Спосіб визначення відсоткового вмісту дефектних векторів у контрольній векторній культурі, набір для використання у способі

1 Спосіб визначення відсоткового вмісту дефектних векторів у контрольній векторній культурі, у якій принаймні деякі вектори несуть ген-ефектор, який кодує продукт, що пригнічує ріст пухлинних клітин, індукує апоптоз пухлинних клітин або вбиває пухлинні клітини, який включає такі етапи а) контактування пухлинних клітин зі згаданою векторною культурою в умовах, що уможливлюють введення згаданої векторної культури у згадані клітини, б) інкубування згаданих пухлинних клітин в умовах, що уможливлюють зростання цих клітин, в) оцінювання росту пухлинних клітин через певний достатній період часу, г) зіставлення росту пухлинних клітин із ростом клітин, що контактували з однією або декількома стандартними тестовими культурами, до складу яких входять позитивні контрольні вектори, які несуть функціональний ефекторний ген, та негативні контрольні вектори, які не несуть функціонального ефекторного гена 2 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що згадані негативні контрольні вектори кодують індикаторний ген 3 Спосіб за п 2, який відрізняється тим, що згаданий індикаторний ген є геном люциферази 4 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що згаданими векторами є аденовірусний, ретровірусний, вісповий або аденоасоційований вірусні вектори 5 Спосіб за п 4, який відрізняється тим, що згаданими векторами є аденовірусні вектори 6 Спосіб за п 5, який відрізняється тим, що згадані аденовірусні вектори знаходяться в інфекційних аденовірусних частинках 7 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що згаданим геном-ефектором є пухл и нно-суп ресорний ген 8 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що згаданий ген-ефектор індукує апоптоз 9 Спосіб за п 7, який відрізняється тим, що згаданий пухл и нно-суп ресорний ген є геном р53 дикого типу 10 Спосіб за п 9, який відрізняється тим, що згаданими пухлинними клітинами є клітини раку легенів, товстої кишки, грудних залоз, підшлункової залози, передміхурової залози, голови та шиї, а також шкіри 11 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що межа виявлення дефектних векторів перевищує 0,05% 12 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що згадана межа виявлення дефектних векторів знаходиться між 0,05% та 10% 13 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що згаданий період часу складає від 2 до 10 днів 14 Спосіб за п 13, який відрізняється тим, що згаданий період часу складає від 3 до 5 днів 15 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що згадані стандартні тестові культури мають значення або декілька значень відсоткового вмісту негативних контрольних векторів, вибраних з групи, до складу якої входять 0%, 0,1%, 0,5%, 1,0%, 2,0%, 5,0%, 10%, 20% та 100% 16 Комплект для використання у способі згідно з будь-яким із пунктів 1-15, який включає до свого складу щонайменше два резервуари, що містять суміші стандартної тестової культури, до складу яких входять позитивні контрольні вектори та негативні контрольні вектори, і які характеризуються наперед визначеними відсотковими вмістами векторів кожного типу 17 Комплект за п 16, який відрізняється тим, що О ю 45492 згадані суміші стандартної тестової культури мають значення або декілька значень відсоткового вмісту негативних контрольних векторів, вибраних з групи, до складу якої входять 0,1%, 0,5%, 1,0%, 2,0%, 5,0%, 10%, та 20% 18 Комплект за п 16 або 17, який відрізняється тим, що негативні контрольні вектори несуть інди каторний ген 19 Комплект за п 18, який відрізняється тим, що згаданий індикаторний ген кодує люциферазу 20 Комплект за будь-яким із пп 16-19, який відрізняється тим, що згадані вектори є аденовірусними векторами Цей винахід, у цілому, має відношення до галузі якісного контролю рекомбінантних агентів, призначених для використання у генотерапм Точніше, цей винахід має відношення до тесту, який може бути використаний для визначення відсоткового вмісту дефективного вектору у векторній культурі, де вектор кодує терапевтичний ген Точніше, винахід має відношення до способу визначення відсоткового вмісту аденовірусу, до складу якого входить нефункційний ген р53, у аденовірусній культурі, до складу якої входить р53 дикого типу, яка може бути використана для клінічної генотерапм характеристики (Травалі та ІНШІ, 1990, Бішоп (Bishop), 1987) У процесі нормального росту клітин, як вважає дехто, прото-онкогени, стимулюючі ріст новоутворень, врівноважуються генами-супресорами, пригнічуючими їх ріст Деякі фактори спричиняють дисбаланс цих двох сил, що призводить до стану новоутворень Одним з таких факторів є мутації генів-супресорів пухлин (Вайнберг (Wemberg), 1991) Одним з важливих супресорів пухлин є клітинний білок, р53, котрий представляє собою ядровий фосфопротеш (53 кД), який контролює проліферацію клітин Точкові мутації гену р53 та втрата алелю на хромосомі 17р, де розмішено ген р53, відносяться до найбільш поширених змін, які ідентифікуються при розвитку злоякісних пухлин у людей Білок р53 надзвичайно добре зберігається у процесі еволюції і експресується у самих звичайних тканинах Показано, що р53 дикого типу залучено до контролю клітинного циклу (Мерсер (Mercer), 1992), регуляції транскрипції (Філдз (Fields) та ІНШІ, 1991) та індукування апоптозу (Йоніш-Роуч (Jomsh-Rouach) та ІНШІ, 1991, та Шоу Як відомо, методи лікування раку, які використовують зараз, у тому числі применена терапія, хірургія та хемотерапія, мають обмежену ефективність Тільки рак легенів, наприклад, кожного року забиває у Сполучених Штатах більше, ніж 140000 чоловік Нещодавно приведений у ВІДПОВІДНІСТЬ З ВІКОМ показник смертності від раку легенів у жінок перевищив ВІДПОВІДНИЙ показник для раку грудної залози Незважаючи нате, що ВІДПОВІДНІ програми знизили КІЛЬКІСТЬ тютюнопалільників, коефіцієнт смертності від раку легенів залишиться на високому рівні і у 21 сторіччі Раціональний розвиток нових терапевтичних методів лікування раку легенів буде залежати від розуміння цієї хвороби на молекулярному рівні (Shaw) та ІНШІ, 1992) Добре встановлено, що різновиди раку спричиняються, принаймні, частково, генетичними аномаліями, наслідком чого є або надмірна експресія одного або більшої КІЛЬКОСТІ генів, або ж експресія аномального або мутантного гену або генів Наприклад, у багатьох випадках, як відомо, наслідком експресії онкогенів є розвиток раку "Онкогенами" є генетичне змінені гени, продукт мутованої експресії котрих у певній мірі порушує нормальну функцію або контроль клітин (Спандідос Є знані різні мутантні алелі р53, у яких заміщення однієї основи призводить до синтезування білків, які мають змінені властивості регулювання росту, і, внаслідок цього, ведуть до розвитку злоякісних пухлин (Гольштеин (Hollstem) та ІНШІ 1991) Фактично, було встановлено, що ген р53 є найбільш поширеним мутованим геном при звичайних типах раку людини (Гольштеин та ІНШІ, 1991, Вайнберг, 1991), і особливо пов'язаний з тими пухлинами, що є наслідком сигаретного диму (Гольштеин та ІНШІ, 1991, Цакут-Хурі (Zakut-Houn) та ІНШІ, 1985) Задокументовано надмірну експресію мутованого р53 при пухлинах грудної залози (Кезі (Spandidos)Ta ІНШІ, 1989) (Casey) та ІНШІ, 1991) Встановлено, що багато онкогенів, вивчених до цього часу, "активізуються" внаслідок мутації, часто точкової мутації, у кодуючій ДІЛЯНЦІ нормального клітинного гену, знаного, як "протоонкоген" Наслідком цих мутацій є амінокислотні заміщення у експресованому білковому продукті Цей змінений експресований продукт демонструє аномальну біологічну функцію, яка вносить свій внесок у неопластичний процес (Траволі (Travoh) та ІНШІ, 1990) Мутації, які лежать у основі, можуть бути спричинені