 37,5 1, 0,5Хтетраброметана) 5 Електрофоретична міграція при температурі 4°С та 50 ват або при кімнатній температурі і 10 ват (з 10% гліцерину в гелі) 6 Ауторадюграфія висушеного гелю Таблиця 1 Алель Контроль 8 54(18,6%) 54(18,6%) 38(13,1%) А (ТСАТ)є В Л~САТ)7 С (ТСАТ) 8 Алель Франція** Хворі 0 на шизофренію 40(21,3%) 43 (22,9%) 18(9,6%) Франція** Контроль 8 20 (22,7%) 20 (22,7%) 14(15,9%) Туніс Хворі 0 на шизофренію 18(20,5%) 20 (22,7%) 8(9,1%) Продовження таблиці 1 Туніс 49827 11 Контроль D (TCAT)9 Ei(TCAT)4CAT(TCAT)5 Ер (ТСАТЬо 8 52(17,9%) 92(31,8%) 0 (0%) 12 0 Хворі на шизофренію 23(12,2%) 58 (30,8%) 6** (3,2%) 0 Контроль 21 (23,9%) 13(14,8%) 0 (0%) (ХІ) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ (1) Загальна інформація (і) Заявник (A) Ім'я РОН-ПУЛЕНК РОРЕР С А (B) Вулиця 20, avenue Raymond ARON (C) Місто ANTONY (E) Держава FRANCE (F) Поштовий код 92165 (и) Назва винаходу СПОСІБ ДІАГНОСТИКИ ШИЗОФРЕНІЇ (їм) КІЛЬКІСТЬ послідовностей 7 (iv) Зчитувальна за комп'ютером форма (A) Тип носія Стрічка (B) Комп'ютер IBM PC сумісний (C) Операційна система PC-DOS/MS-DOS (D) Програмне забезпечення PatentIN Release #1 0, Версія #1 ЗО (ОЕВ) (2) Інформація для SEQ Ю № 1 (і) Характеристики ПОСЛІДОВНОСТІ (A) Довжина 18 пар основ (B) Тип нуклеотид (C) Ланцюг подвійний (D) Конфігурація лінійна (м) Тип молекули кДНК (їм) Гіпотетичність ні (iv) АНТИЗМІСТОВНІСТЬ ні (хі) Опис ПОСЛІДОВНОСТІ SEQ ID № 1 GGCAAATAGG GGGCAAAA (2) Інформація для SEQ ID № 2 (і) Характеристики ПОСЛІДОВНОСТІ (A) Довжина 18 пар основ (B) Тип нуклеотид (C) Ланцюг подвійний (D) Конфігурація лінійна (м) Тип молекули кДнк (їм) Гіпотетичність ні (iv) АНТИЗМІСТОВНІСТЬ НІ (ХІ) Опис ПОСЛІДОВНОСТІ SEQ ID № 2 TTATCCAGCC TGGCCCAC (2) Інформація для SEQ ID № З (і) Характеристики ПОСЛІДОВНОСТІ (A) Довжина 18 пар основ (B) Тип нуклеотид (C) Ланцюг подвійний (D) Конфігурація лінійна (м) Тип молекули кДнк (їм) Гіпотетичність ні (iv) АНТИЗМІСТОВНІСТЬ НІ Хворі на шизофренію 26 (29,5%) 12(13,6%) 4 (4,6%) 8 SEQ ID № З GGCAAATAGG GGGCAAAA (2) Інформація для SEQ ID № 4 (і) Характеристики ПОСЛІДОВНОСТІ (A) Довжина 18 пар основ (B) Тип нуклеотид (C) Ланцюг подвійний (D) Конфігурація лінійна (м) Тип молекули кДнк (їм) Гіпотетичність ні (iv) АНТИЗМІСТОВНІСТЬ НІ (ХІ) О П И С ПОСЛІДОВНОСТІ SEQ ID № 4 GGCTTCCGAG TGCAGGTC (2) Інформація для SEQ ID № 5 (і) Характеристики ПОСЛІДОВНОСТІ (A) Довжина 18 пар основ (B) Тип нуклеотид (C) Ланцюг подвійний (D) Конфігурація лінійна (м) Тип молекули кДнк (їм) Гіпотетичність ні (iv) АНТИЗМІСТОВНІСТЬ НІ (ХІ) О П И С ПОСЛІДОВНОСТІ SEQ ID № 5 G1TCCTCCCT ТАТТТССС (2) Інформація для SEQ ID № 6 (і) Характеристики ПОСЛІДОВНОСТІ (A) Довжина 18 пар основ (B) Тип нуклеотид (C) Ланцюг подвійний (D) Конфігурація лінійна (м) Тип молекули кДнк (їм) Гіпотетичність ні (iv) АНТИЗМІСТОВНІСТЬ НІ (ХІ) О П И С ПОСЛІДОВНОСТІ SEQ ID № 6 AGGGAACACA GACTCCAT (2) Інформація для SEQ ID № 7 (і) Характеристики ПОСЛІДОВНОСТІ (A) Довжина 636 пар основ (B) Тип нуклеотид (C) Ланцюг подвійний (D) Конфігурація лінійна (м) Тип молекули кДнк (їм) Гіпотетичність ні (iv) АНТИЗМІСТОВНІСТЬ НІ — (хі)-Опис послідовності: SEQ ID № 7: C T A T T A C A C G A G G A A A A C A C A A A T C A A G C A 60 TGACT A GT G AT T GAC AT CT C AAAC AGT G CG A G C C G C G T C C C G C C A C T C C C C T C C T C T C T T 120 G T C C G T CG A C A C C CC CA T C A CG C CG CC CCG C C A CG C T GC G A C C A C G CG CG TG G A G A C C A G 1 0 C CG T C CA T A C C C AC A C T C T C T G GG C G C CA G 8 C C T C A G T T G A C G T A G T G G G C T G C A T G G G A A 240 C TC C G CCA C G A CC T G G G G T C G G AAA G G CAA T C A G G A C G G T T G G G T C C T G C T T C T C T A T C C 300 T AA G T T T G CC G G T AT C AT G C G T C C C T T T C T C T C T C T C T C T C T C T C T C T C C A G A T T T T C C G 360 AT AT A T A T A T AT AT A T AT A C T GGCG GT C T T G C T C C C G A C C G G A A G G C G G G G C G C G A A T G G 420 A CG A T G AG C T T TCG G A T T T G C A G T G TAC G A G T T C G C A A G G G T T C G G C C T G G A T A A C T G G T 480 CTT A C C C G A G GCT G T C T CT G C CC G A CT G CC C T G A A T A A T G T T T T T T G C T G T G A T T G G G G T 540 CG CCTTAAG G T T A T A G A CT A T AAGG T T A TG T G A T T A T C A G A C T T A GA A A G C C C C C C T C C C 600 A CGGC TT C G T C TCC G GCCG G G C T C C GC T C C C C CC C T C CC C C C A G T C C T G C T C C A C T C C A CG CC C AC 636 CTTGAATCTT A C A C G A G G A A A A C A C A A A T C AGTG A T T GAC A T C T C AAAC A A A G C A A G C C G C G T C C C G C C A CCTACTCCCA GT GCG G TCC G T CG A C A C C CC C T C C T C T C T T C C A CG C TGCG A C C A C CG C CG CC CCG CCGT C CA T A C C C AC A G C G C G TG G A G A C C A G C C T C A G T T G A C T C T C T G GG C G C CA G C T C C G CCA C G C G T A G T G G G C TG1'3QGCAAATA GGGGGCAAAA T C A G G A CCT G G G G TC TAA G T 5 A C G G T T G G G T C C T G C T GTTCCTCCC TTATTTCCCT T T G CC G G T AT C AT G C CATTCATTCA TTCATTCATT CATTCATTCA TTCATTCACC ATGGAGTCTG TGTTCCCTSQT GACCTGCACT CGGAAGCC*CT G G A A G G C G G G GCCAGGCTGG ATAA2TCGGGA GCTTTTCAGC T TCG G A T T T G CAA GG G T TC G G CC TG G A T A A C T G G T CCG A G GCT G T C T CT G CCCGA C T G C C C T G A A T A A T G TTTTTATTTA T G C T G T G A T T C G C C T TAAG G G A CT A T AAGG GGGGT TG A T T ATC A G A CT T A G AAA G T T A TG A CGGC TT C G T C TCC G GCCG G C C CC C C T CC C C C CC C T C CC C CC A G T G C T C C GC T C C G C T C C A C T C C A CG CC CCT C AC ФІГ.1 15 А С G T 49827 А С 16 О Т • — Е —О —В • алель Е[ —А алель Еі Фіг. З Фіг. 2 ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна ( 0 4 4 ) 4 5 6 - 2 0 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71 Р