різними засобами, наприклад, ХІМІЧНИМ мутагенезом або іонізуючим випромінюванням Цілий ряд онкогенів та сімейств онкогенів, у тому числі ras, myc, neu, raf erb, src, fms, jun та abl, було ідентифіковано та у різній мірі вивчено їх Одним з найбільш цікавих аспектів генотерапм раку є використання генів-супресорів пухлин, таких, як р53 Сповіщали, що при трансфекцм р53 дикого типу до певних типів клітин раку грудної залози та легенів може відновлюватись контроль супресм новоутворень у ЛІНІЯХ клітин (Кезі та ІНШІ, 1992) Незважаючи на те, що безпосередня трансфекція ДНК не є ефективним засобом введення ДНК до клітин пацієнтів, ці результати демонструють, що введення супресорів пухлин до ракових клітин може бути ефективним методом лікування у разі розробки поліпшених засобів доставки генів-супресорів пухлин Зараз вивчаються та розробляються системи доставки генів, придатні для застосування у гемо 45492 терапії для супресм та забивання пухлин клітин, індукує апоптоз пухлинних клітин або забиває пухлинні клітини Спосіб включає наступні Особливий інтерес представляють носи генів етапи на вірусній основі внаслідок ефективності вірусів при інфікуванні реальних живих клітин, тобто у а) контактування пухлинних клітин з векторною процесі, у ході якого сам вірусний генетичний макультурою в умовах, які дозволяють введення вектеріал переноситься до клітини-мішені Деякий торів до пухлинних клітин, прогрес у цьому відношенні було досягнуто, нав) інкубування пухлинних клітин в умовах, які приклад, у створенні ретровірусних векторів, придозволяють ріст клітин, датних для доставки цілої низки генів Одновірусні c) оцінка росту пухлинних клітин через достатвекторні системи було нещодавно вдало викорисній період часу, тано у деяких експериментах по переносу генів in d) співставлення росту пухлинних клітин з росvitro та на тваринах том клітин при їх контакті з однією або більшою КІЛЬКІСТЮ еталонних стандартних культур, до склаОскільки способи та композиції для генотерапм ду яких входять позитивні контрольні вектори, які раку удосконалюються, стає можливим клінічне несуть функційний ефекторний ген, та негативні лікування Це потребує великомасштабного проконтрольні вектори, які не несуть функційного дукування векторних культур Таке великомасштаефекторного гену бне виробництво залучає виготовлення великого об'єму контрольної векторної культури з "піонерсьТаким чином, взагалі кажучі, перший аспект кої" векторної культури, яка довільно позначаєтьцього винаходу включає контактування пухлинних ся, як така, що має 100% активність Виникає заклітин з векторною культурою за умов, які дозвоклопотаність відносно втрати активності при ляють включення векторної культури до пухлинних згаданому "масштабуванні" Зрозуміло, що контклітин До складу векторної культури може входирольний аналіз якості контрольних векторних ти вірюн або плазміда, які будуть інфікувати певні культур буде обов'язковим етапом, перед тим, як пухлинні клітини, що викликають інтерес, за умов, буде вироблено будь-який лікувальний режим достатніх для забезпечення подібного інфікування Наприклад, виникне необхідність утому, щоб конДо складу векторів входять різні регуляторні елетрольна векторна культура містила достатню КІЛЬменти типу стимуляторів та/або генівКІСТЬ активних векторів, щоб опосередкувати бапідсилювачів До складу культури може входити жаний терапевтичний ефект від 0 до 100% функційних ефекторних генів Специфічні приклади таких векторних культур вклюВажливі застереження було вказано комітетом чають, але не обмежуються, вірусні вектори, такі, експертів по рекомбінантних ДНК (RAC) Націонаяк аденовірус, ретровірус, вірус осповакцини або льного інституту здоров'я (NIH) (США) та Управаденоасоційований вірус Пухлинні клітини, які лінням по контролю за якістю їстівних продуктів, піддаються контакту, відіграють роль мішені, яка медикаментів та косметичних засобів (FDA) віднопідлягає інфікуванню певною векторною культусно біологічного значення цих мутацій у кінцевій рою, яка використовується для кожного певного КЛІНІЧНІЙ культурі Малоймовірно, щоб такі мутанттесту Прикладами пухлинних клітин, яким надані вектори являли будь-який ризик для пацієнту ється перевага, є клітини раку легенів, товстої киабо людей, які контактують з цим пацієнтом, але шки, грудної залози, підшлункової залози, простазаконодавчі комітети будуть вимагати контрольноти, голови та шиї, а також шкіри го аналізу якості КЛІНІЧНИХ векторних препаратів NIH RAC вказав на те, що найважливішим аспекУ, переважному варіанті втілення, цей винахід том контролю якості є біологічна функція Таким забезпечує, щоб вектори еталонної стандартної чином, існує необхідність-у-тесті для визначення культури, що не має функційного ефекторного відсоткового вмісту дефектних векторів у векторгену, наприклад, негативні контрольні вектори, них культурах для терапевтичного використання кодували ген люциферази Індикаторним геном є той ген, що надає підтвердження свого вдалого Залишається, таким чином, явна необхідність включення до гену Наприклад, у варіанті втілення розробки контрольного тесту якості для визначенцього винаходу, якому надається особлива переня КІЛЬКОСТІ дефективних або терапевтичне пасиввага, індикаторним геном, який використовується, них векторів у КЛІНІЧНІЙ векторній культурі та одноє ген люциферази, який надає візуальне підтверчасної втрати біологічної активності КЛІНІЧНИМИ дження свого включення Умови, достатні для завекторними культурами безпечення інфікування пухлинних клітин векторЦей винахід адресовано вищезгаданій потребі ною культурою, змінюються в залежності від наданням тесту для визначення якості векторних конкретних пухлинних клітин та векторів, які викопрепаратів для терапевтичного використання ристовують для постановки тесту Подібні умови є Безпосередньо, розкривають спосіб визначення добре знані у цій галузі відсоткового вмісту дефективних або терапевтичне пасивних векторів у контрольній векторній кульУ цілому, другий аспект цього винаходу вклютурі Передбачається, що спосіб цього винаходу чає індукування пухлинних клітин за умов, які заможе бути використаний для КІЛЬКІСНОГО визначенбезпечують ріст клітин Достатній час інкубування ня втрати біологічної активності різними терапевзмінюється в залежності від конкретної пухлинної тичними векторними препаратами клітини та комбінації векторної культури, яка підлягає визначенню Переважний період, достатній У загальному втіленні, цей винахід надає сподля забезпечення росту пухлинних клітин, складає сіб визначення відсоткового вмісту дефективних від 2 до 10 днів У варіанті втілення, якому надавекторів у векторній культурі, яка є генетичне скоється перевага, з використанням аденовірусної нструйована таким чином, щоб до її складу входив векторної культури та пухлинних клітин SAOS-LM ефекторний ген, який пригнічує ріст пухлинних 45492 (Американська колекція типових культур, Роквіл, штат Меріленд), для достатнього пригнічення росту достатнім виявляється від 3 до 5 днів Взагалі кажучи, третій аспект цього винаходу включає оцінку росту пухлинних клітин через достатній проміжок часу Ріст може оцінюватися за допомогою способів підрахування клітин, добре знаних у цій галузі І, нарешті, четвертий аспект цього винаходу, у цілому, включає порівняння росту пухлинних клітин, інфікованих векторною культурою, зі стандартними контрольними культурами, до складу яких входять вектори, які включають знану КІЛЬКІСТЬ векторів, які несуть функційні ефекторні гени, тобто позитивні контрольні вектори, та негативні контрольні вектори Функційний ефекторний ген відноситься до терапевтичного гену, який, теоретично, складає деяку частину векторної культури, яка використовується До подібних ефекторних генів належать гени-супресори пухлин, десенсибілізуючі генно-інженерні конструкції та токсини У більш переважному варіанті втілення, цей винахід передбачає, що згаданими векторами є аденовірусні вектори Далі, ці аденовірусні вектори можуть входити до складу інфекційних аденовірусних часток У іншому переважному варіанті втілення терапевтичним ефекторним геном, який вибирають для включення до вектору, є супресор пухлин Особливо ефективним геном-ефектором є ген р53 дикого типу У ще іншому переважному варіанті, відсотковий вміст дефективних векторів, які виявляються, і який має статистичне значення, складає від 0,05 до 10% ВІДПОВІДНО ДО найбільш переважного варіанту втілення, відсотковий вміст дефективних векторів, які виявляються, і який має статистичне значення, складне більш, ніж 0,05% Ще один варіант втілення цього винаходу надає набір, до складу якого входить, принаймні, одна судина, яка вміщує еталонну стандартну культуру Еталонна стандартна культура або культури, які входять до складу набору, мають знаний відсотковий вміст дефективних векторних сумішей У переважному варіанті втілення дефективну векторну суміш або суміші виготовлено з вектору, який включає ген люциферази У наступному переважному варіанті втілення набір може також включати судину, яка вміщує функційний генефектор У переважному варіанті втілення функційним геном-ефектором є ген-супресор пухлин р53 дикого типу У найбільш переважному втіленні до набору входять судини з сумішами еталонних стандартних культур, які вміщують векторні препарати, що кодують індикаторні гени з відсотковим вмістом 0%, 0,1%, 0,5%, 1,0%, 2,0%, 5,0%, 10%, 20% та 100% Фіг 1 Криві росту клітин SAOS-LM після інкубування з середовищем Adp53 та Adp53, до складу якого входять різні об'єми Adluc Кожна точка представляє середнє зі стандартним відхиленням для трьох чашок Фіг 2 Розклад кривих росту з Фіг 1 Кожна точка представляє середнє зі стандартним відхиленням для трьох чашок 8 Генотерапія стає життєспроможним підходом у лікуванні раку Оскільки проблеми з цільовою специфічністю, переносом та рівнями експресії вирішуються, терапевтичні генні конструкції стають звичайним засобом лікування неопластичних захворювань Оцінка векторних культур для використання у генотерапм буде необхідна як з міркувань безпеки, так і ефективності Молекулярні засоби для аналізу векторних культур на цей час непрактичні, внаслідок цього, надію треба покладати на біологічну функцію Одним з шляхів стандартизування біологічної функції є продукування еталонних стандартних культур терапевтичного вектору, які симулюють біологічну активність векторних культур, які мають різний відсотковий вміст дефективних векторів Потенційною загрозою є створення дефективних векторів, до складу яких входять мутовані терапевтичні гени, з метою стандартизування оціночних тестів Наприклад, мутований ген р53 може бути потенційно шкідливим У зв'язку з цим було розроблено теста для визначення відсоткового вмісту дефективного вектору у контрольній векторній культурі, у якій, замість дефективного вектору, використовується його замінник ВІДПОВІДНО ДО ЦЬОГО винаходу, надається тест, за допомогою якого визначається послаблення функції культури вектору дикого типу з використанням дефективного вектору Цей дефективний вектор представляє собою вектор, який втратив функцію під час виготовлення векторної культури У своїй найосновнішій формі дефективний вектор є просто вектором без будь-якого встановленого терапевтичного гену, однак він може також включати пасивний або мутований терапевтичний ген Дефективний вектор не має терапевтичного ефекту по відношенню до пухлинних клітин, оскільки він не експресує терапевтичного гену 3 метою імітування існування дефективного вектору можна змішувати знаний дефективний вектор, наприклад, негативний контрольний вектор, з культурами вектору-ефектору дикого типу, наприклад, позитивних контрольних векторів У кращому прикладі, такий негативний контрольний вектор експресує індикаторний ген, наприклад - ген люциферази (Adluc) Aduc виконує роль індикатору відсоткового вмісту дефективного вектору у еталонній культурі Вектори Вектори, які можуть перевірятися за допомогою розкритих тестів, можуть значно відрізнятися Цими векторами можуть бути стандартні вектори експреси, до складу яких входить один або більше генів-ефекторів та регуляторні елементи, необхідні для експресії гену ефектору у клітинах До складу регуляторних елементів може входити, принаймні, стимулятор, і вони, крім того, можуть включати структури, які підсилюють транскрипцію гену-ефектору (гени-підсилювачі) Регуляторні елементи можуть включати структури, які надають змогу експресування ефектору у обмеженому класі клітин (клітинно-специфічні стимулятори) При використанні стандартних експресивних векторів, можна використовувати різні способи їх введення до клітин Наприклад, вектори можуть бути шкапсульованими до ліпосом, кон'югованими з цілеспрямовуючими агентами, прикріпленими до 45492 мікрочастинок або модифікованими іншими шляхами для захоплення або введення до клітинмішеней Передбачається також, що у деяких випадках "оголена" ДНК може транспортуватися через КЛІТИННІ мембрани у об'ємах, достатніх для використання у генотерапм Незалежно від обраного механізму переносу або форми вектору, у тесті, призначеному для випробування активності векторної культури, буде використано цей механізм Ще однією формою вектору є вірусний вектор Вірусні вектори було розроблено з великої КІЛЬКОСТІ різних вірусних систем, у тому числі з аденовірусу, герпесвірусу, ретровірусу, вірусу вісповакцини та аденоасоційованого вірусу Ці вектори мають дві переваги у порівнянні зі стандартними векторами експресії По-перше, ці вектори можуть конструюватися таким чином, щоб вони могли розмножуватися та шкапсулюватися, як інфекційновірусна ДНК Це надає спроможність використовувати нормальні системи цілеспрямування та входу вірусу У додаток до цього, регуляторні елементи вірусу часто виявляються сумісними з механізмом експресії гену тих клітин, які вони інфікують Звичайно, як діапазон хазяїв, так і регуляторні елементи можна модифікувати у ВІДПОВІДНОСТІ ДО конкретної мети Ген-ефектор Геном-ефектором, закодованим вектором, може бути будь-який ген, який надає пухлинній КЛІТИНІ деяку біологічну активність, яка може бути виявлена Як правило, цією активністю є пригнічення росту, стимулювання запрограмованої загибелі клітини (апоптоз) або безпосереднє вбивство клітини РІЗНІ гени-ефектори посідають одну або декілька з цих активностей Наприклад, деякі гени-супресори пухлин пригнічують ріст пухлинних клітин, у той час як ІНШІ ВІДНОВЛЮЮТЬ нор мально запрограмовану загибель клітин р53 є класичним прикладом супрссора пухлин До інших супресорів пухлин належать RB, АРС, DCC, NF-1, NF-2, WT-1, MEN-1, MEN-11, BRCA1, VHL, FCC та МСС Онкогени є придатними мішенями для десенсибілізуючих генно-інженерних конструкцій і включають ras, myc, neu, raf, erb, sre, fms, jun, irk, ret, gsp, hsi, bcl та abl Токсинні гени або гени, які блокують основні функції клітин, можуть пригнічувати ріст пухлинних клітин або безпосередньо забивати клітини До токсинів належать токсин холери, токсин коклюшу, токсин дифтерії,, токсин стовбняку, рицин, ендотоксин Гени, які роблять клітину чутливою до зовнішнього агенту, наприклад, клітко во-поверхневого антигену або тимідинкінози, також забезпечують вбивство клітин Клітини Теоретично, будь-яка пухлинна клітина повинна бути піддана аналізу подібного сорту Звичайно, пухлина повинна бути сприйнятливою до того гену-ефектору, який використовується Для токсинів або генів, які роблять клітини чутливими до зовнішнього агенту, придатними є майже будь-які клітини Десенсибілізуючі генно-інженерні конструкції та супресор пухлин повинні тестуватися з визначеними пухлинами для оцінки сприйнятливості Прикладом клітин, які будуть сприйнятливі до лікування супресором пухлин р53, є клітини пухлин легенів, грудних залоз, товстої кишки, голови / шиї, підшлункової залози, остеосаркоми та 10 простати Умови проведення тесту Умови проведення тесту кожного разу змінюються Наприклад, умови та час інкубування підданих обробці клітин будуть змінюватися у залежності від конкретного тесту Там, де показником тесту с ріст клітин, умови та період часу будуть змінюватися у залежності від потреб залучених клітин Там, де показником тесту є загибель клітин, умови та період часу будуть залежати від умов та часу, необхідних для того, щоб ген-ефектор забив клітини Для інших активностей ефектору, наприклад, росту у м'якому агарі або створення колоній, прийнятні умови, періоди часу та додаткові обробки будуть зрозумілими для досвідченого фахівця Чутливість Контрольна векторна культура містить у собі мільйони, інколи, трильйони векторів Тест, заснований на біологічній активності, має обмежену спроможність до ідентифікування дефективних векторів, відсотковий вміст яких дуже малий Порогова величина статистичне значимих результатів буде змінюватись у залежності від конкретного виду вектору, пухлинних клітин, які піддано обробці та показника тесту Досвідчені фахівці зможуть визначити поріг чутливості тесту простим утворенням серії еталонних стандартних культур Наприклад, можна змішати у різних відсоткових співвідношеннях негативний контрольний вектор з позитивним контрольним вектором (наприклад, зразком піонерської векторної культури), довільно позначеним, як такий, що має 100% активність Активність, звичайно, визначається відносно до генно-інженерної конструкції вектор-гену, яка піддається тестуванню Наприклад, 100% активність позитивної контрольної культури можна визначати з точки зору змінного степеню загибелі пухлинних клітин, пригнічення росту, апоптозу, або ж з точки зору експресування закодованого гену З деякою відсотковою долею негативного контрольного вектору, доданою до позитивної контрольної культури, з'явиться статистично значима різниця між поведінкою (ріст, забиття тощо) клітин, підданих обробці позитивною контрольною культурою, та різними сумішами позитивних-негативних стандартних культур Ця мінімальна статистично значима різниця є рівнем чутливості тесту Набори Є необхідність створити набори для конкретних векторних систем, до складу яких сходив би, принаймні, негативний контрольний вектор У типовому випадку, ці негативні контрольні вектори будуть кодувати ген-маркер, наприклад, люциферазу, що дозволить користувачу контролювати КІЛЬКІСТЬ негативного контрольного вектору, який знаходиться у еталонній векторній культурі До складу таких наборів можуть входити також піддони або чашки, придатні для культування клітин, буферні розчини для розведення та камери, клітини для культивування негативного контрольного вектору, середовища та інструкції Аденовірус - р53 У переважному варіанті втілення, тест є призначений для визначення пухлино-супресивної активності генно-інженерної конструкції аденовірус - р53 (Adp53) Частоту мутацій вірусних векторів не задокументовано, частота помилок аденовірусної ДНК-полімерози, як гада 11 45492 12 ють, не перевищує ВІДПОВІДНОГО показника у ДНККлітини інфікували множинністю зараження 50 1 полімерози ссавців Таким чином, можливо, що у До складу груп входили піонерська культура 10 препараті 10 аденовірусних частинок може бути Adp53, культура Adp53, до складу якої входило 4 10 копій аденовірусу, що експресує пасивний або 0,1%, 0,5%, 1%, 5%, 10% та 20% Adluc (реконструмутантний р53 йовані позитивні контролі), та еталонна партія Adp53 Всі групи було виготовлено з 3 повторами Ідентифікація мутантних векторів за допомоКлітини підраховували щоденно (2 підрахунки в гою молекулярних засобів, наприклад, PCR™, є день) впродовж 5 днів, експеримент провели тричі непрактичною і недостатньою для цієї мети Більш того, оскільки тесту для трансформації клітин, Результати представлено на Фіг 1 та Фіг 2 опосередкованої самим мутантним р53, немає, Фіг 1 показує глибоке пригнічення клітин SAOS було б необхідно розробити тест для виявлення піонерською культурою Adp53 і слабкіше пригнікооперативного явища за допомогою іншою онкочення у разі додавання дефективного вектору гену, наприклад, ras(2) Такі тести важко піддаютьСтатистично значимі та відтворювані різниці можся кількісному визначенню Далі, багато клітин не на було вимірювати на 3 день тесту Вони стали відповідають на подібну комбінацію генів Окрім більш наглядними на 5 день На Фіг 2, наприклад, того, для тесту цього типу буде необхідно викорипоказано, що на 3 день середня КІЛЬКІСТЬ КЛІТИН стовувати мутантний вектор р53, як позитивний дорівнювала 25 ± 4(± середнє відхилення) у разі контроль Це було заборонено RAC у зв'язку з його піонерської культури Adp53, а для Adp53, з 1% потенційною небезпекою дефективного вектору середня КІЛЬКІСТЬ клітин дорівнювала 36 ± 4 Ця різниця є суттєвою на рівні Зокрема, тест співставляє активність піонерсьр < 0,02 Межа чутливості тесту дорівнює 1%, оскікої культури вектору Adp53 з активністю новоутвольки різниця при 0,5% то 0,1% дефективного векрених контрольних культур Піонерська культура тору не мають статистичної значимості Таким Adp53 визначається, як культури, що опосередкочином, присутність 1% дефективного вектору у вує загибель 100% клітин SAOS (ЛІНІЯ КЛІТИН ОСпрепараті є біологічно суттєвою та відтворюваною теосаркоми людини з гомозиготною делецією р53) за допомогою цього тесту при множинності зараження 50 1 на 5 день культивування Такі піонерські культури ліквідують пуНа довершення, наслідком розробки біологічхлини in vivo на ортотопних моделях ракових пухного стандарту у поєднанні з замісником мутантнолин легенів людини на "голих" мишах (Фуджівара го вектору р53 стало створення чутливого біотесту (Fujiwara) та ІНШІ, 1994, Жанг (Zhang) та ІНШІ, на неактивний вектор Суміші та способи цього 1993) Шляхом додавання зростаючої КІЛЬКОСТІ винаходу описано з точки зору найкращих варіандефективного вектору до піонерської культури тів втілення, у той час, як досвідченим фахівцям у (тобто, культури позитивного контрольного вектоцій галузі зрозуміла можливість внесення змін до ру), можливо імітувати контрольну культуру з різсумішей, способів та етапів або ПОСЛІДОВНОСТІ етаним вмістом дефективної Adp53 Контрольна пів описаного способу, відступаючи від концепції, Adp53 після цього тестується на спроможність задуху та обсягу цього винаходу Зокрема, зрозуміло бивання клітин SAOS впродовж 5 днів і крива ростакож, що згадані тут агенти можна замінити певту порівнюється з кривими, утвореними контрольними агентами, спорідненими у хімічному та фізіоними культурами з різним відсотковим вмістом логічному відношеннях, з досягненням таких же дефективного вектору самих або подібних результатів Усі подібні заміщення та модифікації, зрозумілі досвідченим фахіПриклад Визначення відсоткового вмісту девцям, повинні відбуватися у дусі, об'ємі та рамках фективного вектора у контрольній партії Adp53 концепції цього винаходу, у ВІДПОВІДНОСТІ З визнааденовірусної векторної культури ченням пунктами формули, яка додається Клітини SAOS-LM (варіант клітин SAOS - леге6 неві метастази) висівали на чашку (10 клітин х Подальш згаданий матеріал, у тій мірі, у якій 60мм) для культивування мікроорганізмів Після він надає прикладові методичні та ІНШІ подробиці, цього чашки шкубували впродовж ночі при 37°С додаткові до викладеного раніш, включено до цьоКлітини підраховували до інкубування вірусом го опису, як додатковий 45492 13 14 600 2 3 4 ДНІ Фіг. 1 ДНІ Фіг. 2 ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна (044)456-20- 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71